Ugrás a tartalomhoz

Biokémia II. Biokémiai szabályozás

Szarka András (2014)

Typotex Kiadó

5. fejezet - A génexpresszió szabályozása

5. fejezet - A génexpresszió szabályozása

Az előző fejezetek során megvizsgáltuk, miképpen lehet a már elkészült fehérje aktivitását, illetve annak élettartamát befolyásolni. Tekintve, hogy a fehérjeszintézis meglehetősen nagy energiaigénnyel bír, mindenképpen célszerű az adott fehérje iránti igénynek megfelelően, már korábban szabályozni a gének átírását. Így mind az RNS szintézise (transzkripció), mind az azt követő érési folyamatok, a fehérje szintézise, illetve az azt követő érési folyamatok elkerülhetőek, megspórolhatóak (5.1. ábra). Természetesen ez a szabályozási mód jóval hosszabb átfutási idővel rendelkezik, ebben az esetben órák, napok alatt lehetséges az egyes folyamatok aktivitásába beavatkozni.

5.1. ábra - A molekuláris biológia centrális dogmája

A molekuláris biológia centrális dogmája

A molekuláris biológia centrális dogmája (5.1. ábra) értelmében (néhány RNS-vírus kivételével) minden fehérjeszerkezetre vonatkozó információ, illetve azok kifejeződésének körülményei a sejt DNS-állománya által meghatározott. Természetesen néhány fontos pontosítást, körülményt figyelembe kell vennünk:

Az RNS a nukleuszból történő kilépés előtt érik, illetve a splicing merőben megváltoztathatja az információ jelentését.

5.1. Génexpresszió, a gén kifejeződése

Egy bakteriális DNS-állomány általában néhány millió bázispárból (bp) áll. A mi emberi genomunk mintegy 3*109 bp-t számlál. Bár igen jelentős tudományos siker volt a humán genom szekvenciájának megismerése, a nukleotid sorrend önmagában értelmetlen adathalmaz. A nukleotid szekvenciák ismerete nem tesz minket képessé arra, hogy pusztán rájuk alapozva létrehozzunk egy élőlényt, ahogy angol szavak tömkelege sem tesz képessé minket arra, hogy pusztán rájuk alapozva rekonstruáljuk Shakespeare bármely művét. Hiszen teljes joggal tehetjük fel a következő kérdések bármelyikét: Mikor, milyen körülmények között készül az adott gén terméke és ha elkészült mit tesz?

A következő fejezetben szeretnénk tisztázni a génexpresszió szabályozásának legfontosabb szabályait, illetve mechanizmusát. Mindazokat a szabályokat, amelyek alapján a gének egy alcsoportja szelektíven kifejeződik az egyes sejtekben.

5.1.1. Sejtdifferenciáció

A különböző sejttípusok (pl. emlős neuron, hámsejt…) mind szerkezetileg, mind funkcionálisan annyira különböznek, hogy nehéz elképzelni, hogy ugyanazt a genomot tartalmazzák. Ezért, valamint amiatt, hogy a sejtdifferenciáció gyakran irreverzibilis, a biológusok kezdetben azt hitték, hogy a differenciálódás során a gének szelektíven elveszhetnek a sejtből. Ma már tudjuk, hogy a sejtdifferenciáció a génexpresszió megváltozását jelenti, nem pedig a nukleotidszekvencia megváltozását. A háttérben tehát nem a különböző DNS, hanem a különböző RNS, illetve fehérjeállomány áll.

Ez utóbbi kijelentést kísérleti bizonyítékkal is alátámasztották.1958-ban, John Gurdon és munkatársai, az Oxfordi Egyetem kutatója, afrikai karmosbékán (Xenopus laevis) végzett kísérleteik során egy teljesen differenciálódott békasejtmagot egy sejtmagtalanított békapetesejtbe ültettek. A beültetett sejtmaggal a petéből egy teljesen életképes, normális ebihal keletkezett. Tekintve, hogy az ebihal a differenciálódott sejtek legkülönbözőbb együttesét tartalmazza, bizonyítottá vált, hogy a differenciálódott (és később beültetett) sejt nem vesztette el egyetlen fontos géndarabját sem (5.2. ábra).

