Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek
dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard
Mezőgazda Kiadó
A fás szárú növények (szőlő, gyümölcs) gazdasági jelentősége igen nagy. A vírus és fitoplazma eredetű betegségek a gyümölcstermesztést és szőlőtermesztést súlyosan veszélyeztetik (Németh, 1979, 1986; Lehoczky, 1992). Az ellenük való védekezés egyetlen módja a vírusmentes szaporítóanyag előállítása, ill. használata (Kiss, 1998).
A fás szárú növények virológiai tesztelése és vírusmentesítése eltér a lágy szárú növények vizsgálatától, ezért ezzel külön fejezetben foglalkozunk (Lehoczky és Beczner, 1980; Lehoczky, 1981; Németh és Kölber, 1998; Lázár, 1998; Voigt és Kállay, 1998).
A vírusok és más oltással átvihető fertőző kórokozók (viroidok, fitoplazmák) a szőlő termesztett fajtáinak jelentős mértékű – az egyes vírusoktól és a fertőzöttség mértékétől függően évenként 10–80%-os – leromlását okozzák (Lehoczky, 1992; Lázár, 1998). A termesztés számos területén jelentkezhetnek a vírusbetegségek gazdasági következményei, amelyek a fokozatos tőkeleromlásban és -elhalásban, a hozam csökkenésében, a minőség gyengülésében, a tőkék produktív időszakának megrövidülésében, az oltványkészítés eredményességének csökkenésében, a szaporítóanyag gyökeresedőképességének romlásában, a beteg tőkék környezeti tényezőkkel szembeni ellenálló képességének csökkenésében nyilvánulnak meg.
A szőlőtermesztő államok, így hazánk is, kidolgozta a szőlő növény-egészségügyi vizsgálatának programját, amely tartalmazza a szőlő virológiai szűrését (ellenőrzését) is (51. ábra).
![A szőlő virológiai ellenőrzésének rendszere [Lázár János szívessége folytán]](kepek/051-nvir.jpg)
A tesztelésre kijelölt tőkék előszűrését mechanikai vírusátvitellel lágy szárú tesztnövényeken kell elvégezni (Lázár, 1996). Ez a tevékenység egész évben végezhető, amennyiben a nyári időszakban az üvegház hőmérséklete nem haladja meg a 25 °C-ot. A téli időszakban vizsgálatba vont fajta, ill. klón ellenőrzése hajtatott dugványainak leveleiből történik. Az április–május hónapban (virágzásig) a szabadban fakadó tőkék hajtáscsúcsi (vitorla alatti 3–4. levél), ill. később a hónalj levelei a legalkalmasabbak a vizsgálatokra.
A tesztelés menete
A levélminta felületi fertőtlenítése 2%-os NaOH-val és folyóvizes öblítéssel.
A minta homogenizálása grammonként 3 ml 0,067 M-os foszfát-puffer (pH 7,2) és 3%-os polietilén-glikol (PEG 6000) hozzáadásával.
A lágy szárú tesztnövények (Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Cucumis sativus cv. Delicatess, Gomphrena globosa, Nicotiana clevelandii, N. glutinosa, N. tabacum cv. Samsun, Phaseolus vulgaris cv. Beautiful) inokulálása, majd leöblítése vízzel.
A tünetek folyamatos értékelése.
Megjegyzés: a fás szárú növényekben előforduló inhibítorok (gátlóanyagok, amelyek megnehezítik vagy megakadályozzák a vírusátvitelt) semlegesítésére ajánlott a koffein (1–3% w/v), a tojásalbumin (0,3–1,0% w/v), a nikotin (1–2% w/v) és a 0,01 M, foszfát-puffer pH 7,0 (Dijkstra és De Jager, 1998).
A szőlő fás szárú növényeken történő tesztelése lehetőséget ad a fertőzöttség vagy a vírusmentesség megállapítására. E tesztelési módszer alapja az egyes szőlőfajták (indikátorok) fokozott érzékenysége, ami jól látható elváltozásokban (levéldeformáció, mozaik, törpe növés) nyilvánul meg. A szőlőfajták virológiai ellenőrzéséhez a tesztelésre kerülő fajták tőkéit a törzsültetvények vizuális szelekciójával jelölik ki. A szelekciót két alkalommal, június elején-közepén (virágzás) és szeptember közepén-végén (érés) kell végezni.
A szőlő vírusbetegségeinek kimutatásához 9 indikátorfajtát (17. táblázat) használnak 5 ismétlésben. A vizsgálatba vont tőke vesszőiből az összehasonlító ellenőrzéshez 5 db kontrollnövény beállítása is szükséges.
