Ugrás a tartalomhoz

Biokatalízis, biokonverziók, biotranszformációk

Rákhely Gábor (2012)

Szegedi Tudományegyetem

X. rész - Funkcionális genomika: transzkriptomika

X. rész - Funkcionális genomika: transzkriptomika

A microarray technológia során elsõ lépésként olyan biológiaicsipeket (cm2 –es nagyságrendű) állítanak elõ (ezek megvásárolhatók, vagy megfelelõ laboratóriumi háttérrel a felhasználó maga állítja elõ), amelyekre rendezetten, sorokban és oszlopokban több ezer, esetleg tízezer jól azonosítható ponton nukleinsavdarabokat (oligonukleotidokat) vagy cDNS (mRNS DNS-re visszaírt formáját) láncokat visznek fel. Felvitelükhöz (mások mellett) az úgynevezett „fotolitográfia” szolgál, amely során nukleotidonként („szintenként”) fényérzékeny védõcsoportokkal ellátott, elõre meghatározott nukleotidokból építik fel a 8-20 elembõl álló láncot. Az eljárás során megfelelõ pontokon átlyuggatott „maszkok” segítségével alakítják ki a kétdimenziós mintázatot. Ha cDNS-ek felvitele történik, mikrocseppeket alkalmaznak, így kerülnek az ismert szerkezetû cDNS-molekulák a helyükre. A felvitelre használandó felületek továbbfejlesztése jelenleg és a közeljövõben minden bizonnyal tovább emeli az így kialakított elrendezés („array”) sûrûségét, tehát az egyidejûleg analizálható gének számát.

E topográfiai információkat és az egyes pontokra felvitt nukleinsavdarab pontos szekvenciáját számítógépben rögzítik. Az így elõkészített array-t inkubálják („hibridizálják”) az ismeretlen minta valamilyen színes (például zöld vagy piros) festékkel jelzett nukleinsavdarabjaival. Elõfordul, hogy az ismeretlen minta nukleinsavdarabjait a jelzés elõtt polimeráz láncreakcióval bõvíteni kell. Megfelelõ ionerejû és hõmérsékletû oldattal átmosva õket, csak a részlegesen vagy teljesen azonos nukleotid-komplementeritást mutató darabok maradnak a csip felszínén. Általában a rögzített oligonukleotid közepén található bázisok eltéréseinek kimutatása a legegyszerûbb, itt mosható le legérzékenyebben a „mismatch”, vagyis a nem tökéletesen illeszkedõ nukleinsavminta. DNS-csipeknél, ahol egy-egy pontmutációra kérdez rá a vizsgáló, ennek megfelelõen tervezik az oligonukleotidokat.

A leolvasás a csip felszínének pásztázó értékelését jelenti, az érzékelõ az egyes pontok színét, intenzitását rögzíti. Ezt követi a bioinformatikai elemzés, tehát a ponthalmaz színelemzése, az adatok szétválogatása és az értékelõ csoportosítása.

