Ugrás a tartalomhoz

Genetika és genomika

Falus András, László Valéria, Tóth Sára, Oberfrank Ferenc, Pap Erna, Dr. Szalai Csaba (2014)

Typotex Kiadó

Betegségek genomikai hátterének vizsgálati módszerei

Betegségek genomikai hátterének vizsgálati módszerei

Genetikai variációk szerepének vizsgálata betegségekben

Két fő típust különböztetünk meg:

  • Hipotézis, prekoncepció által irányított; pl. jelölt génasszociációs vizsgálat, gének szekvenálása stb. (általában a genetikai módszerek)

  • Hipotézismentes; pl. teljes genomszűrés, teljes genomasszociációs vizsgálat (genome wide association study = GWAS), teljes genomszekvenálás, mikroarray mérések (genomikai módszerek)

A betegségek genetikai hátterének kiderítésében, új gyógyszercélpontok keresésében, a személyre szabott gyógyászatban, azaz a gyógyszerkutatásban nagyon fontosak a genetikai variációk, hiszen számos kutatás igazolta, hogy a különböző betegségekre való hajlamban, vagy a gyógyszerekre való válaszban döntő jelentőségűek. A molekuláris genetika fejlődésével lehetőség nyílt ezek vizsgálatára is, hiszen már a HGP-ben is rengeteg variációt azonosítottak, majd több nagy, nemzetközi projekt is ezek felderítését tűzte ki célul (pl. Human Variome Project, HapMap, 1000 Genome project).

Kezdetben a legnépszerűbbek az ún. jelölt (vagy kandidáns) génasszociációs vizsgálatok voltak. Ezekben a vizsgálatokban olyan géneket választottak ki, amelyekről tudták, hogy szerepet játszanak a betegség kialakulásában, bennük genetikai variációkat kerestek, majd összehasonlították azok gyakoriságát beteg és egészséges populációban. Rengeteg ilyen vizsgálat történt a különböző betegségekben. Előnyük, hogy relatív olcsóak, egyszerűek, könnyű értékelni őket és jól magyarázható eredményeket adnak.

Ezekkel a vizsgálatokkal azonban számos probléma volt, illetve van. Először is ismerni kell hozzá a betegség patomechanizmusát, azaz új gének (új gyógyszercélpontok, új patomechanizmusok) felfedezésére nem alkalmas. Másodszor, különböző okok miatt számos hamis pozitív eredmény született, és az eredményeket később más vizsgálók más populációkban nem tudták reprodukálni. Végül, például az is problémát jelentett, hogy a korai módszerekkel általában egyszerre egy, vagy csak néhány variációt tudtak vizsgálni, és már akkoriban ismert volt, hogy az ún. multifaktoriális, vagy gyakori betegségekben (pl. cukorbetegség, atherosclerosis, magas vérnyomás, asztma stb.) több száz genetikai variáció egymásra hatásából alakul ki az a genetikai hajlam, amely a környezeti faktorok hatására végül betegséghez vezet.

10.1. ábra - A nyilvános SNP-adatbázis növekedése. 2009 és 2010-ben az 1000 genom projekt 8,5 millió új SNP-t talált a megszekvenált, különböző etnikumú genomokban [10.4]

A nyilvános SNP-adatbázis növekedése. 2009 és 2010-ben az 1000 genom projekt 8,5 millió új SNP-t talált a megszekvenált, különböző etnikumú genomokban 10.4