5.2. ábra - A sejtdifferenciáció a génexpresszió megváltozása, nem a nukleotidszekvenciáé

A sejtdifferenciáció a génexpresszió megváltozása, nem a nukleotidszekvenciáé

Hasonló eredményeket értek el sárgarépa esetében, mikor sejttenyészetbe vitték az izolált sejtet, majd abból egy sejtet kiválasztottak. A későbbiek során belőle teljes, életképes növény növekedett. Emlősök esetében is számos esetben sikerült a fenti tételt bizonyítani: birka (Dolly), kecske, sertés, egér, illetve madarak (liba) esetében is.

A fenti kijelentés alól néhány kivétel azért akad, így például DNS-átrendeződés történik az egyed fejlődése során, pl. az immunrendszer változatosságának kialakulása során.

A sejtdifferenciáció (génexpresszió) mibenléte talán jobban megérthető, ha szemügyre vesszük a sejtek között fennálló különbségeket, azonosságokat.

5.1.1.1. Azonosságok és különbségek a sejtek között

  1. Számos olyan folyamat van, ami közös az egyes sejtekben. Természetesen ezek közös fehérjeállományt igényelnek, jelentenek. Ilyenek például: strukturális fehérjék kromoszómacsomagoló fehérjék, RNS-, DNS-polimerázok, DNS-reparáló enzimek, riboszómális fehérjék, citoszkeletális fehérjék, központi metabolizmus fehérjéi.

  2. Ugyanakkor rendkívül nagy különbségeket is tapasztalhatunk, hiszen sok fehérje csak az adott sejttípusban található meg, erre jó példaa csak vörösvértestekben kifejeződő hemoglobin.

  3. Adott időben egy átlag humán sejt 10 000-20 000 gént fejez ki a megközelítőleg 25 000-ből. Ha megnézzük a különböző gének expressziós mintázatát, rendkívül nagy variációt láthatunk a különböző sejttípusok között. A különbségek lehetnek annyira élesek, mint a hemoglobin esetében, de a legtöbbször csak finom eltérések fedezhetők fel.

  4. Habár nagy az mRNS-beli különbség a különböző sejttípusok között, ezt jóval meghaladja az eltérés, amely a fehérjék esetében tapasztalható. Elsősorban az alternatív splicing, a poszttranszlációs módosulások tovább növelik a különbségeket.

Itt érdemes megjegyeznünk, hogy a legtöbb sejt képes külsődleges jelek hatására megváltoztatni a génexpressziós mintázatát.

Például a májsejtek glukokortikoid hormonok hatására számos fehérje kifejeződését fokozzák. A glukokortikoid hormonok éhezés, intenzív fizikai munka hatására kerülnek elválasztásra és a májsejtek számára jelként szolgálnak, hogy fokozza a glukóz aminosavakból, illetve más kis molsúlyú anyagokból történő előállítását. Ennek eredményeképpen például megnövekszik a tirozin-aminotranszferáz szintje, amely a tirozinból történő glukózelőállítás fontos kulcsenzime. Amennyiben a hormon szintje lecsökken, vele együtt ezen fehérjék kifejeződése, szintje is csökken.

Más típusú sejtek máshogy reagálnak a glukokortikoid stimulusra. Példának okáért a zsírsejtekben glukokortikoid hatására lecsökken a tirozin-aminotranszferáz szintje, míg más sejtek sehogy sem reagálnak.

A sejtdifferenciáció egyik általános sajátsága, hogy a különböző sejttípusok máshogy reagálnak az extracelluláris szignálokra. Ezzel, megadva az alapot az extracelluláris szignálok kiváltotta szabályozásra. A génexpressziós mintázatnak azonban számos olyan jellemzője van, amely nem változik meg és ezáltal az egyes sejttípusok számára állandó, megkülönböztető karaktert biztosít.

5.1.2. A génexpresszió szabályozásának szintjei

A génexpresszió a DNS-től induló, RNS-en keresztül menő, fehérjékig tartó útvonala során számos ponton szabályozható. Röviden tekintsük át milyen szabályozási szintekről beszélhetünk (5.3. ábra).

