Ugrás a tartalomhoz

Szövettani és sejtbiológiai vizsgálómódszerek

Dr. Csikós György, Dr. Kovács Attila Lajos, Dr. Molnár Kinga, Dr. László Lajos, Pálfia Zsolt, Dr. Zboray Géza (2012)

Eötvös Loránd Tudományegyetem

A transzmissziós elektronmikroszkóp (TEM)

A transzmissziós elektronmikroszkóp (TEM)

A TEM és a fénymikroszkóp összehasonlítása

Az optikai mikroszkóp és a TEM képalkotása alapvetően hasonló: mindkettő egy preparátumon (metszeten) áthaladó elektromágneses sugarakból álló nyalábot használ a tárgy leképezésére. A sugárforrás az egyikben (látható) fényforrás, lámpa, a másikban elektronágyúnak nevezett elektronforrás. Az ezek által kibocsátott sugarakat a fénymikroszkópban optikai lencsékkel, az elektronmikroszkópban elektromágnesekkel terelhetjük, fókuszálhatjuk és teríthetjük. A preparátumhoz érő sugarak egy része változatlanul halad át a metszeten, a másik része kölcsönhatásba lép vele (pl. megváltoztatja hullámhosszát, irányát, rezgéssíkját, l. 4.1. és 4.2. ábra). Mindkét mikroszkóptípusban a preparátumon áteső, változatlanul áthaladó és rugalmatlanul szóródó sugarakat használhatjuk képalkotásra, a rugalmasan szóródókat abból kizárjuk.

Egy átvilágító elektronmikroszkóp felépítése tehát egy optikai mikroszkópéhoz igen hasonló. A két berendezés működési elve lényegileg a következő: a sugárforrás által kibocsátott elektromágneses (foton vagy elektron) nyalábot a kondenzorlencse fókuszálja a minta síkjába. Az innen továbbhaladó sugarak kereszteződve képet alkotnak az objektív hátsó fókuszsíkjában. Ezt a nagyított, látszólagos, elsődleges képet, illetve ennek részletét a kívánt nagyításúra alakíthatjuk, ha a kép síkjába helyezett blendével a sugaraknak csak egy részét engedjük tovább, ám ezeket egy vetítő (projektor) lencserendszerre vezetjük, amely szétteríti őket, azaz tovább nagyítja a képet. A végleges, látható kép tehát az eredeti tárgypontokból csak azokat tartalmazza, amelyeket a blendével átengedtünk, de ennek a részletnek a mérete a tárgy megfelelő részletéhez viszonyítva már jóval nagyobb lesz (4.4. ábra és I. táblázat).

A bal oldalon a mikroszkópok alkatrészei sárga színnel jelölt fénysugár és kék színű elektronsugár mentén láthatók. A jobb oldalon lévő elektronmikroszkóp asztalon álló, oszlopszerű műszer, amely világos, majdnem fehér színű, az oszlopon lévő gombjai feketék. Az asztalon lévő kezelőpanelek a gombokkal együtt fehérek.

4.4. ábra. A fénymikroszkóp és a TEM képalkotásának összehasonlítása (elvi felépítések, A), valamint a képalkotó elemek helyzete az elektronmikroszkópban (B). Az A ábrán az objektív alatti piros vonalak az objektív blendét jelzik, amelynek síkjában kialakul az elsődleges kép. Figyeljük meg, hogy a többszörösére nagyított, végleges kép az elsődleges képnek csak a középső, egyenes vonalból álló részét tartalmazza, a két kép közötti nagyítás mértékét pedig vékony szaggatott vonal jelzi!

I. táblázat. A fénymikroszkóp és a TEM összehasonlítása

Megvilágítás (fényforrás) lámpa elektronágyú
Kondenzor optikai (üveg)lencse elektromágneses lencse
Minta elhelyezése tárgyasztal mintatartó
Objektív optikai (üveg)lencse elektromágneses lencse
Képvetítő, nagyító és képfelfogó rendszer tükör, optikai (üveg)lencse, okulár elektromágneses lencsék, fluoreszcens ernyő
Képrögzítés (kamera típusa) analóg vagy digitális analóg vagy digitális

A két mikroszkóptípus között fontos különbség, hogy az elektronmikroszkópban a sugárforrás védelmére és az elektronnyaláb zavartalan haladásának érdekében vákuumot kell létrehozni (10-6–10-2 Pa). Az elektronsugár létrehozásához, tereléséhez és megfelelő minőségű kép létrehozásához nagy feszültségű, stabil áramkörökre van szükség. A mikroszkóp működése közben folyamatosan hő termelődik, így a hűtéséről gondoskodni kell (vízhűtés, vízpumpa). Mindezek figyelembevételével a TEM főbb részei a következők:

  1. Elektronforrás (elektronágyú): kibocsátja az elektronnyalábot, amellyel „megvilágítjuk” a tárgyat;

  2. Kondenzorlencse: az elektronsugár-nyalábot a tárgysíkba vetíti;

  3. Mintatartó: a tárgyat (mintát) hordozza;

  4. Objektívlencse: hátsó fókuszsíkjában létrehozza az elsődleges, már nagyított, köztes képet;

  5. Közbenső (köztes) és vetítő (projektor) lencse: továbbnagyítják az elsődleges képet;

  6. Képfelfogó ernyő és képrögzítő rendszer: megjeleníti a végleges képet;

  7. Segédberendezések: vákuum-, hűtő- és feszültségstabilizáló rendszerek: biztosítják a mikroszkóp megbízható, stabil működését.

Az elektronforrás, az elektromágneses lencsék, a mintatartó és a képfelfogó ernyő a sugárnyaláb útja mentén, a mikroszkóp oszlopában kialakított terekben találhatók (4.5. ábra). A kezelőgombok és kapcsolók magán az oszlopon, az asztalon lévő paneleken, illetve az asztal alatti lábazat szekrényeiben vannak elhelyezve. A segédberendezések szintén a lábazatban, vagy a mikroszkóp mellett kapnak helyet (4.6. ábra).

A bal oldali rajz színes vázlatrajz, amelyen a mikroszkóp oszlopa és lábazata szürke, a vákuum alatt lévő terei kékek. A jobb oldalon maga a majdnem fehér mikroszkóp látható.

4.5. ábra. A TEM fő részei és vákuum alatt lévő belső terei (ezek világos- és sötétkékek, A), valamint a mikroszkóp külső felszíne (B)

Mindkét felvételen földön álló berendezések láthatók, a bal oldalon vastag, fekete bevonatú csövekkel.

4.6. ábra. A TEM egyes segédberendezései: vákuumot előállító pumpák (A) és vízhűtő (B)

A TEM képalkotó elemei

Az elektronágyú

Az elektronmikroszkóp „fényforrása” az elektronágyú (4.4. és 4.5. ábra), amelynek részei a katód, a Wehnelt-henger és az anód (4.9. ábra). A lelke egy elektromos árammal felfűtött, meghatározott anyagú (wolfram vagy lantán-hexaborid, LaB6) fémszál, amely V alakban hajlított. A fémszál negatív töltésű: ez a katód. Belőle az elektronok a fűtőáram hatására a V betű csúcsán lépnek ki (izzószálas katód típus, 4.9.A ábra).

A fűtőáram növelésével a katód elektronkibocsátását egy telítési görbének megfelelően tudjuk fokozni. Az áramerősség emelésének hatására egy pontig nő a kibocsátott elektronok száma (a leképezett kép egyre fényesebb lesz), a telítési pont fölött azonban már hiába emeljük tovább az áramerősséget, az emittált (kibocsátott) részecskék mennyisége gyakorlatilag nem növelhető tovább (túlfűtés esetén viszont a katód élettartama jelentősen csökken!). A telítési görbe felső, konvex flexiós pontjának megfelelő fűtőáramot érdemes tehát használni (4.8. ábra).

Egy grafikont látunk, amelynek tengelyei feketék, a görbe kék, a felső flexiós pontot a tengelyekkel összekötő vonal piros és szaggatott. Erre a flexiós pontra piros nyíl mutat.

4.8. ábra. A fűtőáram (vízszintes tengely) és a kibocsátott elektronok száma (függőleges tengely) közötti összefüggés: a fűtőáram erősségének emelésével a kibocsátott elektronok száma a konvex flexiós ponton túl tovább már nem növelhető (egyszerűsített vázlatrajz)

Az elektronforrásként használt katódszálat az ún. Wehnelt-henger veszi körül. Ennek feszültsége néhány száz volttal negatívabb, mint a katódé, s rajta egy nyílás van: ezen haladnak át az elektronok (4.9.B. ábra). A Wehnelt-henger szabályozza az elektronok katódszálból történő kilépését: a kilépés helyét a szál csúcsára szűkíti, és meghatározza a kilépő elektronok számát (azaz a „fényerőt”), de egyben tereli is az elektronokat. Az elektronágyúból kilépő sugárzás forgásszimmetrikus nyalábot alkot, amely egy kereszteződési pont után széttart.

