Ugrás a tartalomhoz

Általános genetika

Deák Veronika (2014)

Typotex Kiadó

RNS-szintézis

RNS-szintézis

Az RNS-szintézis (transzkripció, átírás) báziskomplementaritás szerint DNS-mintáról (templát) történik. A szintézist RNS-polimeráz végzi. Az enzim a DNS kettős spirálhoz kapcsolódik az átírandó gén elején, és miközben halad előre, építi a ribonukleotid-láncot a DNS-templát alapján, rNTP-k (ribonukleotid-trifoszfátok) felhasználásával. Az RNS-szintézis – a DNS-szintézishez hasonlóan – 5’→3’ irányban történik, azaz az újabb rNTP a készülő RNS-lánc előző nukleotidján a ribóz egység 3’ –OH csoportjához kapcsolódik észterkötéssel. Egy RNS-molekula szintéziséhez mindig csak a DNS kettős hélix egyik lánca szolgál templátként. A másik szál az RNS-szintézis tekintetében a nem-templát szál, melynek nukelotidsorrendjével és polaritásával a képződő RNS nukleotid sorrendje és polaritása megegyezik, vagyis az RNS a nem-templát szál másolata (kivéve, hogy az RNS-ben timin helyett uracil található). Ez a nem-templát szál a kódoló szál, mivel a benne rejlő nukleotidsorrend adja a funkcionális RNS-ek és a fehérjék szerkezetére vonatkozó információt, a kódot. Ha egy nagyobb kromoszómaszakaszt tekintünk, több génnel (kódoló szekvenciával), akkor az egyes gének esetén a DNS kettős hélix egyik vagy másik szála lehet a kódoló szál, tehát bizonyos gének esetében az egyik, míg más gének esetében a másik DNS-szál szolgál genetikai kódként (7.1 ábra). Kompakt genomoknál, amelyekben a génsűrűség nagy, előfordulhat, hogy a DNS kettős spirál egy adott szakaszán mindkét szál kódoló. Ebben az esetben az egyik és a másik szálról is képződik RNS-másolat, tehát egy DNS-szakaszon két gén is elhelyezkedhet (gén a génben, Gén 3 és Gén 4 a 7.1. ábrán). Ez két teljesen különböző RNS-nukleotidsorrendet eredményez (7.2. ábra). A két kódoló szakasz átfedése sokszor csak részleges. Az RNS-szálat – akárcsak a DNS-t – balról jobbra 5’ → 3’ irányban írjuk fel. Később látni fogjuk, hogy ennek a polaritásnak az RNS-érése és későbbi „élete” során is jelentősége van (például mRNS-eknél a fehérjeszintézis irányának meghatározásában).

7.1. ábra - A DNS mindkét szála szolgálhat genetikai kódként

A DNS mindkét szála szolgálhat genetikai kódként

7.2. ábra - Egy szakaszon a DNS egyik és másik szála eltérő kódot jelent, eltérő RNS-szekvenciát határoz meg

Egy szakaszon a DNS egyik és másik szála eltérő kódot jelent, eltérő RNS-szekvenciát határoz meg

A transzkripció lépései

Egy átírásra kerülő DNS-szakasz egy jóval nagyobb DNS-molekulának, a kromoszómának egy kis szegmense. Mivel a kromoszómát alkotó DNS kettős hélix egyetlen molekula, egyetlen folytonos egység, a transzkripciót végző molekuláris gépezetnek nukleotid pontossággal biztosítania kell, hogy a megfelelő szakaszok a megfelelő irányban és megfelelő hosszan íródjanak át. Ez három részfolyamatban történik: 1) a gén elejének megtalálása, a transzkripció pontos starthelyének és irányának kijelölése – iniciáció, kezdés, 2) az átírás végzése a gén hossza mentén – elongáció, lánchosszabbítás, 3) az átírás leállítása a gén végén – termináció, befejezés (7.3. ábra). A teljes folyamatot a fenti három részfolyamat szerint tárgyaljuk. A transzkripció alapjaiban igen hasonlóan zajlik pro- és eukariótákban, de vannak lényeges eltérések is.

