Ugrás a tartalomhoz

Genetika és genomika

Falus András, László Valéria, Tóth Sára, Oberfrank Ferenc, Pap Erna, Dr. Szalai Csaba (2014)

Typotex Kiadó

Állatmodellek

Állatmodellek

Állatmodellek előnyei

A multifaktoriális betegségek genomikai hátterének, patomechanizmusának megismerésében nagyon fontos szerepet töltenek be az állatkísérletek, állatmodellek. Vannak olyan betegségek (pl. asztma, atherosclerosis), amelyek patomechanizmusában a molekuláris és sejtszintű tudásunk nagy részét állatkísérletek révén nyertük.

Nézzük meg, milyen előnyei vannak ezekben a vizsgálatokban az állatok használatának:

  • A kísérleti állatok általában szabadon keresztezhetőek. Az emberrel szemben itt lehetőségünk nyílik több generáción keresztül a genetikai háttér és a fenotípus közötti összefüggéseket vizsgálni, ezzel kapcsolatban sokkal könnyebb QTL-vizsgálatokat elvégezni. Az egérnek pl. 2 hónap a generációs ideje, szemben az ember 20-30 évével. Irányított keresztezésekkel nyomon lehet pl. követni, hogy egy genetikai marker milyen QT-val, fenotípussal asszociál, szegregál stb.

  • Különböző egértörzsek állnak rendelkezésre, amelyek fenotípusban (pl. betegségre való hajlamban) különböznek egymástól. Ezeket egyrészt fel lehet használni betegségmodellként, vagy keresztezésekkel vizsgálhatjuk a fenotípus és a genotípus szegregációjának összefüggését. Ezeket az állatokat szigorúan kontrollált körülmények között tarthatjuk, szemben az emberrel, ahol a vizsgálatban résztvevők előéletét, környezetét, táplálkozását stb. nem lehet pontosan ismerni, kontrollálni.

  • Génszinten az ember nem különbözik jelentősen a többi élőlénytől. A legfontosabb alapgének gyakorlatilag minden élőlényben megtalálhatók. Az emlősökhöz különösen hasonlít az ember génszinten, pl., az egérgenom csak 300 génben különbözik az emberétől, de sok vizsgálatban alacsonyabb rendű állatokat is eredményesen használhatunk, pl. gyümölcslegyet (Drosophila melanogaster), vagy a Caenorhabditis elegans nevű fonalférget elterjedten használják genetikai vizsgálatokban. Érdekesség, hogy ez a kis állat „kétszeres Nobel-díjas”, hiszen mind a szervfejlődés és a programozott sejthalál genetikai szabályozásával, mind az RNS-interferencia leírásával kapcsolatban tanulmányozóit Nobel-díjjal tüntették ki.

  • Embereken nyilvánvaló etikai okokból csak nagyon korlátozottan lehet kísérletezni. Állatokkal ez sokkal szélesebb körben megtehető.

  • Az előzőek folytatásaként az állatokból sokkal könnyebb szövetekhez jutni (pl. tüdő, agy stb.), és pl. génexpressziós vizsgálatokat végezni, könnyebb, pontosabb a betegségek diagnózisa.

  • Rengeteg állatspecifikus reagens, anyag áll már rendelkezésünkre, pl. egérspecifikus ellenanyagok, genetikai próbák. Ismert már több állat géntérképe.

  • Legtöbb betegségünkre kidolgozható állatmodell, amely segítségével részletesen vizsgálható a betegségek molekuláris háttere.

  • Genetikailag módosított állatok lehetősége.

Ez utóbbi két pontot, témánk miatt kicsit részletesebben tárgyaljuk.

Témánk szempontjából kéttípusú, genetikailag módosított állatot kell megemlíteni. Az egyik a génkiütött, knockout vagy KO állat. Közülük is magasan kiemelkedik témánk szempontjából a KO egér, melynek kialakításáért 2007-ben Nobel-díjat is adtak. Röviden, itt az egér egy génjét (vagy esetleg a genom egy másik funkcionális egységét) valamilyen módszerrel inaktívvá teszik.

Részletesebben: http://en.wikipedia.org/wiki/Knockout_mouse. 2006-ban 9 országban 33 kutatóközpont megalakította az International Knockout Mouse Consortium-ot (IKMC), majd 2011 júniusában az International Mouse Phenotyping Consortium-ot (IMPC), amelyek azt a célt tűzték ki maguk elé, hogy az összes génre előállítanak KO egeret, majd fenotipizálják őket.

KO állatok segítségével vizsgálni lehet, hogy egy gén hiányának milyen fenotípusos jegyei vannak, így a gén funkciójáról jóval többet megtudhatunk, mintha csak in vitro körülmények között tanulmányoznánk. Az ismert gének többségéről már kapható KO egér, illetve meg is rendelhetünk cégektől ilyen egereket. Így derült ki pl., hogy az APOA5 gén hiánya magas szérumtriglicerid-szintet okoz. Egy másik lehetőség, hogy gén-KO segítségével elő lehet állítani az egéren valamilyen betegséget. Pl. ismert, hogy a „vad” egéren nem alakul ki atherosclerosis. Azonban, ha az LDL-receptor (LDLR), vagy az APOE génjüket kiütjük, és megfelelő, ún. Western-típusú diétával etetjük őket, az emberéhez igen hasonló atherosclerotikus léziók alakulnak ki az ereik falában.