  1. Transzkripciós kontroll: Mikor és milyen gyakran íródik át mRNS-re az adott gén?

  2. RNS-processziós kontroll: Az adott mRNS hogyan érik?

  3. RNS-transzport kontroll: Melyik érett, komplett RNS exportálódik a sejtmagból és a citoszólban hol lokalizálódik?

  4. Transzlációs kontroll: A citoszólban melyik mRNS fog átíródni fehérjére?

  5. RNS-degradációs kontroll: Szelektíven destabilizálódó mRNS, amelyről nem készül fehérjelánc.

  6. Fehérjeaktivációs kontroll: Szelektíven aktiválódó, deaktiválódó, degradálódó, kompartmentalizálódó fehérjék.

5.3. ábra - A génkifejeződés szabályozásának szintjei

A génkifejeződés szabályozásának szintjei

A legtöbb gén esetében a transzkripciós kontroll kiemelkedően fontos. Ez könnyen belátható, ha belegondolunk, ez az egyetlen lehetőség, hogy a sejt ne gyártson felesleges köztitermékeket (5.3. ábra). Mindenképpen a szabályozás egy gazdaságos módjának nevezhetjük, ellenben korántsem a leggyorsabbnak, hiszen a további öt ponton is át kell jutnia a génnek, majd a fehérjének. A 3. fejezetben ismertetett fehérjeaktivációs kontroll ettől jóval gyorsabb beavatkozásra is lehetőséget ad.

A következő fejezetben megtárgyaljuk azon szabályozó DNS- és fehérjeelemeket, amelyek segítségével a transzkripció befolyásolható.

5.1.3. A génszabályozó fehérjék DNS-kötő részei

Hogy dönti el a sejt, hogy több ezer génje közül melyiket írja át?

Az átírni kívánt génszakasz közelében található egy DNS-regulációs szakasz. Ezek között vannak egészen egyszerűek, mint egy külső szignál által bekapcsolt kapcsoló és egész bonyolultak, mint egy kis mikroprocesszor, amelyek többféle szignált vesznek, kombinálnak és be- vagy kikapcsolják a szomszédos gént.

Mindkét fajta kapcsoló alkalmatosság két fő szerkezeti egységből épül fel. Egy rövid irányító DNS-szakaszból és egy (vagy több) génregulációs fehérjéből, melyek az előbbiekhez kötődnek.

A λ-represszor volt az elsőként leírásra került ilyen DNS-kötő, transzkripciós szabályozófehérje. Letompítja a virális géneket, a vírus alszik, de szaporodik.

A fehérjével interakcióra képes DNS-részletek azonosítása 4 lépésben történhet meg:

  1. fehérjeizolálás;

  2. specifikus kötődés létrehozása (bizonyítása);

  3. a fehérjével kötődő DNS szekvenálása;

  4. DNS-lenyomatolás.

Természetesen adódik a kérdés, hogy mi módon ismerik fel a fehérjék a jellegzetes DNS-szekvenciákat? Mi hordozza számukra a kötődéshez szükséges információt?

Tekintve, hogy a DNS-ben tárolt információt a bázissorrend jelenti, az első elképzelés szerint a fehérjék a kettősszálú DNS-ben a bázisok közötti H-hidakhoz férkőznének és ily módon ismernék fel a jellegzetes részleteket. Ekkor azonban fel kellene, hogy nyíljék a kettősszálú DNS-lánc.

Jelenleg már ismeretes, hogy a DNS-t felismerő, azokhoz specifikusan kötő fehérjék a DNS külső felszínét ismerik fel. Így nem szükséges, hogy felnyíljék a DNS-kettősszál. Gondoljunk csak bele: a DNS-ben található mindegyik bázispár éle a DNS-kettőshélix felületén van. Így a felületen a bázisoknak megfelelően különböző funkciós csoportok vannak: H-kötés donorok, H-kötés akceptorok, illetve hidrofób csoportok (5.4. ábra). Ezek a csoportok pedig a bázissorrendnek megfelelően szabályosan váltakoznak. Így tulajdonképpen a DNS felülete is kellő információval szolgál (ha nem is annyira specifikusan, mint a bázisok maguk) a DNS-kötő fehérjék számára a kötődés pontos helyéről (5.4. ábra).

5.4. ábra - A DNS-kötő fehérjék kapcsolódási helye a DNS-molekula külső felszínén

A DNS-kötő fehérjék kapcsolódási helye a DNS-molekula külső felszínén

A DNS-ben a párokat alkotó bázisok és a hozzájuk tartozó cukoregységek között létrejövő glikozidos kötések nem pontosan egymással szemben helyezkednek el. Az egyik oldalon 180o-nál nagyobb, a másik oldalon ennél kisebb szöget zárnak be egymással. A kettőshélix külső részét képező dezoxiribóz-foszfát váz csavarulatai között elhelyezkedő, szintén helikális árok ennek megfelelően torzul. Azon az oldalon, ahol a bezárt szög nagyobb, található a nagyobb helikális árok (nagyárok), ahol pedig kisebb, ott a kisárok (5.5. ábra).