7.3. ábra - A transzkripció áttekintése

A transzkripció áttekintése

Transzkripció iniciáció prokariótákban

Hogyan találja meg az RNS-polimeráz a transzkripció korrekt starthelyét? Ehhez egy speciális DNS-szekvencia segíti hozzá, melyet promóternek (promoter, elősegítő) nevezünk. A promóter a transzkripció starthelyének közelében, attól 5’ irányban (vagy upstream) helyezkedik el (7.3. ábra). Emlékezzünk vissza, hogy a gén kódoló szakaszát 5’ → 3’ irányban írjuk fel, és a transzkripció iránya megegyezik a kódoló szál 5’ → 3’ irányultságával. A kódoló szálon az első átírásra kerülő nukleotidot +1 pozíciónak nevezzük. Ez a fontos koordináta a transzkripció starthelye (7.4. ábra). Ettől 5’ irányban (a kódoló szakasz előtt vagy upstream) lévő nukleotidokat -1, -2… stb. számozással, a +1 helytől 3’ irányban (downstream) elhelyezkedőket pedig +2, +3… stb. számozással jelöljük. A promóter tehát a +1 helytől upstream elhelyezkedő DNS-szekvenciarész, mely a transzkripció strathelyének közelébe irányítja az RNS-polimerázt. Mitől speciális ez a DNS-szakasz? Egy DNS-szakasz egyediségét nem adhatja más, mint annak nukleotidsorrendje. A promótert is meghatározott nukleotidok meghatározott pozíciókban és sorrendben való elhelyezkedése teszi funkcionális szakasszá. Egy genomon belül az egyes promóterek szekvenciája hasonló. Ha összehasonlítjuk például E. coli gének +1 helytől upstream lévő DNS-szakaszait, akkor két olyan, egyenként néhány nukleotidból álló részt figyelhetünk meg, melyek az egyes gének promóter régióiban igen hasonlóak. (A promóterszekvenciát általában csak az egyik szál, a kódoló szakasznak megfelelő DNS-szál szerinti szekvenciával adjuk meg.) Ezekből a hasonló – de nem mindig tökéletesen egyező – szekvenciájú régiókból leképezett leggyakoribb bázissorrendet konszenzus (megegyező) szekvenciáknak nevezzük. Az E. coli promóterek konszenzusszekvenciái a -10 és a -35 pozíciók környezetében vannak (7.4. ábra). Más prokarióta promóterekre is jellemző ez a szerkezet. Bár e két konzervált régió helye prokariótáknál általános, a konkrét bázissorendben egy genomon belül is többféle variáció lehetséges. Ez befolyásolja az adott promóter erősségét, és lehetőséget biztosít meghatározott géncsoportok együttes transzkripcionális szabályozására (lásd később). A 7.4. ábrán az E. coli RNS-polimeráz σ70 alegysége által felismert konszenzusszekvencia látható. A konszenzusszekvenciától akár csak egy bázisban is eltérő promótereknél az RNS-polimeráz kötődése (és ezzel a transzkripció) gyengül vagy akadályozott. Más típusú promóterfelismerő RNS-polimeráz alegységekhez más konszenzusszekvenciák tartoznak.

7.4. ábra - Az E. coli RNS-polimeráz σ70 alegysége által felismert promóterek konszenzusszakaszai

Az E. coli RNS-polimeráz σ70 alegysége által felismert promóterek konszenzusszakaszai

A promóter után pásztázva, az RNS-polimeráz holoenzim (több alegységből álló enzimkomplex) felismeri azt a speciális szekvenciája alapján, hozzáköt, megkezdi a DNS kettős hélix lokális széttekerését (ezzel létrejön a transzkripciós buborék), és pontosan a +1 pozícióban lévő nukleotidnál elkezdi az RNS-lánc felépítését. A promóterben a konzervált szekvenciaszakaszok megfelelő pozícióban való jelenléte elengedhetetlen ahhoz, hogy a transzkripció mindig pontosan meghatározott nukleotidnál indulhasson el.

A bakteriális RNS-polimeráz alegységei: α, α, β, β’, ω. Ez az öt alegység alkotja az ún. core enzimet (core – mag). A promótert közvetlenül egy további alegység, a σ-faktor ismeri fel, ez irányítja a promóterhez a core enzimet. A σ-faktor elnevezése a specifitás (specificity) kifejezés kezdőbetűjével áll összhangban, ugyanis ez az alegység felel a DNS specifikus szakaszainak felismeréséért. A σ alegység a DNS-szálak szétválasztásában is részt vesz a -10 hely környezetében. A transzkripció elindulásával a σ alegység leválik a DNS-ről és a core enzimről.

Az E. coli – akárcsak más baktériumok – többféle σ-faktorral is rendelkezik. A gének zömének átírásában a σ70 nevű (70 kDa) fehérje vesz részt. Más σ-faktorok másféle promóterszekvenciákat ismernek fel, vagyis a σ-faktorok promóterspecifitásban különböznek egymástól. Ez lehetővé teszi, hogy ugyanaz az RNS-polimeráz holoenzim – a sejtben jelenlévő σ-faktorok függvényében – többféle, különböző promóterszerkezetű gének csoportjait írhassa át. Prokariótáknál a gének kifejeződésének a σ-faktorok sejten belüli hozzáférhetőségéből (jelenlétéből, hiányából, mennyiségéből) fakadó szabályozása elterjedt (lásd A génkifejeződés szabályozása prokariótákban című fejezetet).