Megállapíthatjuk tehát, hogy a sugárnyaláb „fényerejének” (elektronsűrűségének) kialakításában a katódnak és a Wehnelt-hengernek is szerepe van. Ezért a megfelelő tulajdonságú „megvilágítás” kialakításához a katód és a Wehnelt-henger paramétereit össze kell hangolni. A régebbi mikroszkópokban a két érték külön-külön állítható volt, az újabb generációjú berendezéseknél azonban már csak kapcsoltan változtathatók, illetve az utóbbi automatikusan igazodik a katódhoz.

Az elektronsugár hullámhossza az elektronok sebességével fordítottan arányos: annál kisebb a hullámhossz, minél nagyobb a sebesség. A nagy felbontás eléréséhez tehát az elektronokat kellő sebességre fel kell gyorsítani: erre szolgál az ún. gyorsítófeszültség. Feszültségkülönbséget kell tehát létrehozni a katód és egy, az elektronok útjába eső sík között. Ezt a földelt anód (feszültsége 0 V) biztosítja, amely tulajdonképpen egy gyűrű: a nyílása felé „repülő” elektronok a feszültségkülönbség miatt felgyorsulnak, miközben az anód nyílásán át ki is lépnek az ágyúból (4.9. ábra).

A biológiai minták vizsgálatára használt transzmissziós elektronmikroszkópokban a gyorsítófeszültség értéke általában 50–60 ezer V. Az érték helyes megválasztása nagyon fontos az eredményesség szempontjából: ha túl nagy a gyorsítófeszültség, az elektronoknak nagyon nagy lesz az energiájuk, így jelentős részük úgy halad át a mintán, hogy azzal nem lép kölcsönhatásba (4.1. ábra). Ez lényegében azt eredményezi, hogy a kapott kép kontrasztszegény lesz (l. 4.2. ábra). Alacsony gyorsítófeszültségnél az elektronoknak nem lesz megfelelő sebességük, ezért a mikroszkóp felbontása romlik. A megbízható működés szempontjából a gyorsítófeszültség stabilan tartása tehát fontos követelmény.

A bal oldali ábrán látható katód egy fémgyűrű, amin hajtűszerűen meghajlított vékony fémszál rögzül. A jobb oldali rajz színes: a katódszál piros, az elektronok útja kék vonallal rajzolt, az anód szürke, a Wehnelt-henger fala fekete, rajta fehér körökben fekete mínuszjelek jelzik a relatív negatív töltést.

4.9. ábra. Az elektronágyú részei: izzókatód (A) és az ágyú hosszmetszeti vázlata (B). (Az A ábrán látszik, hogy egy esetleges katódcsere esetén a katódot csak kesztyűvel szabad megfogni)

Az elektromágneses lencsék és a blendék

Az elektronsugár mágneses lencsékkel terelhető, azaz fókuszálható és szétteríthető. A TEM oszlopában négyféle elektromágneses lencse van, amelyek sorrendje fentről lefelé a következő: kondenzorlencse, objektívlencse, köztes lencse és projektor- (vetítő)lencse. A modern mikroszkópokban ezek kettős lencsék, azaz két-két tekercs alkotja őket.

Funkciójuk röviden a következő. Az elektronforrásból kilépő sugárnyalábot a kondenzorlencsék gyűjtik össze és terítik szét egy adott méretű folton belül közel homogén megvilágítássá. A megvilágító nyaláb lehet közel párhuzamos, azaz síkhullám (képalkotásnál), vagy fókuszált, azaz konvergens (analitikai alkalmazásnál). Ez a nyaláb világítja meg a mintát. Az elsődleges leképezést végző objektívlencse által alkotott képet (4.4. ábra) a köztes és a vetítőlencsék közvetítik a képrögzítőre (film, digitális kamera érzékelője). A köztes lencsék száma változó (2–3), s a kívánt nagyítás mértékétől függően kapcsolhatók be és ki. Kis nagyításnál elegendő csak az egyiket használni, közepes és nagyobb nagyításoknál a többit is be kell kapcsolni (4.10.A ábra). Amikor egy intermedier lencsét bekapcsolunk, a kép 180 fokban elfordul (ennek okára nem térünk ki).

A kapott kép nagyítása független a megvilágított terület nagyságától, egyedül attól függ, hogy az objektívlencse képsíkjában megjelenő rögzített nagyítású, elsődleges (köztes, intermedier) képet a vetítőrendszer hányszorosára nagyítva vetíti tovább a képrögzítőre (4.4. ábra).

A mágneses lencsék térerősségét a tekercsben folyó áram határozza meg. A tekercs közepén nyílás (pórus) van, amit kúposan megmunkált pólusperemek, ún. pólussaruk képeznek (14.10.B ábra). A lencsék tekercsében folyó áram hatására mágneses erővonalak keletkeznek, amelyek az elektronokat terelik. A tekercs vasköpennyel borított.