5.5. ábra - A nagyárok és a kisárok értelmezése a glikozidos kötések egymással bezárt szögei alapján

A nagyárok és a kisárok értelmezése a glikozidos kötések egymással bezárt szögei alapján

A fehérjék számára csak a nagyárokban áll rendelkezésre elegendő információ, így a DNS-kötő fehérjék minden esetben a DNS nagyárkába fekszenek be (5.4. ábra).

Ezeken kívül a hélixben foglalt DNS-szekvenciától függően torzul a hélix és ezek a torzulások is információval szolgálnak a fehérjéknek a megfelelő szakasz felismeréséhez. A DNS-ben szabályosan 36o a szögelfordulás. Ez azt jelenti, hogy 10 nukleotidpárra jut egy 1 hélixfordulat. Az egymást követő sok AAAA azonban ezt torzítja és egy hajlítást visz a DNS-be.

A DNS szerkezete flexibilis, sokszor a kötődő fehérjéhez illeszkedik, így még erősebbé téve a kötődést. Az energianyereség (ami a deformálódásból, kötődésből származik) nukleotidszekvencia-függő.

A „genetikai kapcsolók” fontos részei a 20 bp-nál rövidebb DNS-szekvenciák, amelyeket a kötőhelyek felismernek. Több ezer ilyen DNS-szekvenciát azonosítottak, amelyeket különböző génregulációs fehérjék, vagy génregulációs fehérjeszettek ismernek fel.

5.1.4. DNS-felismerő fehérjeszerkezeti egységek

A biológiában, a molekuláris felismerés két molekula felületeinek tökéletes illeszkedésén múlik (ilyen például az antigén-antitest illeszkedés, kapcsolat is). Egy további igen kiváló példa a génregulációs fehérjék és a DNS között kialakuló kapcsolat. A génregulációs fehérje felismeri a specifikus DNS-szakaszt, mivel a fehérje felülete nagymértékben komplementer az adott régióban a kettős hélix speciális felületi sajátságaival. A fehérje nagyszámú kapcsolódást alakít ki a DNS-sel hidrofób, ionos, H-híd kötések révén. Ezek egyenként gyengék, de a kettő vagy több kapcsolódás erős és specifikus kötődést eredményez (5.4. ábra).

A kapcsolódások mindegyike egyedi, mindegyik fehérje tartalmaz egy speciális DNS kötő szakaszt – ezek rendszerint α-hélixet vagy β-redőt jelentenek.

A következőkben tekintsük át milyen DNS-t felismerő fehérjerészleteket, fehérjecsaládokat ismerünk.

5.1.4.1. Hélix-turn-hélix részletek

Az elsőként leírt DNS-kötő fehérjecsalád. Eredetileg baktériumokban írták le, de eukarióta sejtekben is előfordul. A családot több száz fehérje alkotja. Szerkezetüket tekintve két α-hélixből és az őket összekötő rövid hajlatból állnak. A rövid hajlat a két hélixet fix szögben tartja. A C-terminális a DNS-felismerő hélix, a nagyárokba ez köt be (5.6. ábra). Ennek aminosav egységei minden fehérjében különböznek. A másik hélix szerkezeti feladatokat lát el, irányban tartja, pozícionálja a felismerő hélixet.

5.6. ábra - A hélix-turn-hélix fehérjerészlet felépítése és kapcsolódása a DNS-hez

A hélix-turn-hélix fehérjerészlet felépítése és kapcsolódása a DNS-hez

A hélix-turn-hélix szerkezeten kívül eső részek nagy szerkezeti különbséget mutatnak a fehérjék között. Ezek révén mindegyik fehérje rá jellemző módon képes a hélix-turn-hélix részletét a DNS-hez tartani. Az egyéb részek is képesek a DNS-sel kapcsolatba lépni, mintegy finomra hangolva a DNS és a fehérje közötti kapcsolatot.