A transzkripció starthelye (+1) nem esik egybe a transzlációs starthellyel. (Itt mRNS-ekről beszélünk; más RNS-féleségek nem templátjai a transzlációnak.) A transzláció a START kodonnál (ez általában AUG az mRNS-en, tehát ATG a kódoló DNS-szálon) indul. A DNS-szekvenciában ez az ATG triplet (bázishármas) a +1 helytől távol, downstream helyezkedik el, és a transzkripciós apparátus számára semmilyen jelzésértékkel nem bír. Ez azt jelenti, hogy a képződő RNS-transzkriptumnak van egy olyan 5’ végi szakasza (a transzkriptum eleje), mely nem kerül transzlációra. Ezt az RNS-szakaszt 5’ UTR-nek (untranslated region, nem transzlálódó régió) nevezzük. Az 5’ UTR-nek a transzlációnál a riboszóma kötésében fontos szerepe van (lásd erről később).

Transzkripció elongáció prokariótákban

Az RNS-polimeráz haladása közben maga előtt kitekeri, maga mögött pedig visszatekeri a DNS kettős hélixet. A lokálisan széttekert DNS kettős hélix (transzkripciós buborék) lehetővé teszi, hogy a templát szál leolvashatóvá váljon az enzim számára. A transzkripciós buborék így az RNS-polimerázzal együtt halad (7.5. ábra). Az RNS-polimeráz kb. 30 nukleotid hosszan kötődik a DNS-hez (a DNS dupla hélix egy teljes csavarulata 10 nts), a kitekert szakasz hossza 18–20 nukleotidnyi. A nukleotidok beépülése a templát szállal komplementer bázispárosodás alapján történik. A beépüléshez szükséges energiát a szintézis monomereiben, a ribonukleozid-trifoszfátokban (NTP-k) lévő foszfoanhidrid-kötések felszakadása szolgáltatja, pirofoszfát felszabadulása közben. Az RNS-szintézist az alábbi egyszerű képlettel írhatjuk le:

NTP + (NMP)n → (NMP)n+1 + PPi

DNS

Mg2+

RNS-polimeráz

7.5. ábra - RNS-szintézisnél a DNS kettős hélix lokálisan felnyílik (transzkripciós buborék)

RNS-szintézisnél a DNS kettős hélix lokálisan felnyílik (transzkripciós buborék)

Az RNS-láncba utoljára beépült 8–9 nukleotid hidrogénhidakkal kapcsolódik össze a DNS-templátszállal (ez RNS-DNS hibrid régió, 7.5. ábra), az ezt megelőző RNS szakasz pedig leválik a templátról.

Transzkripció termináció prokariótákban

Az elongáció mindaddig tart, míg az RNS-polimeráz nem „érzékel” terminációra utaló jelet. E. coli-ban (és más baktériumokban) két fő mechanizmust ismerünk a transzkripció terminációjára: intrinsic (belső, vagy másik nevén ρ-független) termináció és ρ-függő termináció.

Az intrinsic terminációs mechanizmus direkt út, külső faktor nem szükséges hozzá. A terminációs szignál – ahogy a mechanizmus neve is utal rá – a DNS-ben kódolt. Ez egy kb. 40 nukleotid hosszú szekvencia, mely rendelkezik két egymással komplementer, GC-gazdag szakasszal, melyet minimum hat A nukleotid követ (7.6. ábra). Ez a DNS-templátra jellemző szekvencia a róla átíródó mRNS-ben, az ellentétes irányultságú komplementer szakaszoknak köszönhetően, ún. hajtű szerkezet kialakulását idézi elő (7.6. ábra). Ezt követi egy A-U hibrid szakasz, mely laza DNS-RNS párosodást okoz. A mechanizmus részletei nem világosak. Feltételezhető, hogy a transzkripció során az RNS-polimeráz érzékeli, ha túl laza a „mögötte hagyott” DNS-RNS hibrid szakasz, ekkor visszalép, és megpróbálja stabilizálni azt. A terminációs szakaszon kialakuló laza A-U kapcsolódás ezért leállásra és visszalépésre késztetheti az RNS-polimerázt, a stabil, GC-párok által összetartott hajtű struktúra pedig útját állja, melynek hatására a polimeráz és az RNS leválik a DNS-ről. Az E. coli genomban ezrnél több ilyen szekvencia található, ami azt jelenti, hogy a gének közel fele ilyen terminátorral rendelkezik.