A lencsék között elhaladó elektronnyalábban az elektronok spirális pályán mozognak. A régebbi mikroszkópokban ez világosan érzékelhető volt a nagyítás változtatásakor, ilyenkor ugyanis a kép adott szögben elfordult. Ez az elmozdulás a modern berendezéseknél már korrigált.

A jobb oldalon az elektronmikroszkóp belsejének berendezéseit látjuk rajzon, amelyben a lencséket alkotó elektromágnesek színesek: a legfelső kondenzorlencse piros, az alatta lévő objektív barna, a köztes lencsék narancssárgák, a vetítőlencse ismét barna. Az elektronsugár kék színű. A bal oldali rajzokon a lencsék magját alkotó tekercsek átmetszetei narancssárgák, az elektronsugarak kékek.

4.10. ábra. Az elektronsugár terelése: az elektromágneses lencsék helyzete a mikroszkópban (A), egy lencse metszete a pólussarukkal (B), az objektívblende működése (C) és a blendék kezelőgombjai a mikroszkóp oldalán (D)

A lencse fókusztávolságát az elektromágnes áramerősségével lehet szabályozni. A mélységélesség a lencse azon tulajdonsága, hogy nem csak egy síkról, hanem a tér (tárgy) adott mélységű szeletéről ad éles képet. Értéke függ a hullámhossztól és a numerikus apertúrától. Az elektronsugár esetében ez az ultravékony metszet vastagságánál nagyobb érték, így a TEM a metszet teljes vastagságát egy síkba képezi le.

Csakúgy, mint az optikai (üveg)lencséknek, az elektromágneses lencséknek is vannak lencsehibáik. Ezek egy részét korrigálhatjuk az apertúra szűkítésével, mivel a hibák a lencse széle felé jelentkeznek leginkább Az apertúra szűkítése a felbontás csökkenésével jár, így a felbontóképességnek a lencsehibák kiküszöbölése szab határt (vagyis a felbontóképesség elmarad az elméletileg lehetséges értéktől).

A megfelelő képminőség kialakításában fontos, hogy a tárgyat (metszetet) megvilágító és az azt elhagyó sugárnyaláb egyenletes sűrűségű és homogén legyen. Ez a feltétel a nyaláb tengelyének közelében teljesül. Az ezen kívül eső, a képalkotás szempontjából nem kívánatos elektronokat a kondenzorlencse alatti és az objektívlencse feletti blendékkel (apertúrákkal) zárhatjuk ki a sugárnyalábból. Ahogy azt már korábban írtuk, a mintával találkozó elektronok kétféleképpen ütközhetnek a minta atomjaival. Ha az elektron – megtartva energiáját – csak irányát változtatja meg (azaz „elpattan” a mintáról), akkor rugalmas szóródásról, ha az ütközés következtében lelassul (energiát veszít), de irányát csak kismértékben változtatja meg, akkor rugalmatlan szóródásról beszélünk (4.1. ábra).

A blendék – apertúranyílásuktól függően – a sugárnyaláb perifériáját zárják ki (az ott haladó szóródó elektronokkal együtt) a továbbhaladó elektronnyalábból (4.10.C ábra). Minden egyes blende nyílásának méretét a gyorsítófeszültséggel (azaz a rugalmasan és rugalmatlanul szóródó, valamint a mintán változatlanul áthaladó elektronok arányával) kell összehangolni annak érdekében, hogy a kapott kép kontrasztja és felbontása is elfogadható legyen (l. 4.2. ábra).

Adott gyorsítófeszültségnél a blende szűkítésével a kontraszt növelhető. Adott blendenyílásnál viszont a gyorsítófeszültség emelésével egyre nagyobb sebességgel érkeznek az elektronok, nő a mintán változatlanul áthaladó és a rugalmasan ütköző elektronok száma. Utóbbiak egyre kevésbé térülnek ki a sugárnyaláb tengelyéből, tehát a blende nem rekeszeli le őket. Mivel így a kelleténél több elektron vesz részt a képalkotásban, a tárgy egyes pontjai közötti anyagi különbségek egyre kevésbé képeződnek le a kialakuló képbe, tehát annak kontrasztja egyre csökken (l. 4.2. ábra). Miután a felbontás az elektronok sebességével nő, a kontraszt viszont csökken, az optimális eredményt, azaz a legjobb képminőséget e két szempontot együttesen mérlegelő kompromisszumok árán érhetjük el.

