Ugrás a tartalomhoz

Háromdimenziós szövettenyésztés

Dr. Bartis Domokos, Dr. Pongrácz Judit (2011)

Pécsi Tudományegyetem

Bioreaktorok

Bioreaktorok

A „tissue engineering” egyik legnagyobb problémája, hogy meglehetősen nehéz a beültetéshez elegendő mennyiségű és minőségű sejt vagy szövet előállítása. Általában nem megoldott a mesterséges körülmények útján előállított szövetek erezettsége (vaszkularizáció), így a nagyobb tömegű szövetek belsejének oxigén- és tápanyagellátása nem megoldott, így a sejtek funkciója is károsodik.

Bár a spontán összerendeződés nagyon fontos szerepet játszik a különféle „tissue engineering” módszerekben, szükséges a beültetendő szövet növekedésének és differenciálódásának megfelelő irányítása. Ahhoz, hogy működőképes szöveteket állítsunk elő in vitro körülmények között, alapvető paramétereket, mint az oxigénnyomás, szén-dioxid-nyomás, pH, hőmérséklet, tápanyagok koncentrációja, ozmolaritás, stb. szoros kontroll alatt kell tartani a tenyésztés során. Ha a szövet szerkezete fontos a funkció szempontjából, akkor gyakran megfelelő szöveti vázak, ún. „scaffold”-ok alkalmazása szükséges. A „tissue engineering” útján előállított szövetek tenyésztés alatti fenntartása gyakran egyéb problémákat is felvet. Általánosságban, a molekulák diffúziója a tápanyagok és anyagcsere-végtermékek transzportjának egyetlen módja. Ha egy nagyobb kiterjedésű komplex szövet-konstrukció előállítása a cél, akkor el kell kerülni a központi területek nekrózisát. Fontos, hogy valamilyen kapilláris-hálózat kialakuljon a szöveten belül, amely lehetővé teszi a könnyebb tápanyag- és anyagcsere-termék transzportot.

Hasonlóképpen, ahhoz, ahogy az őssejtek növekedését és differenciálódását irányítani tudjuk, az összetett szövetkultúrák számára is szükségesek a megfelelő fizikai, kémiai és biológiai stimulusok, hogy a kívánt funkciót megfelelően el tudják látni.

Csak néhány példa: a porcsejtek normálisan is hipoxiás környezetben növekednek és differenciálódnak az élő szervezetben is. Más sejtek, pl. az endothel sejtek számára fontos a folyadékáramlás okozta nyíróerők jelenléte a differenciálódás során, amelyek fiziológiásan jelen vannak az erekben. A mechanikai ingerek, mint a ritmikus húzóerő jótékonyan hat mindenféle kardiovaszkuláris eredetű szövet differenciálódására, legyen az szívizomsejt, vérér, pericardium vagy szívbillentyű. A speciális bioreaktoroknak meg kell felelniük ezeknek a követelményeknek.

A bioreaktor a „tissue engineering”-ben egy olyan készülék, amely képes a sejtek élettani környezetének szimulálására abból a célból, hogy a sejtek növekedését és megfelelő differenciációját serkentse. Az élettani környezetet többféle paraméter alapján lehet definiálni, ebbe beletartozik a megfelelő hőmérséklet, oxigén és szén-dioxid koncentráció, de kiterjedhet mindenfajta fizikai, (bio)kémiai és mechanikai stimulusra. Éppen emiatt, jelenleg rendelkezésre állnak olyan rendszerek, amelyek képesek 2- és 3-dimenzióban húzó vagy nyomóerő kifejtésére (például porc vagy szívbillentyű-konstrukciók előállításához). Jelenleg speciális bioreaktorok kaphatóak a kereskedelemre, melyek mind kutatási, mind pedig klinikai célú „tissue engineering”-re alkalmasak. Mindenesetre, a bioreaktorba való tenyésztéshez megfelelő számú sejtre van szükség első lépésben.