Az első és az utolsó probléma megoldására a teljes genomszűrés módszerét fejlesztették ki, amelyet kapcsoltsági vizsgálatoknak is szoktak nevezni. Ebben általában beteg testvérpárral (ASP = affected sib pair) rendelkező családokban a genom teljes területén nagyjából egyenletesen elosztva variábilis mikroszatellita markereket határoztak meg, és azt nézték, hogy a betegekben milyen genomterületeken tér el a markerek eloszlása a várttól. A markerekhez valószínűségi értékeket rendeltek (LOD score), azaz, hogy milyen eséllyel asszociálnak a betegséggel (LOD = logarithm of odds, annak az esélynek a 10-es alapú logaritmusa, hogy két lókusz genetikailag kapcsolt, összehasonlítva annak az esélyével, hogy nem kapcsolt. Pl. LOD = 3 azt jelenti, hogy 1000-szeres a valószínűsége (103) annak, hogy két lókusz együtt öröklődik, mint annak, hogy nem.). A módszer számos értékes és hasznos eredményt hozott, új gének felfedezéséhez vezetett, de számos probléma volt vele. Az egyik, hogy a mikroszatelliták meghatározása, ahol az ismétlődések pontos számát kell meghatározni, nagyon munka- és időigényes és drága is. Ezért egy-egy vizsgálatba csak néhány száz mikroszatellitát tudtak bevonni, ami azt jelentette, hogy az egyes mikroszatelliták egymástól nagyon távol (általában kb. 10 cM-ra) estek. Ebből kifolyólag viszonylag kicsi volt az esély, hogy egy betegség lókusszal egy mikroszatellita kapcsoltságban legyen, azaz vele egyszerre öröklődjön. Ebből kifolyólag a legtöbb betegséghez kapcsolható variáció elveszett. A drágaságon és a nagy munkaigényen kívül még olyan problémák is voltak pl., hogy nehéz volt a mintagyűjtés (nehéz megfelelő számú, együttműködésre is hajlamos szülőkkel rendelkező beteg testvérpárt gyűjteni).

GWAS

A 2000-es évek fejlesztései során kiderültek, hogy az SNP-k kimutatása automatizálható, és óriási mennyiségben lehet őket egyszerre meghatározni. Párhuzamosan több cég is olyan rendszereket fejlesztett ki, amelyekben egyetlen chippel, vagy array-vel több 100 ezer SNP-t lehet meghatározni. A versenyben a meghatározások árát is sikerült erősen leszorítani. Ma már a több 100 ezer variációt kimutatni képes chipek ára 100 $ nagyságrendű. A chipfejlesztések során derült ki, hogy az SNP-k mellett nagy jelentőségük van a CNV-knek is. A cégek gyorsan reagáltak. Az időközben felfedezett CNV-kre jellemző markerek pillanatok alatt belekerültek a vizsgálatokba.

Jelenleg két vezető cég van a piacon. Az egyik az Affymetrix, melynek a 6.0 array-e 906 ezer SNP-t és 946 ezer CNV-re jellemző markert tartalmaz. A másik az Illumina, melynek jelenleg legfejlettebb terméke a HumanOmni5BeadChip, amely 4,3 millió lókuszt jellemez, mely SNP-ket és CNV-ket is tartalmaz, ráadásul egy chippel egyszerre 8 mintát, mindössze 200 nanogramnyi DNS-ből képes mérni. Közben más technikákban, így például a DNS-szekvenálásban is óriásit fejlődött a tudomány. Ennek folyományaként olyan projektek indultak, mint pl. az 1000 genom projekt, amely különböző etnikumú populációkhoz tartozó, összesen 2500 ember megszekvenálását tervezi [10.4]. A projekt már rengeteg új genetikai variációt tárt fel (10.1. ábra). Ezeknek a felhasználásával készült a fent említett Illumina chip, amely gyakorlatilag minden olyan variációról tartalmaz információt, melynek a populációs gyakorisága (a megszekvenált afrikai, ázsiai és európai populációkban) nagyobb, mint 1%.

A GWAS-vizsgálatok általában úgy történnek, hogy a fenotípusos jellel (pl. beteg) rendelkező, illetve kontrollpopulációt genotipizálnak, azaz a fent említett chipek segítségével >100 ezer SNP-t meghatároznak, majd megkeresik, hogy melyik marker gyakorisága különbözött a két populáció között. A statisztikai módszerek fejlődésével már folytonos változókat is fel lehet használni GWAS-okban. Például a vércukorszinttel, vagy vérnyomással asszociáló genetikai markerek keresésénél már nincs szükség két jól elkülöníthető populációra. Ha statisztikailag szignifikáns összefüggést találnak, akkor azt mondják, hogy a marker kapcsolt a jelleghez. Ez legtöbbször két dolgot jelenthet: [10.1] a marker a funkcionálisan befolyásolja a jelleget (pl. fehérjefunkciót vagy struktúrát, genom 3D-struktúrát, génexpressziót); [10.2] a markerhez genetikailag kapcsolt (vele általában együtt öröklődő) szekvenciavariáció a jelleg funkcionális oka (ld. még 11. fejezet). A módszer a hipotézismentes módszerek közé tartozik, azaz végrehajtása nem igényel előzetes genetikai tudást a jellegről.