7.6. ábra - Intrinsic (ρ-független) transzkripció termináció

Intrinsic (ρ-független) transzkripció termináció

A másik terminációs mechanizmusban egy fehérje, a ρ-faktor működik közre. Ez egy homohexamer fehérje. A ρ-függő terminációs szignált is egy speciális DNS-szakasz szolgáltatja, melyre jellemző, hogy 40–60 nukleotid hosszúságú, C-ben gazdag (de G-ben szegény), és tartalmaz egy ún. rut (rhoutilization site, ρ által felismert hely) szekvenciarészt. Amint a rut hely átíródik és hozzáférhetővé válik, a ρ-fehérje hozzáköt, ezzel leállásra kényszeríti az RNS-polimerázt, és elősegíti az RNS leválását.

mRNS-ek esetén a transzkripció terminációs helyet mindig megelőzi a majdani transzláció terminációs hely (ez a STOP kodon, lásd később). Az mRNS 3’ végén tehát – az 5’ véghez hasonlóan – van egy nem transzlálódó szakasz (UTR, untranslated region, nem transzlálódó régió). A 3’ UTR tehát az mRNS-nek a STOP kodontól a 3’ végig tartó szakasza, mely tartalmazza a transzkripció terminációs szignált.

Transzkripció eukariótákban – áttekintés

Az eukarióta transzkripció az alapmechanizmusok tekintetében a prokarióta mechanizmusokhoz hasonlít, de annál jóval komplikáltabb. Ennek legfőbb okait az alábbi három pontban foglaljuk össze:

  • Eukariótákban a gének száma nagyobb (jellemzően tízezres nagyságrendű a prokarióta genomok néhány ezres génszámával szemben). Ehhez a nem kódoló DNS-szakaszok magas aránya társul, ami jelentősen csökkenti a gének „sűrűségét”. Néhány példa a génsűrűségre: E. coli 1 gén/1400 bp, Drosophila 1 gén/9000 bp, ember 1 gén/100000 bp. Egy gén megtalálása a transzkripciós apparátus számára olyan lehet, mintha tűt keresnénk a szénakazalban. Érthető, hogy eukarióta sejtekben komplexebb transzkripció iniciációs rendszer felelhet csak meg ennek az óriási kihívásnak. Az egyik kiemelendő eltérés a prokariótákkal szemben az, hogy eukariótákban nem egy, hanem három különböző RNS-polimeráz enzim működik. Az RNS-polimerázok más-más géncsoportok transzkripcióját végzik:

  • RNS-polimeráz I – rRNS-gének átírása (kivéve az 5S RNS-t)

  • RNS-polimeráz II – fehérjekódoló gének (melyek termékei a mRNS-ek), továbbá néhány snRNS gén átírása

  • RNS-polimeráz III – kis funkcionális RNS-ek (tRNS-gének, snRNS-gének és az 5S rRNS-gének)

A mitokondrium és a kloroplaszt saját RNS-polimerázzal rendelkezik.

Ebben a fejezetben elsősorban az RNS-polimeráz II-vel foglalkozunk.

Az eukarióta génátírás másik fontos jellemzője, hogy az iniciációs lépésben az RNS-polimerázon kívül számos fehérje vesz részt. Ezeket a fehérjéket összefoglaló néven általános transzkripciós faktoroknak (GTFs, general transcription factors) nevezzük. Hiányukban az RNS-polimeráz nem képes elindítani az átírást.

  • Eukariótákban a transzkripció és a transzláció térben és időben elkülönül egymástól: a transzkripció a sejtmagban, a transzláció a citoplazmában zajlik. Míg prokariótákban már a transzkripció elongáció során elkezdődik az 5’ RNS vég transzlációja, eukarióta sejtekben az mRNS-nek előbb ki kell jutnia a sejtmagból. Ezt megelőzően számos módosuláson megy keresztül az elsődleges transzkriptum (vagy pre-mRNS), mely folyamatokat összefoglaló néven RNS-érésnek nevezünk (ennek részleteit lásd a továbbiakban).

  • Eukariótákban a kromatin szerkezete befolyásolja a génátírást, ami jelentős szereppel bír a gének kifejeződésének szabályozásában.