A bioreaktorban használt sejtek típusai

A sejtek tenyésztése a hagyományos rendszerekben statikus körülmények között folyik. Ez a leggyakrabban alkalmazott módszer, olcsó, egyszerű, nem igényel különleges felszerelést vagy képzettséget. Általában üveg vagy eldobható műanyag edényekben – petricsészékben, flaskákban, lemezeken folyik a sejtek tenyésztése. Alapvetően 2 típusú sejtkultúra van ilyen körülmények között – adherens és szuszpenzióban növő sejtek. Mindkettő esetben az a legnagyobb hátrány, hogy az így elérhető sejtsűrűség meglehetősen alacsony. Éppen ekkor szembesülünk a „tissue engineering” legnagyobb problémájával, miszerint a beültetéshez nagyszámú sejt szükséges, amit a hagyományos sejtkultúrákban csak nagyon nagy mennyiségű sejttenyésztő folyadék alkalmazásával és annak gyakori cseréjével, valamint a sejtek gyakori passzálásával érhető el. Ezek mind időigényes, drága folyamatok és a gyakori médiumcsere és passzázs megnöveli a sejtkultúrák befertőződésének a veszélyeit. A dinamikus környezet sejttenyésztéskor azzal az előnnyel jár, hogy a tápanyag- és oxigénellátás folyamatos és dinamikus. Ezek a körülmények teszik lehetővé a nagyobb térfogatú 3D szövetkonstrukciók létrehozását, bár a transzport a szövet közepén levő sejtekhez még így is problémát okozhat. Míg a 3D szövetkonstrukciókban a sejt-sejt kölcsönhatások és kommunikáció fokozottan érvényesül, a tápanyagok és az oxigén eljuttatása a középen elhelyezkedő sejtekig állandó kihívást jelent az ezzel foglalkozó szakemberek számára. Először is, a nem mozgó, statikus folyadékból kell megoldani a szövet felszínén lévő sejtekig az oxigén eljuttatását. Ez összefüggésben van a sejttenyésztő folyadék oxigén-tartalmával és oxigén-szállító képességével. Az oxigén diffúziója a felszíntől a szövet közepéig szintén nagyon fontos. Ebben a tekintetben a szövetkonstrukció vastagsága és porozitása bír kritikus fontossággal. Statikus kultúrákban a maximális szöveti vastagság kb. 100 µm, míg dinamikus tenyésztési körülmények között ez többszörösére nőhet.

Bioreaktorok tervezési követelménye

Annak ellenére, hogy a bioreaktorok nem képesek 100%-osan reprodukálni a sejtek élettani környezetét, törekedni kell arra, hogy minél több paraméter egyezzen. A bioreaktoroknak serkenteniük kell az oxigén és a tápanyagok transzportját a 3D szöveti konstrukcióknál, és segíteni kell azt, hogy a sejtek eloszlása is egyenletes legyen a mesterséges szöveten belül, amelyet szintén serkent a dinamikus tenyésztési környezet megléte. A mechanikai stimulusok is fontosak olyan szövetek esetében, amelyek normálisan mechanikai terhelést kell elviselniük az élő szervezetben. Ilyenek például a csont-, porc-, izom-, ínszövetek, melyek mechanikus ingerek nélkül nem differenciálódnak megfelelően és beültetve nem fogják elviselni a mechanikus terhelést.

A nyíróerő, mely szükségszerűen jelen van a dinamikus sejtkultúrában, szintén kritikus jelentőséggel bír. A sejtek érzékenyek a nyíróerőre, ez dedifferenciációt, növekedésgátlást vagy apoptózist okozhat. A nyíróerők eloszlása a bioreaktorokban egyenetlen, a legmagasabb nyíróerő a sarkok és az élek körül jelentkezik a dinamikus bioreaktorokban, mind az edényt, mind a szövetkonstrukciót tekintve. A nyíróerő mértékegysége a dyn/cm2, és emlős sejtek maximálisan 2,8 dyn/cm2 nyíróerőt képesek elviselni. Emiatt a jól megtervezett bioreaktorokban a maximális nyíróerő mindenhol jóval ez alatt az érték alatt marad.

III-1. ábra: Nyíróerők dinamikusan mozgó folyadékban

Talán a legnehezebb feladat a valós idejű információ kinyerése a szövet belső szerkezetének alakulásáról a bioreaktorban. Általában a „tissue engineering”-gel előállított szövetek cellularitása, belső szöveti szerkezete csak a tenyésztés után elemezhető részletesen.

Általánosságban a bioreaktorok tervezésénél az egyszerűség és a könnyű tisztíthatóság elsődleges szempont, mivel így csökkenthető a fertőzés kockázata.

Fontos, hogy a készülék össze- és szétszerelhetősége egyszerű és gyors legyen. Szintén figyelembe kell venni a tervezésnél, hogy a készülék sejtekkel érintkező része biológiailag inert vagy biokompatibilis anyagból készüljön. Például kerülendők a krómötvözetek vagy a rozsdamentes acél. Az anyagnak továbbá ellenállónak kell lennie alkoholos vagy hősterilizálással és az állandó magas páratartalommal szemben. Ezen felül biztosítani kell az olyan alapvető műszerek, mint a hőmérő, pH-mérő, pumpa vagy forgatómotor stb. beágyazását.