Napjainkban a GWAS óriási lehetőségeket nyújt a multifaktoriális jellegek genomikai hátterének tisztázására, amit a különböző kutatócsoportok gyakorlatilag rögtön ki is használtak. Mivel ezek az eredmények nagy valószínűséggel valós összefüggéseket mutatnak, pl. a betegségek patomechanizmusának új aspektusait mutatják be, létrehoztak egy weboldalt is, amelyre összegyűjtve felkerülnek az eredmények (A Catalog of Published Genome-Wide Association Studies (http://www.genome.gov/gwastudies/)). Erre olyan vizsgálatoknak az eredményei kerülhetnek fel, amelyekben minimum 100 ezer SNP-t vizsgáltak, és csak olyan SNP-k, melyekre a p érték 9,5x10-6, azaz ekkora a tévedés esélye. Az eredmények mennyiségére jellemző, hogy 2008. november 25. és 2011 novembere között 1062 publikáció és 5267 SNP került fel az oldalra.

GWAS-eredmények értékelése

A GWAS-eredmények értékelése különösen nagy kihívás elé állította a bioinformatikusokat. Mint ahogy már korábban is írtuk, a hamis pozitív állítás elkerülése miatt nagyon szigorú statisztikai szabályokat kellett bevezetni az eredmények értékelésénél. A legegyszerűbb, és legtöbbször használt a Bonferroni-korrekció, amikor a 0,05-ös p-értéket osztjuk a vizsgált SNP-k számával, és akkor mondjuk, hogy egy SNP asszociál, ha a rá kapott p-érték ennél az értéknél kisebb. Ennek teljesülésekor azt mondjuk, hogy az SNP genomszintű asszociációt mutatott. Ez pl. 1 millió SNP esetén 5 x 10-8. Ennek eléréséhez, viszont a multifaktoriális betegségekre jellemző gyenge hatású variánsok miatt sokszor 100 ezres nagyságrendű populációkat kell vizsgálni, amelyet egyes betegségeknél nagyon nehéz, vagy nem is lehet elérni. Ezen probléma elkerülésének az egyik módszere, hogy több kisebb populációt külön-külön vizsgálnak, pl. úgy, hogy az első teljes GWAS-ban kiválasztják a legjobban asszociáló x darab (x = 25-120) SNP-t, és az ismétlő populációkban (replication cohorts) már csak ezeket nézik. Mivel az egyes populációkban kapott p-értékek összeszorzódnak, ráadásul a Bonferroni-korrekciót is csak x-szel (mondjuk 100-zal) kell végezni, így megnő az esélye, hogy pozitív asszociációt találjanak. Ezekben a vizsgálatokban az első elemzés a kritikus, hiszen ilyenkor kell „elkapni” az asszociáló SNP-ket, és a nagy mennyiségű adat miatt itt merülnek fel azok a nehézségek, amelyekről a 2. fejezetben szóltunk, azaz pl. a többszörös tesztelés problémája (Bonferroni-korrekció), vagy az SNP-SNP kölcsönhatások óriási mennyisége. Ennek a vizsgálatnak az is az előnye, hogy így két vagy több független populáción is validáljuk az eredményeinket, így nagymértékben lecsökkenthetjük a hamis pozitív eredményeket. Hátránya, hogy a hamis negatív eredmények száma is nőhet. Az előny viszont túlkompenzálja a hátrányt, hiszen egy hamis pozitív eredmény sokszor több év felesleges kutatásait vonja maga után, annak minden költség-, munka- és idővonzatával együtt. Emiatt a jelentősebb újságok ma már megkövetelik, hogy az asszociációs vizsgálatok eredményeit legalább egy független populáción validálni kell.

