Ugrás a tartalomhoz

Biokatalízis, biokonverziók, biotranszformációk

Rákhely Gábor (2012)

Szegedi Tudományegyetem

36. fejezet - A genomika hagyományos módszerei

36. fejezet - A genomika hagyományos módszerei

Előkészületek a genom-szekvenáláshoz:

A genom összerakásához fontos információkkal szolgált a genom genetikai és fizikai térképe. A genetikai térképezésnél korlátot jelent, hogy hiányosak az ismereteink a különböző génekről és markerekről illetve ezek biológiai funkciójáról . A fizikai térképezésnek lényegében nincsenek ilyen korlátai, mert a vizsgált szekvenciaelemek sorrendjét határozza meg függetlenül attól, hogy annak van-e biológiai funkciója, fenotipikus vonatkozása.

Fizikai térképezés

Ennél a szekvenálási stratégiánál az első lépésként fizikai térképet készítenek az élőlény genetikai állományáról. A fizikai térképezésnek három fő stratégiáját szokták alkalmazni:

  1. leggyakrabban restrikciós endonukleázokkal való emésztéssel ezen restriciós helyek egymáshoz való térbeli elhelyezkedését állapítjuk meg,

  2. fluoreszcens in situ hibirdizáció, ismert DNS darabokat fluoreszcensen megjelölünk és mikroszkóp alatt megvizsgáljuk, hogy ez a kromszóma mely részéhez hibridizál. Ez egy viszonylag egy alacsony felbontású módszer.

  3. A leghatékonyabbnak tekintett technika az ún STS-k térképezése (sequence tag site). Ezek 100-500 bp-os fragmentumok, és ezeknek az STS-eknek az egymáshoz való elhelyezkedését vizsgáljuk vagy hibridizációval, vagy PCR reakcióval. Annak a valószínűsége, hogy két STS ugyanarra a fragmentre térképeződjön fordítva arányos a távolságukkal. Ez egy gyors, nagy hatékonyságú és nagy felbontású módszer.

  4. Genom-szekvenálási stratégiák:

  5. Hierarchikus shotgun szekvenálás (klónról klónra történő shotgun szekvenálás, direkt módszer)

Ebben egy olyan genomi könyvtárat készítenek, amelynél a vektorok 20-300 kilobázisnyi inszerteket tartalmaznak (ábra). A nagy inszertek beépítésénel a legnagyobb problémát az okozhatja, ha valamelyik géntermék toxikus az E. coli sejtekre. Nyilván minél nagyobb az inszert, annál nagyobb a valószínűsége toxikus terméket kódoló gén előfordulásának. Különösen gyakori ez az eset, ha Gram-pozitív baktérium DNS-ét klónozzák Gram-negatív gazdába.

A könyvtár készítéséhez leggyakrabban BAC (bacterial artificial chromosome), lambda, cosmid vagy fosmid vektorokat használnak.

Miután ez elkészült, az egyes klónokban olyan pontokat keresnek, amely alapján később a szekvenciák összeállítása könnyebb lesz. Ilyen „jelzőhelyek” lehetnek bizonyos restrikciós enzimek hasítóhelyei, vagy más, ismert szekvenciaelemek. A könyvtár klónjaiból kiválogatják azokat, amelyek nem tartalmaznak nagy átfédő régiókat, ugyanis ezek szekvenálása fölösleges pluszköltséget jelentene. Az összehasonlítást általában DNS fingerprint módszerrel végzik.

A kiválasztott klónokban található inszertet ezután –általában valamilyen fizikai módszerrel- néhány kilobázisnyi darabokra törik, darabjait pedig plazmid vektorba szubklónozzák, és ezeket kétoldalról szekvenálják.

Shotgun genom szekvenálás

A teljes genom shotgun módszerrel való szekvenálása:

Ennél a módszernél a genomiális DNS-t mindjárt az első lépésben kis méretű darabokra tördelik össze, majd a darabokat plazmid vektorba klónozzák (ábra). Az így kapott nagy számú klónt mindkét irányból megszekvenálják, majd a darabokat kontigokba és szuperkontigokba illesztik. Először 1995-ben bizonyították a szkeptikus tudósoknak, hogy ezzel a módszerrel meg lehet álllapítani egy élőlény teljes bázissorendjét, ekkor készült el ugyanis a Haemophilus infuenzae nevű baktérium teljes genomszekvenciája.

A módszernél a legfontosabb követelmény, hogy a megszekvenált DNS hossza olyan nagy legyen, hogy többszörösen (5-10) lefedje a teljes genomot, mert az összeillesztés csak ebben az esetben lehetséges, sőt még ekkor sem lesz teljes. A szuperkontigok között réseket PCR segítségével kiamplifikálják és ezek alapján ezek még nagyobb egységekbe szervezhetőek.

Leginkább baktériumoknál alkalmazzák, ezek DNS-e ugyanis kevés ismétlődő szekvenciát tartalmaz, de eukariótáknál is használják, így készült el például a Drosophila melanogaster genom szekvenciája is (Adams és mts., 2000).

A humán genom szekvenciájának első változata az International Human Genome Sequencing Consortium (IHGSC) és a Celera biotechnológiai társaság munkájának eredményeként került nyilvánosságra, 2001-ben.

A munka során különböző megközelítéseket alkalmaztak, de mindkét esetben a random, ún. shotgun klónozás módszerét használták. E módszernél a szekvenálni kívánt genomot kisebb méretű, átfedő fragmentekre tördelik fel, majd ezeket klónozzák. A klónok által hordozott DNS szakaszok mindkét végén körülbelül 500 bázispár (bp) hoszúságban meghatározzák a szekvenciát. A genom minden egyes részletét hatszor-tízszer "olvassák el", hogy a meghatározás pontosságát növeljék. A DNS szekvencia meghatározásnál a bázissorrendet számítógép regisztrálja és illeszti be az addig kész szekvenciába.

Az IHGSC által használt módszer szerint a humán DNS-t 200,000 bp hosszúságú fragmentekre hasították és a 24 kromoszómát lefedő fizikai térképet készítettek. Az így rendezett DNS fragmenteket azután egyenként shotgun módszerrel klónozták és szekvenálták.

Ezzel szemben a Celera kutatói az egész genomot random fragmentekre vágták, háromféle méretben (2,000, 10,000 és 200,000 bp) és a fragmentek végeinek szekvenciáját határozták meg. Ezek után csak számítógép segítségével állították össze a teljes szekvenciát, mert fizikaitérkép nem segítette a munkát.

A Celera 1998-ban jelentette be, hogy három éven belül meg kívánja határozni a teljes humán genom szekvenciáját, amit akkor meglehetős szkepticizmussal fogadtak. Végül is mindkét kutatócsoport erőfeszítéseit siker koronázta és a munka meghatározó részét előbb fejezték be, mint bárki remélte volna.