Transzkripció iniciáció eukariótákban

Az RNS-polimeráz II nem képes arra, hogy a gének promóter régióit felismerje. Ehhez más fehérjék, az általános vagy alap transzkripciós faktorok (GTFs, general vagy BTFs, basal transcription factors) szükségesek. A TFIIA, TFIIB… stb. (transcription factor of RNA polymerase II) elnevezésű általános transzkripciós faktorok egyenként is több fehérjéből felépülő komplexek. Maga az RNS-polimeráz II szintén több (egy tucat körüli) alegységből áll. Az RNS polimeráz II több alegysége konzervált (hasonló szerkezetű) az élesztőtől a humánig. Ezt igazolja, hogy ha az élesztő RNS-polimeráz bizonyos alegységeit a humán megfelelőire kicserélik, akkor az az élesztősejtekben funkcionáló kiméra (a kiméra szó jelentése: különböző eredetű részeket magába foglaló) RNS-polimerázt alkot.

A promóter régió eukarióta géneknél is a transzkripciós starthelytől 5’ irányban helyezkedik el. Az eukarióta promóterek kiterjedtebb szekvenciaszakaszok, mint a prokarióta promóterek, és funkcionális szempontból két részre oszthatók: magpromóter és szabályozó promóter. E fejezetben a magpromóterrel foglalkozunk, a szabályozó promóterekről a génexpresszió szabályozás témakörnél lesz szó. Az RNS polimeráz-II által átírt gének promótereinek összehasonlításából kirajzolódik a -30 pozíció környezetében elhelyezkedő TA-gazdag, ún. TATA-box konszenzus szekvencia. Ennél a pozíciónál kezdődik el a preiniciációs komplex összeépülése, mely hat GTF-t és magát az RNS-polimeráz II enzimkomplexet tartalmazza (7.7. ábra). A TATA-boxot a TFIID komplex TBP (TATA-binding protein, TATA-kötő fehérje) alegysége ismeri fel. A TBP a promóter környezetébe vonzza a többi GTF-t (TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH) és az RNS-polimerázt (7.7. ábra). A preiniciációs komplex összeszerelődésével az RNS polimeráz II-komplex a megfelelő helyre irányítódik, és elkezdheti az átírást. Az elongációs szakasz kezdetéről azt tudjuk, hogy az RNS polimeráz II egyik alegységének a C-terminális doménje (CTD) foszforilálódik, feltehetőleg valamelyik GTF által. Ez a kémiai módosulás lazíthatja a polimeráz kötődését a preiniciációs komplex többi tagjához, és elősegítheti a leválását (7.7. ábra). Ezzel kezdetét veszi az RNS-lánc szintézis (elongációs) szakasz. A GTF-ek egy része a DNS-hez kötötten marad, és hozzájuk újabb RNS-polimeráz kapcsolódhat. Ily módon egy génről egymást követően több polimeráz folytathat átírást.

7.7. ábra - Transzkripció iniciáció eukariótákban

Transzkripció iniciáció eukariótákban

Transzkripció elongáció, termináció és pre-mRNS-érés eukariótákban

Az elongáció a transzkripciós buborékban a prokarióta RNS-szintézishez hasonlóan zajlik. A lényegi különbség, hogy míg prokariótáknál a még polimerizálódó RNS-szál már elkészült 5’ végéhez riboszóma kapcsolódik, és elindul a transzláció, addig az eukarióta pre-mRNS-ek nem transzlálódnak, hanem ebben a fázisban esnek át három fontos érési folyamaton: 1) az 5’ vég egy „sapkát” (cap) kap, 2) meghatározott szakaszai, az intronok kivágásra kerülnek, ez a splicing nevű folyamat, 3) a 3’ végre adenin tartalmú nukleotidokból álló szakasz (poliA) kapcsolódik a poliadenilációnak nevezett folyamat során. Korábban azt gondolták, hogy ez a három érési folyamat a transzkripció végeztével zajlik (azaz poszt-transzkripcionálisan), de a kísérleti eredmények azt igazolják, hogy már a transzkripció közben (ko-transzkripcionálisan) végbemegy a pre-mRNS-ek érése. Úgy tűnik, hogy az RNS-polimeráz már említett alegységének C-terminális doménje (CTD, amely az elongációs fázis elején foszforilálódik) fontos szerepet kap az érési folyamatok összehangolásában, irányításában is. A CTD jellegzetes aminosavsorrenddel rendelkezik (hét aminosavból álló szakasz többször ismétlődik), és térben a készülő RNS-lánc RNS-polimeráztól leváló részének közelében helyezkedik el. Az érés egyes fázisaiban a CTD aminosavai reverzibilis módosításokon mennek keresztül (leggyakoribb a foszforiláció–defoszforiláció), ami meghatározza, hogy az érésben részt vevő fehérjék közül melyek kapcsolódnak hozzá, és kerülnek ezáltal az RNS-lánchoz közel.