A kondenzorlencse blendéje a lencse alatt, a többi lencséé az elektromágnes fölött van. A lencsékhez tartozó blendék kezelőgombjai az oszlop oldalán találhatók, s velük a blendék sugárútba való behelyezését és kiemelését, illetve az apertúra beállítását végezhetjük (4.10.D ábra).

A mintatartó

Egy biológiai minta elektronmikroszkópos vizsgálatra való előkészítése többlépéses folyamat (l. később). A megfelelő preparátum egy nagyon vékony, ún. ultravékony metszet, amelynek vastagsága 50–100 nm. A metszést követően a metszetek egy hordozófelületre, ún. mikrorostélyra kerülnek. Ezeket finom csipesszel helyezzük a mintatartóba, majd azt a mikroszkóp oldalán található nyíláson keresztül betoljuk a zsilipkamrába (4.11. ábra). Itt ugyanolyan vákuumot kell kialakítani, mint az oszlopban, s csak ezt követően juttatjuk be a mintánkat a mikroszkóp belső terébe, ahol az elektronnyaláb halad.

A röntgendiffrakciós vizsgálatokra is alkalmas mikroszkópok mintatartói olyan kialakításúak, hogy segítségükkel a minta dőlésszöge adott határokon belül változtatható (a mintatartóba ún. goniométert építettek).

A bal oldalon barna színű fa asztallapon rúd alakú fémtartó, a jobb oldalon ez a mikroszkóp oldalában kialakított nyílásba helyezve látható. A fogantyúja fekete, vastag henger.

4.11. ábra. TEM mintatartója (A) és a zsilipkamrába helyezett mintatartó (B)

A minta a vizsgálat során kisebb-nagyobb mértékben károsodik. A melegedés általában nem jelentős (a keletkező hőt a mintatartó elvezeti), de a vákuumtérbe bekerült szennyeződések adszorbeálódhatnak a mintán (kontamináció), illetve az ionizálódott vízgőz kiégetheti a metszetet (eloxidálja annak széntartalmát, l. 4.30.B ábra). A minta előkészítése és kezelése során ezért nagyon fontos a tisztaság (kesztyű használata) és a körültekintő, gondos munka.

A minta, a képalkotó rendszer és a képrögzítés

A TEM működési elvének megfelelően a képalkotásban azok az elektronok vesznek részt, amelyek a mintán áthaladnak. A transzparencia feltétele, hogy a metszet kellően vékony legyen, és viszonylag kevés nagy tömegszámú elemet tartalmazzon. A képalkotásban a rugalmasan és a rugalmatlanul szóródó elektronoknak is van szerepük. A biológiai mintákban eredendően kevés olyan atom van, amelyik rugalmas szóródásra kényszeríti az elektronokat, ezért a metszeteket (nagy tömegszámú) nehézfémsókkal kezeljük. Mivel ezek különböző jellegű (adszorbció, ionos kötés képzése vagy redukció) és mértékű kölcsönhatásba lépnek a sejt komponenseit alkotó biológiai makromolekulákkal, a mintában való megkötődésük – a létrejövő képen megjelenő kontrasztok révén – lehetővé teszi az egyes struktúrák környezetüktől való elkülönítését (l. 4.2. ábra). A nehézfémsókkal történő kezelés a kontrasztosítás.

A fématomokba ütköző elektronok szóródnak, s közülük a rugalmasan szóródókat egy megfelelően beállított blendével ki lehet zárni a sugármenetből (l. 4.10.C ábra). A továbbhaladó elektronok felvillanásokat okoznak a megfigyelőkamra alján elhelyezett szcintillációs vagy fluoreszcens képernyőn. A sugárnyalábból kizárt elektronok nem érkeznek ide, azon tárgypontok képpontjai tehát, amelyekkel kölcsönhatásba léptek, hiányozni fognak a képből: ezek lesznek a kép sötét (elektronszóró) pontjai. Egy TEM kép tehát világos és sötét pontokból álló mintázat (l. 4.2. és 4.14 ábra).

Az „elektronszóró” kifejezést gyakran helyettesítik az „elektrodenz” kifejezéssel, holott az utóbbi éppen az előbbi ellenkezőjét jelenti. A minta erősen elektronszóró helyeiről a szóródó elektronok nem jutnak el a képernyőre, nem vesznek részt a kép kialakításában, tehát helyükön a pozitív képen fekete képpontok lesznek. Ezzel szemben az elektrodenz kifejezés elektronokban gazdag, sűrű (denz) helyet jelent – viszont ahová sok elektron érkezik, ott a pozitív kép világos, fehér részei alakulnak ki. Az elektrodenz jelzőt tehát helytelen a kép sötét részeinek jellemzésére használni!