A bioreaktorok fő típusai

Keverő bioreaktorok. A legegyszerűbb felépítésű és leggyakrabban használt bioreaktorok.

III-2. ábra: Keverő bioreaktor

A keverő bioreaktorokban az oxigént és a tápanyagok egyenletes eloszlását az állandó keverés biztosítja, és csökkenti a szövetkonstrukció felszíne és a médium között kialakuló koncentrációgrádiens. A keverő bioreaktorban a „scaffold”-on tenyésztett szövetkonstrukciók a reaktortérbe belógó tűkhöz vannak rögzítve, míg a keverést egy mágneses keverőpálca végzi, így a folyadék van mozgásban a rögzített szövetkonstrukciókhoz képest. A „scaffold”-ok felszíne közelében mozgó folyadékban turbulens áramlás jön létre, amely a folyadék és a benne oldott részecskék megnövekedett rotációs impulzusa miatt növeli a transzportfolyamatokat a „scaffold”-ok belseje felé. Általában a kevertetett bioreaktorok térfogata 120 ml körül van, de a kereskedelemben kaphatóak jóval nagyobb, akár 8 literes térfogatú, hasonló elven működő bioreaktorok is. A kevertetés sebessége általában 50–80 rpm körüli és átlagosan a médium 50%-át kell cserélni kétnaponta. A megnövekedett tápanyagtranszportot jellemzi, hogy a statikus kultúrában növesztett porcszövet-konstrukciók maximális vastagsága 100 m, míg a kevertetett bioreaktorban ez a vastagság 0,5 mm. Megjegyzendő, hogy a kevertetett bioreaktorokban a sejtek egyenletes eloszlása a szövetkonstrukciókban nem jellemző, ennek a hatékonysága alacsony ebben a típusban; a sejtek leginkább a „scaffold”-ok perifériáján vannak nagyobb sűrűségben.

A forgó bioreaktorokat (III-3. ábra) elsőként a NASA fejlesztette ki, abból a célból, hogy a sejttenyészeteket megvédje a magas gravitációs terheléstől, ami az űrhajó fel- vagy leszállásánál érheti őket.

III-3. ábra: Forgó bioreaktor

A készülék földi használatban is hasznosnak bizonyult. A forgó bioreaktorban a „scaffold”-ok szabadon, felfüggesztés nélkül mozognak az edényben levő médiumban. Az edény nem más, mint egy hengeres edény, amely állandó szögsebességgel forgómozgást végez a hossztengelye körül. A forgás sebességét úgy kell megválasztani, hogy a folyadékban levő „scaffold”-okra felfelé ható hidrodinamikus felhajtóerő és a gravitációs erő egyensúlyban legyen. Ahogy az edény forog, az edény fala a folyadékra egy felfelé irányuló hidrodinamikus felhajtóerőt fejt ki, amely egyensúlyban van a lefelé ható gravitációs erővel, így a „scaffold” gyakorlatilag lebegve marad a folyadékban, miközben az élek mellett állandó lamináris áramlás van. Ez a dinamikus lamináris áramlás hatékonyan serkenti a tápanyag- és az oxigéntranszportot, ugyanakkor a „scaffold”-okra ható nyíróerők jóval alacsonyabbak, mint a kevertetett bioreaktorokban. A médiumcsere a reaktor ideiglenes megállításával szakaszosan vagy beszerelt pumpa segítségével folyamatosan is történhet. A forgó bioreaktorokban a transzportot segítő mechanizmusok hatékonysága hasonló, mint a kevertetett bioreaktorokban. A sejtek eloszlatása a „scaffold”-okon jóval egyenletesebb itt, mint a kevertetett bioreaktorban vagy a statikus kultúrákban. A gázcsere egy speciális membránon keresztül biztosított. A forgás sebessége általában 15–30 rpm. A porcszövet ilyen tenyésztési körülmények között akár 5 mm vastagságúra is megnő, 7 hónap tenyésztési idő alatt. Megjegyzendő, hogy a szövetkonstrukció tömegének a növekedésével meg kell növelni a bioreaktor forgási sebességét, hogy a megnövekedet tömegre ható megnövekedett gravitációs erőt képes legyen ellensúlyozni.

A kompressziós bioreaktorok (III-4. ábra) is elterjedten használt bioreaktorok.