A másik típusú genetikailag módosított állat, ahol főleg egeret használnak, a transzgenikus egér. Itt, szemben az előzőekkel, egyes gének működését felerősítik, túlexpresszáltatják. Ennek végső céljai ugyanazok, mint a KO egérnél elmondottak.

Mindkét technikát akár szövetspecifikusan is alkalmazhatjuk. Pl. transzgenikus esetben a gént egy olyan gén promótere után illesztjük be, ami csak az egyik szövetben expresszálódik. Pl. a SCGB1A1, korábban CC16 gén főleg a tüdőben expresszálódik, ott viszont nagyon erősen. Amikor egérbe az IL5 génjét rakták mögé, az IL5 a tüdőben mutatott igen erős expressziót, és az állatban tüdőeozinofília és asztma alakult ki. Ezzel bizonyították, hogy az IL-5 citokin az eozinofílek működésében fontos szerepet játszik, és a tüdőeozinofília közvetlenül asztmát okozhat.

Sokáig problémát okozott a magzati életben életfontosságú gének tanulmányozása, hiszen azok hiánya vagy esetleg túlexpressziója magzati korban letális. Ezért fejlesztették ki a Cre-lox-rekombináció segítségével (ld. http://en.wikipedia.org/wiki/Cre-Lox_recombination) az olyan KO állatokat, ahol pl. valamilyen indukció (pl. antibiotikum-evés) segítségével időzítetten lehet in vivo kivágni a kérdéses gént vagy genomszakaszt. Ezek az ún. kondicionális KO állatok.

Más in vivo technikákkal is lehet még géneket időlegesen inaktiválni. Ezek közül a legjelentősebbek az RNS-interferencia jelenségét felhasználó technikák. Pl. a fonalféreg Caenorhabditis elegans-ban minden génnek tanulmányozták az RNSi-vel inaktivált hatását. De a módszer pl. egérben is működik.

Állatmodellek hátrányai

Ha génszinten kicsi is a különbség pl. ember és egér között, genomszinten nagyobb. A vizsgálatok során kiderült, hogy egyes folyamatok egerekben teljesen máshogy működhetnek, mint emberben. Ebből az következik, hogy az egéren kapott eredmények csak kiinduló-pontok lehetnek, ha emberre akarunk következtetni. Ezután még az összefüggéseket emberben is meg kell erősíteni, ami persze nem mindig könnyű.

Hasonló a helyzet a betegségeknél is. Sok betegség nem modellezhető tökéletesen egérben, mások a vezető patomechanizmusok, sokszor pont a legfontosabb tünetek különböznek, vagy egyes gének hiányai emberben igen, egérben nem okoznak betegséget, vagy fordítva. Egyes, a betegségben az emberben jelentős gének az egérben más sejtekben, vagy szövetekben expresszálódnak, más a funkciójuk. Például az inzulinrezisztenciát fokozó hatású, így a 2-es típusú cukorbetegségben fontos resistingén egérben főleg a zsírsejtekben, emberben a makrofágokban expresszálódik.

Kísérleti betegségmodellek

A betegségben fontos gének manipulálásával az emberéhez hasonló betegségeket lehet egereken előidézni. Ezt lehet közvetlenül az ismert gének kiütésével, vagy túlexpresz-sziójával (10.2. táblázat), de lehet keresztezésekkel is elérni, amikor több nemzedéken keresztül mindig a betegség tüneteit leginkább hordozó állatokat szaporítjuk tovább. Ez utóbbi esetben genomikai szempontból a cél, hogy megállapítsuk a betegséget okozó variációkat. Ráadásul ilyenkor az emberi multifaktoriális kórképekhez sokkal hasonlóbb kórformákat kapunk, hiszen itt, szemben az egy gén módosításával okozott betegséggel, általában a többféle egértörzsben jelen levő, amúgy gyenge hatású variációk keveredhetnek össze, halmozódhatnak fel. Ezt a folyamatot mesterségesen is fel lehet gyorsítani. Ez történik pl. a „The Jackson Laboratory”-ban, ahol a hím egerekbe N-ethyl-N-nitrosourea (ENU)-t juttatnak, amely1000x-esére növeli a spermatogenezisben a mutációs rátát. Ezután megfelelő keresztezésekkel tovább szaporítják az egereket. Nagyon részletes fenotipizálás segítségével különböző betegségtüneteket hordozó egereket katalogizálnak, amelyekre rá lehet keresni, és meg lehet vásárolni őket. Az egész a „Mouse phenome project-ből nőtt ki, és az adatokat a Mouse Phenome Database-ban tárolják. Részletek: http://phenome.jax.org/.

Néhány elterjedten használt poligénes állatmodell: Non-obese diabetes: NOD egér (1-es típusú cukorbetegség); spontaneously hypertensive rat: SHR patkány (magas vérnyomás); Dahl sóérzékeny patkány (magas vérnyomás); New Zealand Obes: NZO egér (obezitás) stb.

10.2. táblázat - Néhány állatmodell, amelyben egy gén manipulációjával állítottak elő, az emberi betegséghez hasonló tünetekkel rendelkező állatot

Gén Manipuláció Állatfaj Betegség
LDLR KO egér atherosclerosis
apoE KO egér atherosclerosis
Leptin KO (ob/ob) egér obezitás
Leptin receptorKO (db/db) egér obezitás
TBX21 KO egér asztma
ANP KO egér magas vérnyomás
SNCA túlexpresszió drosophila Parkinson-kór
Mutáns APPtúlexpresszió egér Alzheimer-kór