17. táblázat - A magyar vírusellenőrzési rendszerben használt fás szárú indikátorokkal kimutatható szőlőpatogén vírusok1
Fás szárú indikátorok | Vírusok |
Siegfriedrebe (FS 4 201-39) | Szőlő fertőző leromlás vírus Arabis mozaik vírus Paradicsom fekete gyűrűs Szőlő bulgáriai látens vírus |
Vitis rupestris cv. St. George | Paradicsom fekete gyűrűs vírus Szőlő fertőző leromlás vírus Szőlő foltosság vírus Arabis mozaik vírus Szőlő faszöveti barázdáltság vírus |
Vitis vinifera cv. Pinot noir (és egyéb vörös fajták) | Szőlő levélsodródás vírus Szőlő króm mozaik vírus Arabis mozaik vírus Paradicsom fekete gyűrűs vírus Lucerna mozaik vírus |
Vitis vinifera cv. Chardonnay | Szőlő fertőző leromlás vírus Lucerna mozaik vírus Paradicsom fekete gyűrűs vírus |
Vitis riparia cv. Glorie de Monpellier | Szőlő érmenti mozaik vírus Szőlő bulgáriai látens vírus |
Vitis vinifera cv. Jubileum 75 | Szőlő króm mozaik vírus Szőlő vonalas mintázottság vírus |
Kober 5BB (V. berlandieri x V. riparia) | Szőlő faszöveti barázdáltság vírus |
LN 33 (Couderc 1613 x V. berlandieri) | Szőlő parakérgűség vírus Szőlő enációs vírus Szőlő faszöveti barázdáltság vírus |
110 R (V. rupestris x V. berlandieri) | Szőlő érnekrózis víru |
1 A szőlővírusokkal kapcsolatos hazai információk Martelli és Lehoczky (1968), Lehoczky és Beczner (1980), Beczner és Lehoczky (1981), Lehoczky et al. (1984), Lehoczky és Burgyán (1986) és Lehoczky (1992) munkáiban találhatók meg. Köszönettel tartozom néhány adat rendelkezésre bocsátásáért dr. Kobza Sándornak (Budapest).
A tesztelés menete
A tesztelésre kerülő tőkék és az indikátorfajták beérett vesszőinek begyűjtése.
A vesszők előkészítése 24 órás, vízben történő áztatással, majd 5 órán keresztül 0,5%-os Solvochin Extra-kezeléssel.
Téli tárolás hűtőtárolóban, 1–2 °C-on.
Tavasszal az indikátorfajták vesszőinek előkészítése: 2 rügyes dugványok vágása, alsó rügy „kivakítása”. Az alsó rügy alatt 0,5–1 cm-rel kell „megtalpalni” a vesszőt, a felső rügy felett 2–3 cm-es csonkot kell hagyni.
A kétrügyes (indikátor) dugványvessző felső, ép rügye alatt 0,5–1 cm-re egy 12–15 mm hosszú metszlapot kell készíteni.
A vizsgálandó tőke vesszőjéről az indikátorfajtával megegyező pozícióból történő, az arról leválasztott metszlappal azonos méretű szövetpajzs készítése.
A szövetpajzs rugalmas fóliával történő rögzítése az indikátor dugványvesszőhöz.
A dugványok gyökereztető közegbe (fóliakonténerbe) helyezése.
A dugványok hajtatása üvegházban, növényasztalon, talpmeleg biztosításával.
A 4–6 lombleveles, begyökeresedett dugványok kiültetése szabadföldi iskolába.
A kísérlet értékelése két éven keresztül, évente két alkalommal.
A vírusmentes szaporítóanyag az alapja a versenyképes, jó minőségű termés előállításának. A fejlett gyümölcstermesztő országokban – köztük hazánkban is – már több évtizede kialakítottak olyan központosított, zárt vírusmentesítési rendszereket, ahol teljes koordinációban történik a fajtaminősítés, a törzskönyvezés, a növény-egészségügyi ellenőrzés, amelyekhez szervesen kapcsolódik az előállított vírusmentes faiskolai termék igazolvánnyal való ellátása.
A vizsgálatokhoz lágy szárú indikátornövényeket használnak. A vírusátvitel során a mechanikai módszert alkalmazzák.
Az almatermésűek lágy szárú biológiai tesztelése (Bach és Szőnyegi, 1996)
A tesztelés során használt lágy szárú tesztnövények a következők: Cucumis sativus (mozaik és NEPO vírusok), Chenopodium quinoa [alma klorotikus levélfoltosság vírus (apple chlorotic leaf spot trichovirus); alma törzsbarázdáltság vírus (apple stem grooving capillovirus) és NEPO vírusok] és a Celosia argentea (alma klorotikus levélfoltosság vírus).
