Molekuláris biológiai technikák
Wunderlich Lívius (2014)
Typotex Kiadó
Tartalom
- 7.1. A PCR elve
- 7.2. Exponenciális szaporodás
- 7.3. A reakcióelegy összetétele
- 7.4. Primerek tervezése
- 7.5. A PCR alkalmazási területei, feltételei
- 7.6. Hőstabil polimerázok
- 7.7. A PCR-reakció specifitása
- 7.8. Extra szakaszok beépítése
- 7.9. Pontmutációk vizsgálata hagyományos PCR-rel
- 7.10. Degenerált PCR, multiplex PCR
- 7.11. Kvantitatív mérések PCR-rel
- 7.12. Kvantitatív mérések real-time PCR-rel
- 7.13. Pontmutáció kimutatása real-time PCR-rel
A polimeráz láncreakció (PCR) annyira fontos technika, hogy külön fejezetben foglalkozunk vele. PCR használatával DNS-szakaszokat tudunk felsokszorozni igen gyors és hatékony módon. Feltalálásakor szinte forradalmasította a molekuláris biológiát; az addig ismert és használt technikák jó részét vagy lecserélték, vagy alternatívát kínáltak az új PCR-alapú technikák.
A PCR elve nagyon egyszerű: a kétszálú DNS-szakaszt (hődenaturációval) egyszálúsítjuk, majd megszintetizáltatjuk mindkét szál komplementer párját. Ezt ciklikusan ismételve exponenciális módon felszaporítható a kiválasztott DNS-szakasz. A reakciót katalizáló polimeráz enzim tulajdonsága, hogy működéséhez kell egy dupla szálú DNS-rész is, ahonnan a polimerizáció el tud indulni. Ezt a tényt kihasználhatjuk arra, hogy kizárólag csak az a DNS-szakasz sokszorozódjon fel, amelyiket mi szeretnénk.
A polimerizációs reakció folyamata a következőképp néz ki: ha egy egyszálú DNS-szakasz ismert részével komplementer szakaszt (ún. primert) készítünk, akkor az megfelelő körülmények között az adott komplementer szekvenciához be fog kötődni (a hibridizáció midig a bázispárosodás szabályainak megfelelően zajlik, adeninnel szemben timin, citozinnal szemben guanin található). Ha DNS-dependens DNS-polimerázt és dezoxi-nukleotid-trifoszfátokat (dNTP) adunk a fenti reakcióelegybe, akkor a feltapadt primer 3’ végétől elkezdődik a komplementer lánc polimerizációja. A polimerizációs reakciót egy idő után leállítjuk, a két szálat (új és régi) szétválasztjuk (például hődenaturációval). A képződött új szálhoz tervezett komplementer primert (melynek szekvenciája megegyezik a régi szál egy rövid szakaszának a szekvenciájával) is hozzáadjuk a rendszerhez, a második polimerizációs reakcióban az eredeti szállal (vagy egy részével) azonos szekvenciájú termék polimerizálódik.
Beláthatjuk, hogy ezt elvben folytathatjuk a végtelenségig; ha minden polimerizációs/hődenaturációs ciklus után újra hozzáadjuk a kétféle primert és az enzimet (a hődenaturáció tönkreteszi az enzimek többségét), és újrafuttatjuk a reakciót, minden lépésben duplázódni fog a templátként szolgáló szakasz komplementere. Mivel az állandóan ismétlődő bemérés igen körülményes és munkaigényes lenne, ezért a reakció kezdetekor nagyon sok, mindkét szállal komplementer primert és hőstabil polimerázt teszünk a reakcióelegybe, minek következtében a két komplementer szál egyszerre szintetizálódik. Nem kell semmi mást csinálni, csak a hőmérsékletet ciklikusan változtatni, hogy minden ciklusban duplázódjon az adott DNS-szakasz. Nézzük részletesen a körülményeket:
Ha dupla szálú templátunk van, akkor 94-95 ºC-ra fel kell fűtenünk a reakciócsöveket, hogy a DNS széttekeredjen (denaturáció).
A mintákat lehűtjük arra a hőmérsékletre (45–65 ºC), ahol a specifikus primerek megtalálják a komplementer szekvenciájukat, de még nem képesek arra, hogy aspecifikus helyre kötődjenek. (Alacsonyabb hőmérsékleten egymással nem komplementer DNS-szakaszok is képesek aspecifikusan kapcsolódni.) Elvben itt az eredeti DNS két szála is visszakapcsolódhatna, mégsem ez történik, két ok miatt: egyrészt a templát DNS hosszú, sokáig tart, amíg a pontos párosodást megtalálja, másrészt primerből sokkal több van, hamarabb találja meg valamelyikük a komplementer szekvenciát. Ezt a kapcsolódási hőmérsékletet angolul „annealing temperature”-nek hívjuk, a reakció specifitását elsősorban ez határozza meg.
A primerek bekapcsolódása után szinte azonnal elkezdődik a polimerizáció. Hogy a polimerizáció megfelelően gyorsan haladjon, a reakció hőmérsékletét fel szokták vinni az enzim működési optimumára (72-74 ºC). A felsokszorozni kívánt szakasz hosszának függvényében a reakciót melegítéssel leállítjuk (visszatérés az 1. pontra), ilyenkor szétválik a DNS két lánca, hogy aztán az annealing temperature-ra lehűtve ismét primerek tapadhassanak hozzájuk és újrakezdődhessen a polimerizáció (7-1. ábra).
7.1. ábra - http://2.bp.blogspot.com/_tUQhsS1XUW8/TUBpry3jMII/AAAAAAAAAhk/PRjQkj0Cnsw/s1600/Biofreaks+-+GGS+LIVE+PCR+-+reaction+scheme.jpg - 2013.09.13.
 |
Az utolsó ciklus után rendszerint még egy hosszabb polimerizációs lépést is alkalmaznak, (72 ºC, 5 perc), amely során az esetleg csonkán maradt szálak is kiegészülhetnek.
A fenti leírásból kiderül, hogy a reakció komponenseinek bemérését követően a láncreakció során semmi mást nem kell csinálnunk, mint a hőmérsékletet ciklikusan változtatni. A PCR-készülék igazából nem más, mint egy, a hőmérsékletét gyorsan változtatni tudó termosztát. Többféle PCR-készülék-típus van:
A hagyományos, ún. termoblokkos PCR-készülékek többnyire 0,2 ml-es vagy 0,5 ml-es mikrocentrifuga-csöveket, és/vagy 96-lyukú PCR-plate-eket képesek kezelni (7-2. ábra). Hogy a minta hőleadása és hőfelvétele megfelelően gyors legyen, speciális, vékony falú csöveket érdemes a kísérletekhez használni. A készülék kapacitásától és az amplikon hosszától függően egy tipikus PCR-reakció 1,5–3 óra alatt le szokott játszódni.
A másik fontos készüléktípusban a minták vékony üvegkapillárisokban vannak, hogy gyorsabban átvegyék a külső hőmérsékletet. A kapillárisok egy tárcsán forognak, a hőátadás nem termoblokkon keresztül, hanem a tárcsát körülvevő levegőn keresztül történik (7-3. ábra). Ez utóbbi módszerrel a minták hőmérséklete sokkal gyorsabban változtatható, a PCR-reakció teljes hossza rövid amplikonok esetén akár 20-30 percre csökkenthető.
7.3. ábra - http://216.74.34.73/m/37/Article/RocheApplied_Lightcycler_Lightcycler_img.jpg - 2013.09.13.
 |