Egy másik lehetséges megoldás az útvonal-analízis[5]. Itt a géneket aszerint, hogy az általuk kódolt fehérjék milyen anyagcsere-útvonalban szerepelnek, funkcionális kategóriákba sorolják. Ebben két fontos adatbázis áll rendelkezésre: a GO, azaz Gene Ontology (http://www.geneontology.org/), illetve a KEGG, azaz Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (http://www.genome.jp/kegg/). Ezután egy megfelelő szoftverrel (pl. ALIGATOR) azt nézik, hogy az útvonalon levő egyes génekben genotipizált szignifikáns variánsok feldúsulnak-e az egyes útvonalon. Azaz azt vizsgálja a szoftver, hogy az egyes útvonalakon talált asszociált SNP-k eloszlása hogyan tér el a várt eloszlástól. Ha egy útvonalon sok olyan gén van, amelyben szignifikánsan asszociáló SNP-k vannak, akkor az az útvonal szerepet játszhat a betegségben, vagy egyéb jellegben. Fontos persze, hogy itt az egyes SNP-kre a szignifikanciahatár nem a genomszintű szignifikanciaérték, hanem annál nagyságrendekkel magasabb. A Bonferroni-korrekciót itt általában a tanulmányozott útvonalak számával végzik.

Hasonló a Gene set enrichment analysis (GSEA), amelyet először a génexpressziós eredmények értékelésére fejlesztettek ki. Itt előre meghatározott „génszetteket” elemeznek, és azt nézik, hogy az egyes génszettekben hány gén asszociál az adott fenotípussal, és eszerint rangsorolják az egyes génszetteket.

Ezeknél a vizsgálatoknál felmerül, hogy az olyan SNP-k, amelyek nem génben találhatóak, hová sorolhatók? Itt az egyes statisztikusok más-más stratégiát követnek. Az egyik ilyen, hogy a nem génben található SNP ahhoz a génhez tartozik, amelyik az SNP-től 20 kilobázison (kb) belül található. Ha több ilyen gén is van, akkor mindegyikhez tartozik. Ha nincs ilyen gén, akkor az SNP kiesik ebből az elemzésből.

Ezekkel a módszerekkel több, már a hagyományos módszerrel elemzett GWAS-t értékeltek újra, és pl. magas vérnyomásban számos addig ismeretlen, a vérnyomás szabályozásában addig nem ismert anyagcsere-útvonalat fedeztek fel.

Parciális genomszűrések

A teljes genomszűrések mellett ezek egyszerűbb változatai is gyakran kerülnek alkalmazásra. Ilyen pl. a kapcsoltsági analízisek után elvégzett parciális genomszűrés, vagy jelölt régió asszociációs vizsgálat. Itt a korábbi vizsgálatokban LOD-csúcsokat adó markerek közelében nagyobb sűrűségű újabb markerekkel, általában SNP-kkel végeznek asszociációs vizsgálatot (partial genome association study, vagy PGAS). Előnye, hogy jóval kevesebb adatot kell elemezni, így a statisztikai nehézségek jó része megoldódik.

Egy másik lehetőség, hogy a betegségben szerepet játszó szövetben, esetleg állatmodellek segítségével elvégzett teljes mikroarray génexpressziós mérés után, az eltérő expressziót mutató gének közül a kiválasztottakban végeznek SNP-asszociációs vizsgálatot.

Pozicionális klónozás

Pozicionális klónozásnak nevezzük azt a technikát, amikor pl. a kapcsoltsági vizsgálatoknál az asszociált genomrégiókat különböző újabb markerekkel tovább szűkítjük, majd pl. in silico és laboratóriumi módszerekkel (pl. génexpressziós mérés, DNS-szekvenálás, funkcionális vizsgálatok) megkeressük az asszociációért felelős gént, és annak mutációját.

Részletesebben: http://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_screen#Positional_cloning.

Személyre szabott genomika

Személyre szabott genomikáról beszélünk, amikor a genomikai eredményeket egy adott személyre alkalmazzuk.