A vizsgálatokat március–április hónapokban kell elvégezni.
A tesztelésnél használt növényi rész a virágszirom, amelyhez 1 : 5 arányban stabilizáló puffer szükséges. Az almástermésűek esetében kétféle puffert használnak: 0,01 M Tris/HCl-puffer (pH 8,5) + 0,005 M MgSO4 + 1% koffein; 0,01 M Tris/HCl-puffer (pH 8,5) + 0,005 M MgSO4 + 0,1% Na2SO3 + 0,1% aszkorbinsav + 1% ni-kotin.
A virágszirmokat porcelánmozsárban, a stabilizáló puffer jelenlétében kell szétdörzsölni, és a kapott szövetnedvvel inokulálni a tesztnövények leveleit.
A Cucumis sativus esetében 20, a Chenopodium quinoa és a Celosia argentea esetében 6-6 ismétlés beállítása szükséges.
A tesztnövényeket a vizsgálat időtartamára (kb. 20 napra) 20–22 °C-os, vektormentes üvegházban kell elhelyezni.
A csonthéjasok lágy szárú biológiai tesztelése
A tesztelés során használt lágy szárú tesztnövények a következők: Cucumis sativus [Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus (Prunus necrotic ringspot ilarvirus); szilva törpülés vírus (prune dwarf ilarvirus) és a NEPO vírusok), Chenopodium quinoa (Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus, alma klorotikus levélfoltosság vírus és a NEPO vírusok), és Celosia argentea (alma klorotikus levélfoltosság vírus)].
A vizsgálatokat február végétől április végéig kell elvégezni.
A tesztelés során használt növényi részhez (meghajtatott rügyek levelei) 1: 3 arányban stabilizáló puffert kell adni. A csonthéjasok esetében használt puffer a következő: 1/5 M foszfát-puffer (pH 7,5) és 0,005 M DIECA + 0,001 M N,N-difeniltiokarbamid + 0,03 M koffein 1:1:1 arányban.
A meghajtatott rügyek leveleit porcelánmozsárban, a stabilizáló puffer jelenlétében szét kell dörzsölni és a kapott szövetnedvvel inokulálni a tesztnövények leveleit.
A Cucumis sativus esetében 20, a Chenopodium quinoa és a Celosia argentea esetében 6–6 ismétlés beállítása szükséges.
A tesztnövényeket a vizsgálat időtartamára (kb. 20 napra) 20–22 °C-os vektormentes növényházba kell elhelyezni.
Az oltás nyugalmi állapotban lévő, cserepes és jól meggyökeresedett alanyokra történik. A vírusátvitel történhet kettős oltással, amely akkor használatos, ha az alany, a vizsgált fa és az indikátor azonos fajhoz tartoznak. A kéregátültetést akkor kell használni, ha az alany és a vizsgált fa nem azonos fajhoz tartozik. A gyökéroltást a Golden Delicious indikátoron, az alma seprűsödés fitoplazma (apple proliferation phytoplasma) kimutatására használják. E módszer kivitelezése a következő: a vizsgálandó növényekből márciusban szedett gyökérdarabokat rá kell oltani almamagoncgyökerekre kézben oltással, nyelves párosítással, majd ezt követően az alanyokat be kell oltani a Golden Delicious indikátorral.
Az üvegházi fás szárú biológiai tesztelés során használt indikátorokat, a kimutatható kórokozókat és a kísérlet körülményeit a 18. táblázat tartalmazza.