Egy TEM kép értelmezésénél figyelembe kell venni, hogy a képet a teljes mintán áteső elektronok hozzák létre, azaz a képernyőn az ultravékony metszet teljes vastagságban leképeződik.

A keletkező képet a megfigyelőkamra üveglapja előtt elhelyezett okuláron keresztül nézhetjük (4.12. ábra). A vizsgálódást érdemes kis nagyításon kezdeni, ahol a teljes metszetet áttekinthetjük, s ellenőrizhetjük az eddigi munka eredményességét. Ezután hozzáláthatunk a kiválasztott területek nagyobb nagyításon való megfigyeléséhez.

Mindkét képen a mikroszkóp oszlopának alsó részét látjuk. A megfigyelőkamra sötétbarna. A jobb oldali képen az üveg felületén keresztül belátunk az alján lévő nagy, kerek képernyőre. A bal oldali fotón a kamra fehér fedőlappal letakart. Felette két fehér színű okulár van, amelyek végei feketék.

4.12. ábra. A megfigyelőkamra és a képrögzítő kamerák (A), a fluoreszcens ernyő az okulárokkal (B)

Megfigyeléseink dokumentálása céljából, és mivel a metszetek nagyon sérülékenyek és a mikroszkópban károsodnak is, érdemes róluk felvételeket készíteni. Síkfilmes (analóg) kamerát a mikroszkóp lábazatában, a megfigyelőkamra alatt találunk (4.5. és 4.10.A ábra). Használatakor a nagy képernyő felemelkedik, így az elektronsugár beléphet a filmkamrába. Mivel ez a tér is vákuum alatt van, a negatívok ide – zsilipelés után – csak a fotózás idejére kerülnek be.

A negatívok a hagyományos fotótechnikában használatos bevonattal rendelkező síkfilmek, amelyeken az elektronok becsapódása ugyanolyan változásokat idéz elő, mint a fotonok becsapódása. A film felszínén lévő cellulózalapú emulzióban az elektronbecsapódás által ezüst-kloridból vagy ezüst-bromidból kivált fémezüstöt kémiai reakcióval (hívóoldattal) tesszük láthatóvá. A fényérzékeny negatívokat sötét fotókamrában kell az adagolódobozba (kazettába) betölteni, majd azt az üres, exponált negatívokat befogadó kazettával együtt a mikroszkópasztal alatt kialakított kamrába kell helyezni. A filmkockák exponáláskor az adagolókazettából kerülnek be a vákuum alatti térbe, majd innen az exponálás után a fogadókazettába továbbítódnak. Az utóbbiban összegyűlt, exponált negatívokat a hagyományos fotóeljárás szerint kell előhívni és róluk nagyításokat készíteni. A felvételek számozottak, így a fotózás során vezetett jegyzőkönyv alapján az előhívás után azonosíthatók.

A kazetták helye a mikroszkóp asztala alatt: az asztal szegélye piros csíkként látszik a kép tetején, a kazettákat tartó, kihúzott sínek és tartó, valamint az ajtó fémből készültek.

4.13. ábra. A síkfilmes negatívok számára kialakított kazetták helye a mikroszkóp lábazatában

A modern mikroszkópokkal szemben alapvető kívánalom, hogy az általuk alkotott kép számítógép-monitoron is látható és digitális módon is rögzíthető legyen. Az LCD kamerákat az oszlop oldalára szerelik (4.12.A ábra), kameraként és képrögzítőként is használhatók. A kamerákhoz szoftvereket is mellékelnek, amelyek nemcsak a kamera kezelésére, hanem a készített kép adatainak rögzítésére (pl. nagyítás mértéke) és utólagos képfeldolgozásra is használhatók (4.14. ábra). Mivel az LCD kamerák is kapcsolatban állnak a vákuum alá helyezett térrel, a jó képminőség megtartása érdekében szennyeződésektől való megóvásuk nagyon fontos.

A kép fekete-fehér és nagyon részletgazdag, rajta a membránok sötétebb vonalak, így az azok által határolt terek (sejtszervecskék) jól elkülöníthetők a környezetüktől. A sejtmag állományában világosabb és sötétebb területek váltják egymást.

4.14. ábra. Transzmissziós elektronmikroszkópban készített digitális felvétel: az egyes sejtalkotók jól elkülöníthetők egymástól, mert a mintába bevitt nehézfémsók megfelelő kontrasztot biztosítanak

A fókuszmélység (mélységélesség) azt a távolságot adja meg, amelyen belül a vetített kép pontjai élesek. Ennek az értéknek a megfigyelőernyő és az alatta lévő síkfilm, vagy a digitális kamera érzékelője közötti távolság kialakításakor van jelentősége. A TEM fókuszmélysége nagy, így a képfelfogó felszínek egymáshoz képesti elhelyezésére tág határok állnak rendelkezésre – a távolság változtatásával csak a kép nagyítása és a fényereje változik.