A szigorúan vett tudományos kutatások mellett sokan hamar felismerték, hogy a GWAS vagy az NGS kapacitását, eredményeit profitorientált módon is értékesíteni lehet. H amarosan megjelentek a személyre szabott genomika (personal genomics) jelszavát a zászlójukra tűző, az eredményeket közvetlenül a felhasználó számára rendelkezésre bocsátó cégek (angolul direct to consumer, vagy DTC-szolgáltatás; 10.1. táblázat). Ennek az egyik legismertebb példája a 23andMe cég [6]. A cégnél a feltételektől függően 99–399 $ között lehet a szolgáltatást megrendelni. Ekkor elküldenek egy kisebb tartályt egy részletes útmutatóval. A tartályban a nyálunkat kell visszaküldeni, amelyből DNS-t vonnak ki, majd az Illumina egyik chipje segítségével kb. 1 millió SNP-t határoznak meg benne. Az eredményeket kielemezve 6-8 hét múlva kapjuk meg. Olyan információkat kaphatunk, mint pl. a genomunk milyen etnikumú genomok keveredéséből származik; ha családunk több tagjának a mintáját beküldtük, meghatározzák, hogy a genetikai hátterük milyen arányban egyezik, különbözik (pl. testvérek unokatestvérek, távolabbi rokonok stb.). Értesítést kaphatunk, ha velünk rokonságban állókat találtak; különböző híres emberekkel hasonlítják össze a genomunkat; a jelenlegi tudományos ismeretek birtokában 198 betegségről becslést kapunk, hogy az átlagpopulációhoz képest nagyobb vagy kisebb kockázattal rendelkezünk; vagy a genomunk hogyan befolyásolja különböző gyógyszerekre való reagálásunkat stb.

10.1. táblázat - Jelentősebb cégek, melyek orvosi és más célokból genomikai tesztek elvégzését, és az eredmények értékelését kínálják

Cég Szolgáltatás Ár
23andMe Kb. 1 millió SNP meghatározásából 178 betegség genetikai kockázatáról egy becslés, illetve származás- és rokonságelemzés 399 $, vagy 99 $ + 9$/ hónap előfizetés az újabb eredményekre
deCODEme Illumina Human 1M BeadChip, mely >1 millió SNP-t detektál, 47 betegség, származás 2000 $
Knome Illumina genomszekvenáló platform; az eredmények értelmezése 39 500 $
Existence Genetics Saját fejlesztésű chip; 700 betegség és jelleg; javaslatok a betegségek megelőzésére 350 $
Navigenics Affymetrix 6.0; 900 000 SNP; szigorú tudományos követelmények, 28 betegség, 12 gyógyszerre való reagálás 999 $

Amint az várható is volt, a közvetlenül a megrendelőnek, sőt „laikusoknak” eladott genetikai teszteredmények számos jogi és etikai problémát vetettek fel. Ez kifejezetten igaz akkor, amikor a különböző betegségekre való hajlamról van szó. Ilyen problémák például, hogy joga van-e egy profitorientált magáncégnek ilyen típusú orvosi jellegű diagnózist kiadni, illetve, hogy mit kezd egy ember egy olyan információval, hogy bizonyos betegségre az átlagosnál egy kicsit emelkedettebb hajlama van? A váratlan, gyors technikai fejlődés, és a hozzá kapcsolódó szolgáltatás a törvényhozókat is váratlan helyzet elé állította. Erre jellemző, hogy például Kalifornia 2008 júniusában levelet küldött 13 ilyen cégnek, amelyben felszólította a cégeket, hogy állítsák le ezeknek a teszteknek az eladását kaliforniai lakosok számára, és bizonyítékokat kért arra vonatkozólag, hogy a cégek megfelelő szabályozással és engedélyekkel rendelkeznek [10.7]. Az elmúlt években a cégek idomultak a meglevő szabályozásokhoz, és pl. Kaliforniában is engedélyezték működésüket, bár hozzá kell tenni, hogy a törvényhozás, illetve szabályozások egyelőre nem tudtak lépést tartani az új kihívásokkal. Pl. az USA-ban egyetlen törvény született ezekkel a tesztekkel kapcsolatban, amely azt mondja, hogy eredményeiket biztosító cégek, illetve munkaadók semmilyen módon nem vehetik figyelembe.

A cégek hangsúlyozzák, hogy az általuk adott információ nem helyettesíti a szakorvosi tanácsot, diagnózist vagy kezelést. Például a 23andMe olyan dokumentumot irat alá a megrendelővel, amely tartalmazza, hogy a kapott információ nem szolgál betegség vagy más állapot diagnózisára, megakadályozása, vagy kezelésére, és a szolgáltatás kizárólag oktatási és kutatási célokat szolgál.