18. táblázat - Gyümölcsfajok üvegházi fás szárú biológiai tesztelése (Bach és Szőnyegi, 1996 után)1
Indikátornövény | Kimutatható kórokozók | Ismétlés | Hőmérséklet °C | Időtartam |
Alma Malus pumila R 12740-7A Spy 227 | Alma klorotikus levélfoltosság vírus (apple chlorotic leaf spot trichovirus) Alma 227 epinasztia és pusztulás vírus (apple spy 227 epinasty and decline virus) Alma törzsgöndörödés vírus (apple stem pitting virus) | 3 3 | 18–20 22–26 | 4 hét 3 hónap |
Virginia Crab | Alma törzsgöndörödés vírus (apple stem pitting virus) Alma törzsbarázdáltság vírus (apple stem grooving capillovirus) | 3 | 22–26 | 4 hét |
Golden Delicious Pyronia veitchii | Alma seprűsödés fitoplazma (apple proliferation phytoplasma) Alma fapuhulás fitoplazma (apple rubbery wood phytoplasma) Alma klorotikus levélfoltosság vírus (apple chlorotic leaf spot capillovirus) | 4 3 | 18–20 22 | 4 hónap 10 hét |
Körte Pyronia veitchii Pyrus calleriana | Körte érsárgulás vírus (pear vein yellows virus) Alma 227 epinasztia és fapusztulás vírus (apple 227 spy epinasty and decline virus) Alma fapuhulás fitoplazma (apple rubbery wood phytoplasma) Körte érsárgulás vírus (pear vein yellows virus) | 3 3 | 23 22 | 10 hét 4 hét |
Cseresznye és meggy Prunus persica GF 305, vagy Elberta magonc Prunus tomentosa IR 473/1, vagy IR 474/1 | Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus (Prunus necrotic ringspot ilarvirus) Szilva törpülés vírus (prune dwarf ilarvirus) Földieper látens gyűrűsfoltosság vírus (strawberry latent ringspot nepovirus) Alma szárgöndörödés vírus (apple stem pitting virus) Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus (Prunus necrotic ringspot ilarvirus) Szilva törpülés vírus (prune dwarf ilarvirus) Alma klorotikus levélfoltosság vírus (apple chlorotic leaf spot trichovirus) | 5 3 | 20 22 | 3 hónap 3 hónap |
Szilva, kajszi és őszibarack Prunus persica GF 305 vagy Elberta Prunus tomentosa IR 473/1, vagy IR 474/1 | Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus (Prunus necrotic ringspot ilarvirus) Szilva törpülés vírus (prune dwarf ilarvirus) Alma klorotikus levélfoltosság vírus (apple chlorotic leaf spot trichovirus) Földieper látens gyűrűsfoltosság vírus (strawberry latent ringspot nepovirus) Alma szárgöndörödés vírus (apple stem pitting virus) Szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus (Prunus necrotic ringspot ilarvirus) Szilva törpülés vírus (prune dwarf ilarvirus) Alma klorotikus levélfoltosság vírus (apple chlorotic leaf spot trichovirus) | 5 3 | 20 22 | 3 hónap 3 hónap |
1 Köszönettel tartozom dr. V. Németh Máriának (Budapest) kritikai észrevételeiért.
A gyümölcsfák virológiai tesztelésénél alkalmazott átviteli módszer megválasztását befolyásolja az indikátornövény típusa, az indikátor és az alany faja, a kimutatandó vírus és az, hogy a kórokozó a fa melyik részében helyezkedik el, valamint a környezeti körülmények.
Átviteli módszerek
Egyszerű szemzés abban az esetben alkalmazható, ha az indikátorként használt alany és a vizsgálandó fa azonos fajhoz tartoznak, vagy legalábbis szemzésnél kompatibilisek (pl. GF 305 – Myrobalan). A Shirofugen-tesztnél inkompatibilis partnerek esetében is használható az egyszerű szemzés, mert a vírusátvitelhez elegendő a Prunus serrulata var. Shirofugen-indikátor és a vizsgálandó fáról származó szem 3–4 napos öszszetapadása.
Kettős szemzést akkor alkalmazunk, ha az indikátor valamely nemes faj vagy vad faj. Ebben az esetben egymás fölé kell szemezni a vizsgált fáról és az indikátorról származó szemeket, majd a következő évben a kihajtás után a vizsgálandó fáról származó szemből kihajtó hajtást (az alsót) vissza kell csípni.
A kettős oltás ugyanazon az elven alapszik, mint a kettős szemzés. Az indikátort kézben kell oltani a megvizsgálandó fa oltóvessző darabjára, majd ez a kettős kombináció kerül egy vírusmentes alanyra. Ez a módszer szabadföldön csak módszertani kísérleteknél használatos, elterjedtebb az üvegházi fás szárú teszteléseknél.
Kéregátültetés akkor használandó, ha az alany és a vizsgált növény különböző fajhoz tartoznak. Legkevesebb 3-4 nyelv alakú, szem nélküli kéregpajzsot kell készíteni, és azt az alanyon megfelelően bevágott, lehetőleg spirálisan elhelyezett bemetszésekbe kell helyezni. Ha nem az alany az indikátor, akkor a kéregpajzsocskák fölé kell szemezni az indikátort.
Indikátorkombinációk alkalmazása esetén a fa teszteléséhez szükséges növényszámot csökkentik. E módszer használata esetén a kettős szemzéssel kapott egyéves indikátorsuhángokra augusztusban 60–70 cm magasságban újabb indikátorszem kerül.