Az elektronmikroszkóp beállítása, lencsehibák

A megfelelő minőségű, részletgazdag eredmény (l. 4.14. ábra) eléréséhez az elektronmikroszkópot ugyanúgy be kell állítani (fókuszálni, centrálni kell), mint a fénymikroszkópot. Ezt egyrészt az elektronjelenségek, másrészt a lencsehibák teszik szükségessé. Utóbbiak határt szabnak a felbontásnak, ezért egy jól beállított mikroszkópban látott kép sokkal kontrasztosabb és részletgazdagabb, mint egy olyan mikroszkóp által létrehozott kép, amelynek beállítására nem fordítanak gondot.

Az elektronjelenségekről, a képalkotás szempontjából legfontosabb szóródásról, ennek típusairól korábban már szóltunk. Összefoglalóan azt mondhatjuk, hogy a rugalmasan szóródó, mintán áthaladó elektronok zavarják a képalkotást (pl. rontják a kontrasztot), így azokat a sugárnyalábból ki kell zárni. Erre alkalmasak a blendék.

Az elektromágneses lencsehibák alapvetően az optikai (üveg)lencsék hibáihoz hasonlítanak, a mikroszkóp használata során ezeket korrigálni kell. A lencsehibák egyrészt az elektron-sugárnyaláb inhomogenitásának következményei, másrészt a lencsék tökéletlen voltából következnek. Az előbbiek az ún. kromatikus hibák (aberrációk), az utóbbiak pedig az akromatikus hibák kialakulását okozzák.

Akromatikus hiba a szférikus aberráció. Abból adódik, hogy az elektromágneses lencsék eltérően hatnak a sugárnyaláb tengelyében és az attól távolabb haladó elektronokra (az általuk létrehozott elektromágneses tér nem homogén). Az eredmény az, hogy a tárgy pontjairól több síkban keletkeznek képpontok. A vetített képen ez hordó- vagy párnatorzításként jelentkezik (4.15. ábra). Ezen a hibán a sugárnyaláb szélén haladó elektronok sugárnyalábból való kizárásával, azaz az objektívblende szűkítésével javíthatunk.

A rajzok fekete-fehérek, az A ábrán egymással párhuzamos és egymásra merőleges, négyzetrácsos mintázat, a B és C ábrán egymástól elhajló, illetve egymás felé hajló vonalakat tartalmazó alakzat látható.

4.15. ábra. A szférikus aberráció eredménye: négyzetháló tökéletes leképezése (A), hordó (B) és párna torzítás (C)

Szintén akromatikus hiba az asztigmatizmus, ami a lencse nem tökéletes szimmetriájából, anyagának inhomogenitásából adódik. A fellépő jelenség lényege, hogy egy tárgypontról két, egymásra merőleges, vonalszerűen elmosódott képet kapunk. Ezek egyike a lencséhez közelebb, a másik pedig attól távolabb jelenik meg. A lencse fókusztávolsága tehát eltér az egymásra merőleges tengelyek mentén: a tárgypont a két fókuszpont között kissé elmosódott pontként jelenik meg (4.16. ábra).

A rajz színes, a lencse kék, a leképezett alakzatok piros foltok. A vízszintes síkban haladó sugarak sárgák, a függőleges síkban haladók zöldek.

4.16. ábra. Az asztigmatizmus jelensége: a lencse függőleges és vízszintes fókuszpontjai nem esnek egybe, a két fókuszpont között pedig elmosódott a leképezett pont kontúrja

Mivel tökéletes lencsét jelenleg nem lehet előállítani, a korrekciót egy kompenzáló elektromágneses térrel kell biztosítani. Ezt a lencse alá helyezett, elektromágnesekből álló gyűrűvel lehet előállítani, amelyben a mágneses tér (ezzel együtt az elektron-sugárnyaláb) ellenkező értelmű torzulást szenved, mint amit a lencse okozott (4.17. ábra). A berendezés neve: stigmátor. A kondenzor, az objektív és a köztes lencsék hibáit javítják vele.

A rajzokon koncentrikus körökből (A, D) és ellipszisekből (B, C) álló gyűrűrendszerek láthatók.