Az 5’ és a 3’ végek módosítása

Amint az RNS-lánc 5’ vége („eleje”) leválik a polimerázról, egy speciális struktúrát, 7-metilguanozin „sapkát” (transzlálódnak, hanem ebben a fázisban esnek át három ) kap, mely három foszfátcsoporton keresztül kapcsolódik a transzkriptumhoz (7.8. ábra). A módosítást az ún. capping enzimkomplex végzi. A cap szerepe kettős: 1) védi az RNS-t a degradálódástól, ami azért fontos, mert hosszú utat kell megtennie, míg a transzlációra sor kerül, 2) jelenléte szükséges a transzlációhoz (erről lásd később).

7.8. ábra - Capping: az RNS 5’ végi módosítása

Capping: az RNS 5’ végi módosítása

Az elongáció addig folytatódik, míg egy AAUAAA vagy AUUAAA konzervált szekvencia keletkezik az RNS-szálon. Ezt egy enzim felismeri, és tőle 10–35 nukleotiddal downstream elvágja a transzkriptumot. Az elvágott 3’ véghez egy 150–200 adenint tartalmazó nukleotidfüzér (poliA farok) szintetizálódik (7.9. ábra). A konzervált szekvenciaszakaszt ezért poliadenilációs szignálnak nevezzük. A 3’ vég módosítását végző enzim a poli(A) polimeráz. Ez az RNS-lánchosszabbítás nem igényel templátot, a poliA farok nem a DNS-ben kódolt! Megjegyezzük, hogy más RNS-féleségekhez (normálisan) nem kapcsolódik poliA farok, ami lehetőséget teremt arra, hogy a kutatók az mRNS-eket szelektíven preparálhassák a sejtekből (például kromatográfiás oszloptölteten rögzített szintetikus oligoT szekvenciákhoz az mRNS-ek a poliA szekvenciájukkal a komplementer bázispárosodás alapján kikötődnek).

7.9. ábra - Poliadeniláció: az RNS 3’ végi módosítása

Poliadeniláció: az RNS 3’ végi módosítása

Az intronok eltávolítása: RNS-splicing

1977-ben a Cell című folyóiratban jelent meg egy tudományos publikáció a következő címmel: An amazing sequence arrangement at the 5' ends of adenovirus 2 messenger RNA, azaz Elképesztő szekvenciaelrendeződés az adenovírus 2 mRNS 5’ végén. Az „elképesztő” kifejezés nem volt túlzó. Két kutatócsoport (Richard Roberts és Phillip Sharp laboratóriuma) egymástól függetlenül fedezte fel, hogy az eukarióta gének kétféle darabokból állnak, exonokból és intronokból. Az exon szakaszok (expressed region, kifejeződő régió) tartalmazzák mRNS-ekben a fehérjék aminosavsorrendjére vonatkozó kódsort, az intron részek (intervening region, közbeeső régió) pedig az exonok közé ékelődnek, genetikai kódként nem funkcionálnak, mivel a primer transzkriptum érése során kivágódnak (7.10. ábra). Az intronok funkciója máig nem világos. Intronok nemcsak a proteinkódoló génekben vannak, hanem néhány rRNS- és tRNS-génben is. Az intronok száma, mérete egy genomban génenként változik, illetve fajok között is vannak felismerhető különbségek. Például az élesztő 6300 génjéből csak kb. 200-ban van intron, emberben pedig a legtöbb génben van néhány intron. Emberben az intronok átlagos mérete 2000 nukleotid, az exonoké pedig 200 nukleotid. Egy extrém példa: egy humán izombetegség, a Dushenne-féle izomdisztrófia génje 79 exont és 78 intront tartalmaz, együttesen 2,5 millió bp hosszúságú, s ebből az exonok mindössze 14000 bp-t tesznek ki.

7.10. ábra - Az exonok közé ékelődő intron szakaszok az érés során kivágódnak

Az exonok közé ékelődő intron szakaszok az érés során kivágódnak

Az intronok láthatóvá tehetők elektronmikroszkóppal, ha az érett mRNS-t a megfelelő genomiális DNS-szakasszal hibridizáltatják (párosítják). Ekkor az intronszakaszok – mivel az RNS-ben nincs homológ szekvenciájuk – kihurkolódnak (7.11. ábra). Kísérletesen bázispontossággal megállapíthatók az exon–intron határok úgy, hogy az ismert genomiális szekvenciát és az érett mRNS-ről készített cDNS (komplementer DNS, melyet in vitro rendszerben rutinszerűen szintetizálnak reverz transzkriptáz enzim segítségével) szekvenciáját összevetik egymással.