Szabadföldi gyorstesztek (Shirofugen-teszt, GF 305-teszt, GF 31-teszt)
Ezek a módszerek a csonthéjas gyümölcsfajok gazdaságilag legsúlyosabb vírusbetegségeinek kimutatására alkalmasak, és aránylag rövidebb időt igénybevevő, nagy tömegben végezhető vizsgálatok.
Shirofugen-teszt
A Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus (Prunus necrotic ringspot ilarvirus) és a szilva törpülés vírus (Prune dwarf ilarvirus) kimutatására alkalmas. A tesztelés időtartama 6 hét. A terület kiválasztásánál izolációs távolságra nincs szükség, mert a Shirofugen-növények vektorokkal nem fertőződnek, a fák nem virágoznak, ezért pollenfertőzés sem lehetséges. A lúgos kémhatású talajok nem felelnek meg a neveléshez.
Az alanyok közül a Mazzard F 12/1 a legmegfelelőbb. A növények térállása lehetőleg 1,5 × 1 m legyen. Az alanyok szemzése júliusban–augusztusban történik, a gyökérnyakba. Az egyéves suháng korig a növények faiskolai nevelése a szokásos körülmények között történik. Az 1 éves Shirofugen-suhángot tavasszal 80 cm magasságban vissza kell vágni, majd a legfelső 3–4 rügy kivételével a törzset fel kell tisztítani. A vizsgálandó fákról 5–5 szem kerül egymás fölé 2–3 cm távolságra a lelevelezett hajtásokra. Egy hajtás 1–3 fa vizsgálatára elegendő. A szemzés ideje július vége, augusztus eleje. A kiértékelést a szemzés után 6 héttel kell elvégezni, a szem körüli mézgásodás, majd a szemzés felvágása után a szem körüli szövetnekrózis alapján (Németh, 1979).
GF 305-teszt
A szilva himlő vírus (plum pox potyvirus), a szilva törpülés vírus (prune dwarf ilarvirus) és a Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus (Prunus necrotic ringspot ilarvirus) kimutatására alkalmas. A tesztelés időtartama 1 év. A terület kiválasztásánál fontos az 500 m-es izolációs távolság betartása (a szilva himlő vírus fertőzéstől való védelem érdekében). A talaj nematódamentessége is fontos. A telepítéshez vírusmentes mag vagy magoncalany szükséges. Kívánatos térállás: 0,8 × 0,5 m. A faiskolai nevelést a szokásos módon végzik. A GF 305 magoncokra az átvitel augusztus hónapban egyszerű szemzéssel vagy kéregátültetéssel történik. Egy fa vizsgálatához 5 növényt kell felhasználni. A tüneteket az alanyon fejlődött hajtások mutatják, amelyek kiértékelését 15–20 cm-es és 30–40 cm-es hajtáshosszúságnál kell elvégezni.
GF 31-teszt
A szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) kimutatására alkalmas. A tesztelés időtartama 1 év. A terület kiválasztásánál 500 m-es izolációs távolság betartása fontos (a szilva himlő vírus fertőzéstől való védelem érdekében). A talaj nematódamentessége is fontos. A telepítés fás dugványból előállított vírusmentes GF 31 alanyokkal, 0,8 × 0,5 m-es térállásban történik. A faiskolai nevelést a szokásos módon végzik. A magoncokra az átvitel egyszerű szemzéssel, augusztus hónapban történik. A beszemezett növényeket a következő év tavaszán a szemzés felett 15–20 cm-re vissza kell vágni. Kihajtás után a szemzés alatti részt le kell „vadalni”, a szemzést vissza kell csípni, a szemzés felett két, ellenkező oldalon elhelyezkedő hajtást meg kell hagyni, a többi hajtást pedig el kell távolítani. Augusztus közepén a meghagyott két hajtást le kell levelezni. A bonitálás augusztus végén, szeptember elején történik addig, amíg a hajtások kérge még zöld színű. Vírusfertőzés esetén a hajtások alsó részén, a kérgen rozsdabarna parásodás, repedezettség látható.
Szabadföldi főteszt
Jelenlegi ismereteink szerint ez a gyümölcstermő növények legmegbízhatóbb biotesztelési módszere. A központi törzsültetvények kontrollvizsgálatainál alkalmazzák, mert idő-, munka- és területigényes. A tesztelés időtartama, a telepítés és szemzés évét is beleszámítva, 4 év. A bonitálások az almástermésűeknél júniustól szeptember közepéig tartanak. A csonthéjas indikátornövényeknél, a tünetek értékelése május eleje és június vége között 3 alkalommal történik.