Sokan tartottak attól, hogy az olyan információk, hogy az illetőnek valamilyen súlyos, esetleg kezelhetetlen betegségre az átlagosnál nagyobb hajlama van, károsan befolyásolja az illető pszichés állapotát, például depressziós lesz. Érdekes módon, az ezzel kapcsolatos felmérések semmi ilyesmit nem mutattak ki. Valószínűleg ez kicsit hasonlít ahhoz, mint amikor a dohányos vagy elhízott ember is tudja, hogy számos betegségre megnő a hajlama. Sőt, mivel feltehetőleg az átlagosnál egészségtudatosabb emberek kérnek ilyen információkat, inkább pozitív hatásokat tapasztaltak. Azaz, a kapott eredmények hatására egyes emberek tudatosan megelőző lépéseket tettek, vagy egészségesebb életformára tértek át.

Újgenerációs szekvenálás (NGS)

Részleteket ld. a 8. fejezetben.

Az NGS jelenleg még túl költséges több alkalmazáshoz, és nehezen kezelhető, nagy mennyiségű adatot ad. Ezért sokszor ennek redukált formáit használják. Ilyen pl. az exomszekvenálás, amikor csak a fehérjét kódoló gének exonjait szekvenálják meg, ami kb. 30 Mb, a teljes genom 1%-a. Ld.: http://en.wikipedia.org/wiki/Exome_sequencing. Becslések szerint a monogénes betegségeket okozó mutációk 85%-a található itt. Hátránya persze, hogy más funkcionális szekvenciákról nem kapunk információt, és az eddigi GWAS-eredmények alapján a multifaktoriális jellegekért (pl. betegség) felelős variációk 93%-a a proteinkódoló régiókon kívül esik. Viszont az erős hatású ritka variánsok többsége valószínűleg itt található.

Az ENCODE projektben egyik központi módszer volt a DN-ase-seq (8. és 9. fejezetek). A módszer azon alapszik, hogy a DN-áz I enzim könnyebben emészti az „élő” kromatin helyeket, azaz ahol nem-hiszton szabályozó fehérjék (transzkripciós faktorok, enhancerek) kötődnek a genomhoz. Ezután az emésztési pontot megszekvenálják. Ezzel a módszerrel lehet a transzkripciós faktorok és az enhancerek kötődési helyeit meghatározni. Az ENCODE projekt eredményei alapján ezek a helyek nagyrészt sejtspecifikusak.

ChIP-seq: Kromatin immunprecipitáció, majd szekvenálás. A DNS-hez asszociált fehérjéket formaldehiddel reverzibilisen keresztkötik a DNS-hez, majd a DNS-darabolás (emésztése) után a kérdéses fehérje ellen termelt antitesttel „kihalásszák”, pl. úgy, hogy az antitestet egy oszlopban szilárd hordozóhoz kötik, vagy mágneses részecskéhez rögzítik. Az így kiszedett fehérje-DNS hibridben a keresztkötést felbontják (pl. melegítéssel), és a DNS-t megszekvenálják. Ezzel a módszerrel is azt lehet meghatározni, hogy az egyes, pl. szabályozó fehérjék hová kötődnek a genomban.

Génexpresszió-mérés

A harmadik nagy jelentőségű módszer, amely alkalmas a genom vizsgálatára, amelynek fontos szerepe van a gyógyszerkutatásban, és itt röviden ismertetjük, az a génexpresszió-mérés. Mint tudjuk, a különböző sejtjeink genomja megegyezik egymással. Amiben mégis különböznek, az az expresszált, vagyis működő gének halmaza. A sejtek működéséről sok információt kaphatunk, ha ismerjük a bennük működő géneket, azaz melyik gén milyen arányban íródik át, expresszálódik. Ez egy adott szövet esetén is eltérhet, attól függően, hogy éppen milyen állapotban van, milyen hatások érik. Például egy asztmás tüdőben, vagy egy atherosclerotikus plakkban más a génexpresz-sziós mintázat, mint egy egészséges szövetben. Ugyanígy a sejtekre ható külső hatások, pl. a gyógyszerek is, megváltoztatják a sejt génexpressziós mintázatát.