Igen gyakran dimer formában kötnek a DNS-hez. A dimerként való kötődés közös tulajdonsága számos szekvencia specifikus DNS-kötő fehérjének. Ennek megfelelően a DNS két oldala is hasonló, szimmetrikus szekvenciájú (5.7. ábra).

5.7. ábra - A szimmetrikus DNS-regulációs szekvencia és hozzá kötődő DNS-felismerő fehérje dimer

A szimmetrikus DNS-regulációs szekvencia és hozzá kötődő DNS-felismerő fehérje dimer

Ez az elrendeződés hozzájárul, hogy mindegyik monomer közel azonos kötéseket alakítson ki, ezzel is megnövelve a kötési affinitást. Első megközelítésben a kötések megkettőzésével a kapcsolódás szabadenergia tartalma is a duplájára nő, így az affinitási együttható pedig a négyzetére.

5.1.4.1.1. Homeodoménfehérjecsalád

Homeotic Selector Genes. A gén (fehérje) családot eredetileg Drosophilában fedezték fel. Később kiderült, hogy a magasabb rendű élőlényekben is kulcsszereppel bírnak. A családhoz tartozó génekben bekövetkező mutációk eredményeképpen a légy egy testrésze más testrésszé fejlődött (5.8. ábra).

5.8. ábra - A homeodomén fehérjecsalád tagjait kódoló géneket érintő mutációk következménye (Drosophila melanogaster)

A homeodomén fehérjecsalád tagjait kódoló géneket érintő mutációk következménye (Drosophila melanogaster)

A géncsalád nukleotidszekvenciáját meghatározták. Minden egyes tagja tartalmazott egy homológiával bíró hatvan aminosavból álló részletet. Ezt nevezték el homeodoménnek. A szekvenciarészlet a család meghatározója és névadója lett. A homeodomén háromdimenziós struktúrája a bakteriális szabályozófehérjékhez hasonló hélix-turn-hélix részleteket tartalmaz. Ez a megfigyelés bizonyítékul szolgál, hogy a bakteriális esetben nyert eredmények fejlettebb esetben is relevánsak lehetnek.

A Drosophila genom (proteom) több mint 60 homeodomén fehérjét tartalmaz. A gyümölcslegyeken kívül számos organizmusban írták le a család tagjainak jelenlétét, így például élesztőben, különböző növényekben és az emberben is.

A bakteriális fehérjében a hélix-turn-hélix részlet különböző szerkezeti környezetben található. Ezzel szemben a homeodomén család tagjaiban hasonlóak a különböző hélix-turn-hélix részeket körülvevő szerkezeti elemek (ezek alkotják a homeodomén fennmaradó részét). Így arra következtethetünk, hogy a hélix-turn-hélix részlet mindig hasonlóan helyezkedik a DNS-hez. Egy drosophila és egy élesztő homeodomén családtagot összehasonlítva megállapították, hogy, bár csak mindössze 17 aminosav egyezett a 60-ból, a konformációjuk és a DNS-felismerés módja nagyon hasonlított egymásra.

5.1.4.2. DNS-kötő cink-ujj részletek

Míg a hélix-turn-hélix fehérjék kizárólag aminosav részekből épülnek fel, addig a cink-ujj fehérjék egy vagy több strukturális szerepet betöltő cinket is tartalmaznak. Bár az elnevezés azonos minden Zn-et tartalmazó DNS-kötő fehérje esetében, a név eredete az elsőként felfedezett ujj alakú fehérjétől származik.

A később napvilágra került szerkezeti tanulmányok kimutatták, hogy több szerkezeti csoportba lehet a család tagjait osztani. Jelen esetben ezek közül a két legfontosabbat említjük meg:

  1. Az elsőt az eukarióta rRNS expresszióját aktiváló fehérjében írták le. Szerkezete rendkívül egyszerű, egy α-hélix és egy β-redő, amelyet egy Zn tart össze (5.9. ábra). Ezek az egységek igen gyakran klasztereket alkotnak, így folyamatosan kitöltve a nagyárkot (egyik DNS kötő α-hélix a másik után) (5.9. ábra). Így egy erős és specifikus fehérje-DNS kapcsolat alakulhat ki a bázisegységek folyamatos ismétlődése révén. A szerveződés előnye, hogy az ismétlődések számának változtatásával változtatható a kötődés erőssége, specifikussága is.