A DNS-csipeken mutációk (például nukleotidcsere) jelenlétét vagy hiányát keressük. Ez a módszer veleszületett génhibák, illetve az úgynevezett „single nucleotide polymorphism” (SNP) vizsgálatára használható. Utóbbiak pontmutációk, amelyek mint független genetikai allélok kezelhetõk, kombinált vizsgálatuk individuális genetikai jellegzetességek követését teszi lehetõvé. Több száz vagy ezer SNP egyidejû leolvasása kitûnõen alkalmazható betegségek azonosítására, de akár gyógyszermellékhatások kimutatására is (lásd késõbb). Génexpressziós microarray esetén a kérdés az, hogy két összehasonlítandó mintában (például egy sejt vagy szövet két aktivációs állapota, egy biológiai hatóanyag hatása a kontrollhoz képest, egy egészséges és egy betegbõl származó szövetminta összehasonlítása stb.) milyen gének fejezõdnek ki, és ezek mennyiségileg hogyan viszonyulnak egymáshoz. Ezt génexpressziós profilnak nevezik. A profilok összehasonlításával felismerhetõk és azonosíthatók az adott hatásra jellemzõ gének. Technikailag ez úgy történik, hogy a kétféle mintából származó mRNS-mintát, illetve azok cDNS-re átírt formáját kétféle festék (például zöld és piros) egyikével jelölik, majd keverve a két populációt, hibridizálják azt a mikrocsippel (1. ábra). Amennyiben az egyik (például zöld festékkel jelzett) mintában az adott csipponton reprezentált gén erõsebben fejezõdik ki, a leolvasás itt „zöldebb” pontot fog detektálni, fordított esetben viszont „pirosabb” lesz. A legtöbb esetben a két szín megfelelõ kombinációja jelzi a két mintában egy adott gén kifejezõdési arányát. Lehetséges az is, hogy a rögzített expressziós mintázatot ezután adatbankokban már megtalálható, korábban ugyanezen microarray-el nyert kétdimenziós mintázatokhoz hasonlítják, és kiemelik a hasonló eloszlású profilokat. Nyilvánvalóan, a különbözõ hatásokhoz különbözõ génkifejezõdési mintázatok tartoznak. Például a sejtek különbözõ receptorain keresztül kiváltott jelátviteli útjainak génexpressziós mintázatát elemezve, azonosítani lehet ismert szignálok molekuláris következményeit mRNS-szinten. Nagyon lényeges az ebben az összeállításban részletesen nem tárgyalt proteomikai megközelítés is. Ekkor nem cDNS, hanem protein/peptid mintázatok összehasonlítására kerül sor, például kétdimenziós elektroforetogrammal. Immunológiai példával élve: a B-limfocitákon elvégezhetõ az immunglobulin-receptorok, citokinreceptorokon ható jelek, vagy például hisztamininhibitorok hatásának molekuláris követése. Kitûnõen azonosíthatóak a genetikai beavatkozások (például antiszensz hatások, domináns negatív mutáció, génkiütés) hatásai is.

Az egyes csipekrõl bekerülõ adathalmaz bioinformatikai elemzése nyomán a számítógép clusterekbe rendezi a kapott információkat (2. ábra). Erre egy példa a hierarchiacluster korrelációs analízis. Itt egy olyan mátrix ábrázolás az elemzés eredménye, ahol az egyes oszlopok az egyedi mintákat, az egyes sorok az egyes géneket jelentik. A számítógépes összerendezés lényege az, hogy a hasonló, majd egyre kevésbé hasonló géneket kifejezõ mintákat csoportokba rendezve tüntetik fel. Az egész csip munkalogisztikája tehát úgy fest, hogy az egyes mintákból származó egyedi microarray adatok bioinformatikai összegzése után a számítógépes adatbankok meglévõ mintázatkönyvtárai segítségével következtetéseket vonunk le. A következtetések természete biomedicinális területen legalább kétféle.

1. Diagnosztika (betegségmegállapítás), prognosztika (betegségkockázat becslése), esetleg megelõzés. 2. Olyan géncsoportok kiemelése, amelyek elõre jeleznek valamilyen – például betegségi – állapotot, szövõdményt, mellékhatást, tehát van predikciós potenciáljuk. Ez utóbbi lehetõvé teszi a csip egy második „generációjának” („diagnózis” csip) elõállítását is, amin már csak kizárólag a „betegségspecifikus” gének szerepelnek. Ez esetenként már „csak” néhány tucat génnel létrehozandó, nyilvánvalóan olcsóbb „makrocsipet” igényel. Ma már lehetséges szövettani blokkokból is rendezett microarray-t készíteni, esetenként akár több száz szövettani blokkból kiemelt hengerek együttes metszése nyomán létrehozott készítményen. Ezen akár nukleinsav-expressziós (például in situ génamplifikáció), akár proteomikai analízis is végezhetõ. Rendelkezésre állnak olyan fixáló reagensek is, amelyek speciálisan protektívak a minta RNS-tartalmát illetõen.