7.11. ábra - A gén és a róla képződött érett mRNS hibridizációjakor a DNS-molekula intron szakaszai kihurkolódnak, mert az érett mRNS-ben nincs homológ szakaszuk

A gén és a róla képződött érett mRNS hibridizációjakor a DNS-molekula intron szakaszai kihurkolódnak, mert az érett mRNS-ben nincs homológ szakaszuk

A splicing mechanizmusa. A spliceoszóma és a kis nukleáris RNS-ek (snRNS-ek)

Miután az intronok léte nyilvánvalóvá vált, a következő kérdés az volt, hogy milyen mechanizmussal vágódnak ki nukleotidpontossággal az intronok. A kutatók első megközelítésképpen pre-mRNS szekvenciákat hasonlítottak össze (melyekben az exon–intron határokat már ismerték). Az illesztésekből kirajzolódott a konzervált bázisok helye és milyensége: az intronok 5’ végén GU, a 3’ végén AG, és ez utóbbitól 15–45 nukleotiddal upstream konzervált A nukleotid mindig jelen van (7.13. és 7.14. ábra). E három hely környezetében lévő más nukleotidok konzerváltsága is megfigyelhető (de nem ennyire erős). A konzervált bázisok jelenléte az exon–intron határokon arra utalt, hogy léteznie kell olyan celluláris „gépezetnek”, mely információként használja ezeket a jeleket, és az exonok splicingját (összekapcsolását) véghezviszi. Mint a tudományban sok más esetben is, a splicing elemek első megfigyelése is a véletlennek köszönhető. Joan Steitz autoimmun betegségben szenvedő páciensek vérének vizsgálata közben olyan antitestet talált, mely egy nagy molekuláris komplexhez kapcsolódott. Ez a nagyméretű molekuláris komplex kisméretű RNS-eket és fehérjéket tartalmazott. Mivel ezt a riboprotein komplexet sejtmagból izolálták, az RNS-komponenseket kis nukleáris RNS-knek (snRNAs, umall nuclear RNAs) nevezték el. Később kiderült, hogy az snRNS-ek komplementer szakaszokat hordoznak az exon–intron határok környezetével, és így összefüggésbe hozták ezeket a splicinggal. Mai tudásunk szerint a transzkriptum konzervált szakaszait öt snRNP (snRNS+proteins) komplex ismeri fel, melyek fehérjéket és az öt snRNS (U1, U2, U4, U5, U6) egyikét tartalmazzák. Száznál több további fehérje vesz még részt a folyamatban. Ezek az elemek együttesen alkotják az intronok eltávolítását végző molekuláris gépezetet, a spliceoszómát (7.12. ábra). A spliceoszóma komponensei kölcsönhatásban állnak az RNS-polimeráz CTD-részével, és így kerülnek közel a készülő RNS lánchoz már a transzkripció befejezése előtt (7.12. ábra). A splicing tehát ko-transzkripcionálisan megy végbe (ily módon a 7.10. ábra nem teljesen hűen tükrözi a valóságot, mert a poliA farok létrejötte előtt már kivágódhatnak az intronok). Ez mikroszkóposan is megfigyelhető (7.12. ábra).

7.12. ábra - Egy génről egyszerre több RNS-transzkriptum képződik, ez mikroszkóposan fenyőfára emlékeztető struktúraként jelenik meg (a „fa teteje” a gén elejének, „alja” a gén végének felel meg, egyre hosszabb „ágakkal”, vagyis leváló transzkriptumokkal). A splicing ko-transzkripcionálisan zajlik, ez a bal oldali felvételen megfigyelhető.

Egy génről egyszerre több RNS-transzkriptum képződik, ez mikroszkóposan fenyőfára emlékeztető struktúraként jelenik meg (a „fa teteje” a gén elejének, „alja” a gén végének felel meg, egyre hosszabb „ágakkal”, vagyis leváló transzkriptumokkal). A splicing ko-transzkripcionálisan zajlik, ez a bal oldali felvételen megfigyelhető.

A splicing kémiailag két transzészterifikálási reakciót jelent. Az első reakcióhoz az elágazási ponton (branch point) lévő konzervált A nukleotid ribózegységének 2’ –OH csoportja szükséges. Az első transzészterifikálás következtében az intron lasszóra emlékeztető szerkezetet alkot. Az intron lasszóstruktúra a második transzészterifikálást követően kivágódik, majd lebomlik (7.13. és 7.14. ábrák).