A fejlődés itt is azt az utat járta be, mint a DNS-variációknál. Először egyesével, elég bonyolult módon próbálták meg kvantifikálni a gének működését, majd a magyar származású Stephen Fodor révén az Affymetrix cég 1996-ban kezdte el forgalmazni génexpressziós chipjeit (mikroarray). Azóta más cégek (pl. az Agilent, Illumina) is megjelentek a piacon, és a mikroarray-alapú módszerek egyre inkább kezdik levetkőzni gyermekbetegségeiket. Kezdetben ugyanis sok problémát jelentett a nagy mérési pontatlanság, a nehezen reprodukálható és értékelhető eredmények, valamint a módszerek magas ára. Jelenleg az árak a kiindulásiakhoz képest drasztikusan lecsökkentek, a folyamatos fejlesztésekkel a mérések pontossága, reprodukálhatósága is sokat javult, és az adatok értékelése is rengeteget fejlődött az elmúlt években. Egy Agilent chip 44 ezer transzkriptumot tud mérni, sőt egyes termékeken (pl. 4x44K chip) párhuzamosan több különböző mintát is lehet vizsgálni. Szerte a világon, így Magyarországon is, több szolgáltatólabor működik ahol viszonylag olcsón, teljes génexpressziós mintázatot lehet, ma már elég pontosan, mérni, azaz nem is kell feltétlenül megvenni a drága leolvasót. A bioinformatika fejlődésével pedig a nem matematikusvénával rendelkező kutatók is értékes eredményeket tudnak kihozni a több 10 ezer, elsőre igen kaotikusnak tűnő számadatból, amely egyetlen méréshez tartozik.

A nagy áteresztőképességű módszerek közé az utóbbi időben felzárkózott az NGS-technikát felhasználó RNS-szekvenálás (http://en.wikipedia.org/wiki/RNA-Seq) is. A módszer előnye, hogy a transzkriptum mennyiségének mérése mellett olyan információkat is kaphatunk, mint pl., hogyan expresszálódnak a gén különböző alléljai, detektálhatóak a poszttranszkripciós mutációk vagy a génfúziók. Mivel a módszer a génexpresszió kvantifikálása (mérése) mellett pluszinformációkat ad, ha az ára megfelelő mértékben lecsökken, ki fogja szorítani a mikroarray-alapú módszert.

Egyéb mikroarray-alapú módszerek

A technika, illetve a tudásunk fejlődésével számos egyéb termék nőtt ki a génexpressziós chip módszeréből. A miRNS-ek felfedezése után rövidesen megjelentek a piacon a miRNS chipek, a komparatív genomhibridizációval (CGH; http://en.wikipedia.org/wiki/Comparative_genomic_hybridization), pedig pl. CNV-ket lehet mérni, vagy vizsgálni lehet a tumorokban keletkező nagyobb genomikai átrendeződéseket. A ChIP-on-chip array termékkel (http://en.wikipedia.org/wiki/ChIP-on-chip), amely a ChIP-seq mikroarray változata, monitorozni lehet, hogy a génexpresszió szabályozásában részt vevő fehérjék hová kötődnek.

Az újgenerációs szekvenálás, illetve a mikroarray-alapú módszerek fejlődésével egyre nagyobb hatékonysággal lehet a metilációs mintázatot is meghatározni. Mint korábban említettük, a DNS metilációja leggyakrabban a CpG dinukleotid citozin bázisán történik, ahol a ’p’ a két bázist összekötő foszfodiészter csoportra utal. A citozin metilációja az 5. szénatomon történik. A legelterjedtebb módszereknek az az alapjuk, hogy ha a DNS-t nátrium biszulfittal (NaHSO3) kezeljük, az a metilálatlan citozint uracillá alakítja (UpG). Ezután szekvenálással vagy mikroarray segítségével összehasonlítják a kezelt és a kezeletlen DNS-t. Ahol maradt a citozin a kezelés után, ott a DNS metilálva volt.

A traszkriptom térképezés (mapping) technikával, lokalizálni lehet az expresszálódó géneket a genomban. Ez utóbbi módszerek a „tiling array” módszercsaládba tartoznak (http://en.wikipedia.org/wiki/Tiling_array), de ugyanazzal a leolvasóval lehet őket értékelni, és hasonló elven működnek, mint a hagyományos génexpressziós chipek.

Az NGS egyre olcsóbbá, gyorsabbá és precízebbé válásával a mikroarray-alapú módszerek lassan kezdenek kiszorulni.