    A Zn-ujjak másik családja az intracelluláris receptorokban található (lásd 6. fejezet). Szerkezetük különbözik az előző csoportba tartozó fehérjékétől: két α-hélix pakolódik össze Zn segítségével (hasonló a hélix-turn-hélix szerkezethez). A hélix-turn-hélix szerkezethez hasonlóan dimereket képez, amely lehetővé teszi, hogy az egyik α-hélix a nagyárokba feküdjön.

5.9. ábra - A cink-ujj fehérjerészletek első csoportjának szerkezeti felépítése, illetve a klaszterképzés

A cink-ujj fehérjerészletek első csoportjának szerkezeti felépítése, illetve a klaszterképzés

Habár különböző szerkezetűek az imént tárgyalt fehérjék, közös vonásuk, hogy Zn-t használnak szerkezeti elemként, illetve egy α-hélix révén ismerik fel a nagyárokban található információt (szekvenciát).

5.1.4.3. β-redő

Az eddig ismertetésre került DNS-kötő fehérjékben minden esetben az α-hélix szolgált felismerő részletként. A génregulációs fehérjék egy csoportjában β-redő részletek fekszenek a DNS nagyárkába. A kétszálú β-redő szerkezetről az aminosav oldalláncok a DNS irányába lógnak. A felismerés az adott aminosavtól függ, amelyek a β-redő adott részét alkotják.

5.1.4.4. Leucin-cipzár

Sok génregulációs fehérje homodimer (feltehetően az erős specifikus kötés miatt). Gyakran a dimerizálódásért felelős rész más, mint a DNS-kötésért felelős rész. A leucin-cipzár ötvözi a két funkciót. A cipzár elnevezés a szerkezetéből fakad, mivel a két α-hélix, hidrofób kötései révén egy összecsavarodást hajt végre gyakran a leucinrészleteknél (5.10. ábra).

5.10. ábra - A leucin-cipzár fehérjerészlet szerkezete és kötődése a DNS-hez

A leucin-cipzár fehérjerészlet szerkezete és kötődése a DNS-hez

Kevéssel a dimerizációs szakaszon túl egy y-t formálva szétválnak, hogy lehetővé tegyék az oldalláncaiknak a nagyárokba kötődést. A dimerek úgy ülnek a DNS-en, mint a ruhacsipesz a ruhaszárító kötélen (5.10. ábra). A lehetőségek sorát bővíti, hogy több DNS-kötő fehérje, így a leucin-cipzár is heterodimereket is képes formálni. Így igen változatos erősségű és specificitású DNS-felismerő fehérje (komplexek) jöhetnek létre. Természetesen a heterodimerek variálódásának, promiszkuitásának, határa van, így elkerülhető a regulációs káosz. Hogy képződik-e két leucin-cipzár rész között heterodimer, az dönti el, hogy a két α-hélix hidrofób felülete mennyire passzol egymáshoz. Ez végső soron az aminosav sorrendtől függ. Így egy adott leucin-cipzár fehérje csak viszonylag szűk leucin-cipzár partnerállományból válogathat az adott sejten belül.

A heterodimerizáció jó példa a kombinatorikus kontrollra, amikor nem egy különálló, önálló fehérje, hanem különböző fehérjék kombinációja felügyeli a sejt folyamatait.

5.1.4.5. Hélix-loop-hélix részlet

Egy rövidebb és egy hosszabb α-hélix szakaszból és az őket összekötő hurokból áll. A hurok flexibilitása lehetővé teszi, hogy az egyik hélix visszakanyarodjon és a másikkal átellenben csomagolódjon. Az 5.11. ábrán jól látható, hogy ez a duplahélix-szerkezet a DNS-hez kapcsolódik, egy másik hélix-loop-hélix szerkezethez hasonlóan, mint a leucin-cipzár.

5.11. ábra - A hélix-loop-hélix fehérjerészlet szerkezete és kapcsolódása a DNS-hez

A hélix-loop-hélix fehérjerészlet szerkezete és kapcsolódása a DNS-hez

A leucin-cipzárhoz hasonlóan képezhet homo- és heterodimereket. Sok hélix-loop-hélix fehérje elveszti a DNS-hez kötő α-hélixét, ezek a csonka fehérjék teljes hosszúságú hélix-loop-hélix fehérjékkel heterodimereket alkotnak, azonban a kötődés a DNS-hez ebben az esetben lazább, mint a teljes hosszúságú fehérjék esetében. Ez tulajdonképpen egy szabályozási lehetőség, mivel a csonka fehérje azáltal, hogy egy teljes fehérjéhez kapcsolódik, megakadályozza azt, hogy egy másik teljes hosszúságú fehérjével homodimerizálódjon és aktív legyen (5.12. ábra).