4.17. ábra. Az asztigmatizmus kompenzálása a stigmátor elektromágneses terével: egy tökéletes lencse fókuszsíkja az ábra (papír, képernyő) síkjában van, a leképezett koncentrikus gyűrűk így körszimmetrikusak (A); az asztigmatizmus következtében megdőlő függőleges tengelyt (B) a stigmátor mágneses tere kompenzálja (C), így a torzulás megszűnik (D)

Az optikai tengely menti kromatikus aberráció abból adódik, hogy a sugárnyalábban haladó elektronok eltérő energiájúak, azaz hullámhosszúságúak. A jelenség eredménye az, hogy a minta azonos pontjait az eltérő hullámhosszúsággal rendelkező elektronok más-más síkba képezik le. Két fókuszpont alakul ki: a lencséhez közelebbit a kis energiájú, a távolabbit a nagyobb energiájú sugarak kereszteződése hozza létre. A hiba kijavításának egyik lehetősége, hogy az elektronok energiájának eltérését (azaz a szórást) csökkentjük, más szavakkal a mintát elérő sugárzást energetikai szempontból homogénné tesszük. A másik megoldás az inhomogenitást okozó sugarak „fényútból” való kizárása, azaz a sugárnyaláb monokromatikussá tétele úgynevezett monokromátor alkalmazásával. A legújabb fejlesztésű, nanotechnológiában használt ultra-nagy felbontású mikroszkópokba (ultra-high resolution TEM, HR-TEM) már komplex akromatikus hibát javító rendszert építenek be.

A fókuszálás (centrálás) a megvilágító (elektronágyú, kondenzorrendszer) és a leképezőrendszer (objektív) tagjainak a közös optikai tengelybe történő lehető legpontosabb beállítása. Ennek lépéseire itt nem térünk ki részletesen, azt a mikroszkópokhoz mellékelt leírások tartalmazzák. Menete – ha nem is feltétlen ugyanabban a sorrendben, de – ugyanazokat a logikai lépéseket tartalmazza minden TEM mikroszkóp esetében. A régebbi mikroszkópokban ezt ajánlatos volt rendszeresen, a rendszer minden tagjára kiterjedően elvégezni – a modern mikroszkópok működése jóval stabilabb, így a beállításukra ritkábban van szükség.

A jól beállított mikroszkóp egyenletes megvilágítású, kerek „fényfoltot” ad, a nagyítások közti váltásnál a folt alakja és a megvilágítottság egyenletessége nem változik, csak a fényerő csökken. A felbontás a nagy nagyításokon is kielégítő, a kép éles.

A helyes fókusz megtalálása kis nagyítás mellett nehezebb, mint nagy nagyításon. A munkát a modern mikroszkópokba beépített úgynevezett wobbler-rendszer könnyíti meg (ennek ismertetésére ezen a szinten nem térünk ki). A wobbler bekapcsolásakor a kép vibrálni kezd. Ha az objektívlencse fókusza helyesen beállított, akkor a kép közepén a remegés megszűnik.

A mikroszkópos munka menete

Miután a biológiai mintát megfelelően előkészítettük (l. később), betehetjük a mikroszkópba, hogy megvizsgáljuk. A mikroszkóp bekapcsolása előtt győződjünk meg arról, hogy az ki van kapcsolva. A bekapcsolás menete a következő:

  1. A mikroszkóp vízkeringető és hűtőrendszerének bekapcsolása;

  2. A mikroszkóp bekapcsolása és ellenőrzése (tapasztalható-e szokatlan zaj vagy rezgés). Bekapcsoláskor a vákuumrendszer automatikusan aktiválódik;

  3. A megfelelő értékű vákuum kialakulására 20–30 percet várni kell. Ha a mikroszkóp kész a használatra, azt egy LED jelzi;

  4. A minta mintatartóba, majd a mintatartó mikroszkópba helyezése;

  5. A gyorsítófeszültség beállítása (általában 60 ezer V);

  6. A minta vizsgálata (mindig kis nagyításon kezdjük);

  7. A metszetek átnézése és dokumentálása után a mintatartó kivétele a mikroszkópból;

  8. A minták visszahelyezése a rostélytartóba;

  9. A gyorsítófeszültség levétele, a mikroszkóp kikapcsolása (a vákuum-előállító rendszer is leáll);

  10. A vízkeringető rendszer kikapcsolása.

A mikroszkóp használata során szem előtt kell tartani azt, hogy annak belső tereiben vákuum van. Ennek megfelelő értékre történő beállásához idő kell, így a vákuumrendszer bekapcsolása után és a mintatartó zsilipelőkamrán keresztül való mozgatása közben megfelelő ideig várni kell. A munka végeztével a mikroszkóp kikapcsolása után a vízhűtő rendszert még adott ideig működtetni kell, s csak utána szabad leállítani.