7.13. ábra - A splicing folyamatának áttekintése

A splicing folyamatának áttekintése

7.14. ábra - A splicing két egymást követő transzészterifikálási reakcióval valósul meg

A splicing két egymást követő transzészterifikálási reakcióval valósul meg

Self-splicing intronok és „RNS-világ”

Átütő felfedezés született 1981-ben Tom Cech és munkatársai jóvoltából. Leírták, hogy a Tetrahymena állati egysejtű (melyet a telomerkutatás kapcsán már említettünk) egyik rRNS-ének elsődleges transzkriptumából egy 413 nukleotid hosszúságú intron szakasz kémcsőben, fehérjék nélkül, önkatalizált módon képes kivágódni. Ma már több, hasonló tulajdonsággal rendelkező, ún. self-splicing intront ismerünk. Ezek az ismeretek az snRNS-k splicingban betöltött szerepének felülvizsgálatára késztették a kutatókat. A legfrissebb kísérleti eredmények arra utalnak, hogy a spliceoszómában az intronok eltávolítását nem a fehérjekomponensek katalizálják, hanem az snRNS-ek. Később látni fogjuk, hogy mai tudásunk szerint egy másik RNS–fehérje gépezet, a riboszómák működésében is igen fontos katalitikus szerepük van a riboszóma RNS komponenseinek a fehérjeszintézis során. A katalitikus funkcióval rendelkező RNS-eket ribozimeknek nevezzük. Létük hívta életre az „RNS-világ” teóriát, mely szerint a földi élet kialakulása során az első sejtek genetikai anyaga RNS lehetett, mivel ez a molekula képes genetikai információ tárolására és egyúttal biokémiai reakciók katalizálására is.

Alternatív splicing

A humán genom körülbelül 20000 fehérjekódoló gént tartalmaz (ami csak körülbelül kétszerese egy hengeresféreg génjei számának), a humán fehérjék összesége, a proteom viszont százezres nagyságrendben tartalmaz fehérjéket. Ez csak úgy lehetséges, ha egy génben kódolt információ egynél több fehérje szerkezetét is képes meghatározni. Ez többek között az alternatív splicing segítségével valósul meg, melynek során egy elsődleges transzkriptumból több különböző mRNS és ennek megfelelően több különböző fehérje képződik. Míg az alternatív splicing igen ritka a növények körében, addig a humán gének több mint 70%-áról képződik alternatív splice termék. Hangsúlyozni kell, hogy az alternatív splicing során képződő fehérjetermékek egymáshoz hasonlóak, hiszen ugyanazon elsődleges transzkriptum alapján készülnek. Ezek az alternatív szerkezetű fehérjék általában különböző sejttípusokban vagy eltérő fejlődési stádiumokban keletkeznek. A lehetséges alternatív splicing mechanizmusokat szemlélteti a 7.15. ábra.

7.15. ábra - Alternatív splicing formák

Alternatív splicing formák

Az eukarióta tRNS-ek érése

A tRNS-ek is átesnek érési folyamatokon (7.16. ábra). Ezek leggyakrabban az alábbiak:

  • Az 5’ végi szekvencia eltávolítása

  • A 3’ végi két nukleotid cseréje CCA szekvenciára (ez minden tRNS-molekulára jellemző, ehhez a részhez kapcsolódik a tRNS által a fehérjeszintézis helyére szállított aminosav).

  • Meghatározott bázisok kémiai módosítása

  • Intronok eltávolítása

Az érett tRNS-t síkban ábrázolva lóhere levélre emlékeztető szerkezetet látunk (7.16. ábra). Ez a jellegzetes másodlagos szerkezet intramolekuláris bázispárosodások következtében alakul ki.

7.16. ábra - Egy tRNS-prekurzor és érett formája

Egy tRNS-prekurzor és érett formája

Az eukarióta rRNS-ek érése

A riboszómális RNS-gének egy része (18S, 5,8S és 28S) egy transzkripciós egységet alkot, és a genomban ezek az egységek egymás mellett többször ismétlődnek (ún. tandem ismétlődés, lásd a Sejtbiológiai tanulmányokban a nucleolust). Az rRNS-gének átírását az RNS-polimeráz I enzim végzi. Egy transzkripciós egységről egy olyan primer transzkriptum képződik (45S), mely a három rRNS-szekvenciát tartalmazza TS (transcribed spacer, átíródó elválasztó) szakaszokkal elválasztva egymástól. Az érés során a TS-szakaszok kivágódnak és előáll a háromféle rRNS-molekula (7.17. ábra).

7.17. ábra - Eukarióta rRNS-ek érése

Eukarióta rRNS-ek érése