5.12. ábra - Hélix-loop-hélix fehérjerészlet aktivitásának szabályozása heterodimerizációval

Hélix-loop-hélix fehérjerészlet aktivitásának szabályozása heterodimerizációval

Nyílván több olvasóban is felmerült a kérdés, hogy vajon melyik fehérjerészlet melyik DNS-szekvenciát ismeri fel? A tárgyalt DNS-felismerő részletek szerkezeti keretet biztosítanak, hogy az adott aminosavak adott DNS-szakaszokat ismerjenek fel. De vajon van-e pontos fehérje-bázis megfeleltetés? Példának okáért a G-C párost milyen aminosav ismeri fel? A válasz, hogy nincs, bár adott bázis-aminosavpárosítások gyakoribbak, mint mások. 20 aminosavból kombinálódnak, több lehetőség is van, hogy az adott szekvenciának megfelelő felületet kialakítsák. Talán a közeljövőben lehet majd adott DNS-szekvenciát felismerő fehérjét tervezni. A probléma megoldása hihetetlen távlatokat nyitna a molekuláris biotechnológia és a molekuláris biológiai terápia terén.

5.1.5. DNS-kötő fehérjék detektálása

A biokémiai szabályozások részletesebb megismeréséhez elengedhetetlen a DNS-kötő fehérjék izolálása, szerkezetük megismerése. A továbbiakban néhány gyakran használatos gyakorlati módszert ismertetünk a DNS-kötő fehérjék tisztítására.

  1. Gél-mobility shift assay

    Az első lépés a kérdéses DNS-szakasz klónozásos vagy kémiai úton történő előállítása, majd radioaktív jelölése. Az így elkészített DNS-preparátumhoz adjuk a sejtlizátumot, majd megfuttatjuk poliakrilamid gélen. Amennyiben a DNS-szál fehérjét kötött, lassabban vándorol (5.13 ábra).

    5.13. ábra - A gél mobility shift assay (electrophoretic mobility shift assay, EMSA) működési elve

    A gél mobility shift assay (electrophoretic mobility shift assay, EMSA) működési elve

  2. DNS-affinitás kromatográfia

    Ha a génregulációs fehérje által felismert DNS-szakasz ismert, egy porózus mátrixhoz kötik a kémiai úton előállított kettősszálú DNS-t. Ez megköti, gyakorlatilag „kiválogatja” a kötésre képes fehérjét. Ha a teljes genom szekvenciája ismert, a fehérjerészlet aminosav szekvenciájából kiindulva megkereshető a regulációs fehérje génje. Az RNS meghatározható, így klónozható.

  3. A felismert DNS-szekvencia meghatározása

    A génregulációs fehérjék egy része izolálható a megváltozott mutáns egyedekből, például a homeodomén fehérjék génjeit is így sikerült fejlődési rendellenességgel rendelkező Drosophilákból izolálni. Ezeket túltermeltetik, majd izolálják a fehérjét. Rövid DNS-szakaszokkal párosítják (csak amelyiket szorosan köti); sok ilyen kör után meghatározzák a DNS-szakasz szekvenciáját, a konszenzus-szekvenciát. Adatbázisokkal vetik össze és megnézik, hogy melyik génben lehet az adott szekvencia. A módszer hátránya, hogy nem teljesen megbízható; sok szervezet termel hasonló génregulációs fehérjéket, amelyek közel azonos DNS-szekvenciákat ismernek fel.

  4. Kromatin-immunoprecipitációs technika

    A DNS-hez kötött fehérjéket formaldehid segítségével kovalensen keresztkötik (a DNS-sel), majd lizálják a sejteket. Az izolált DNS-t kis fragmentumokra szeletelik. Ezt követően az adott génregulációs fehérje ellen termeltetett antitesttel kihalásszák a DNS-fehérje komplexeket. Így azokat a DNS-részleteket határozhatjuk meg, amelyekhez a sejtben a regulációs fehérje kötődik.