III-4. ábra: Kompressziós bioreaktor

Ezt a fajta bioreaktor leggyakrabban porcszövet előállításához használatos és mind statikus mind dinamikus nyomóerő (kompressziós erő) kifejtésére alkalmas. A dinamikusan változó nyomóerő – az állandó nyomóerővel ellentétben – a porcszövet kialakulására kifejezetten pozitív hatással van. Valószínűleg a dinamikus nyomóerő-változások jól szimulálják a dinamikus élettani mechanikai stimulusokat, amelyek a differenciálódás alatt a porcszövetet érik. Általánosságban, a kompressziós bioreaktorok egy motorból és lineáris erőátviteli rendszerből állnak, amely beállítástól függően ellenőrzött nagyságú és frekvenciájú terhelés-impulzusokat képes kifejteni a „scaffold”-okon tenyésző szövetkonstrukcióra. Általánosságban, a kompressziós bioreaktorok egy motorból és egy jelgenerátor segítségével kontrollálható lineáris erőátviteli rendszerből állnak. A sejttenyészetre kifejtett erőhatás nagysága és frekvenciája transzformátorok segítségével mérhető. Az „scaffold”-okon tenyésző sejtekre az erőátvitel e legegyszerűbben sima felszínű lemezeken keresztül történik, így ez erőeloszlás is egyenletes. Mindenesetre, ha egy készülékbe több szövetkonstrukciót teszünk tenyésztésre, akkor ügyelni kell arra, hogy ezek magassága azonos legyen. A folyadékáramlás éppen a dinamikusan változó nyomási stimulus hatására jobb, mint statikus kultúrák esetén. A kompressziós bioreaktorokban tenyésztett mesterséges porcszövet mechanikai tulajdonságai és terhelhetősége hasonló lesz a természetes porcszövetéhez.

A húzó-feszítő bioreaktorokat ín-, szalag-, szívizom-, csont-, és porcszövet előállítására fejlesztették ki. Néhány berendezés nagyban hasonlít a kompressziós elven működő bioreaktorokhoz, csak a „scaffold”-ra való erőátviteli módszer különbözik: itt nyomóerő helyett húzóerőt alkalmaznak. A nyomóerőt kifejtő lemezek helyett a „scaffold”-okat kapcsokra függesztik fel és így lehet húzó-feszítő erőhatásnak kitenni a szövetkonstrukciót. A húzóerő hatására a mezenchimális őssejtek porcsejt-irányú differenciálódást mutatnak. Húzó-feszítő bioreaktort alkalmazhatnak például porcszövet előállításakor. Ilyenkor a sejteket kollagén-glükózamino-glikán „scaffold”-ra ültetve dinamikusan változó egydimenziós húzó-feszítő erőt alkalmaznak kapcsokon keresztül a szövetkonstrukcióra. Másik módszer ezeknek a bioreaktoroknak az alkalmazására, hogy a szövetkonstrukciót rugalmas gumimembránhoz csatlakoztatják, amely kapcsokkal van rögzítve az erőátviteli rendszerhez. Ilyen tenyészési rendszert alkalmaznak ínszövet előállításához, hogy az így elkészített mesterséges szövet Young-modulusa az élettani körülményekhez hasonlító legyen. (A Young modulus egy konstans, amelyet egy XVIII. században élt angol orvos-fizikusról neveztek el. A Young-modulus egy szilárd anyag rugalmasságára jellemző, ha csak egy irányú húzó vagy nyomó erőhatás éri.)

A perfúziós bioreaktorokban (III-5. ábra) tenyészett szövetekre jellemző a homogén sejteloszlás a felhasznált „scaffold”-on.

III-5. ábra: Perfúziós bioreaktor

Amikor csontvelői strómasejteket ültettek ki szivacsszerű kollagén „scaffold”-okra, a perfúzió hatására sokkal nagyobb sejtsűrűség elérése volt lehetséges, mint a hasonló tenyészetekben, amelyeket statikus körülmények között tartottak. Ez arra utal, hogy ezekben a bioreaktorokban a tápanyag- és oxigénellátottság jóval egyenletesebb a perfúzió miatt. Kalcium-foszfát „scaffold”-okon a sejtek nagy mennyiségű extracelluláris mátrix (ECM) komponenseket választottak ki és a kalcium-foszfát kis kristályokban rakódott le 19 nap után állandó perfúzió-sebesség mellett. A folyadéktranszportot tekintve a perfúziós bioreaktorok teljesítenek a legjobban összehasonlítva a kevertetett és forgó bioreaktorokkal. Ugyanolyan folyadékáramlási sebesség és sejtsűrűséget alkalmazva, a bioreaktor típusától függően nagy különbségek tapasztalhatóak a sejtek eloszlásának az egyenletességében. A statikus vagy kevertetett szövettenyészetekben a sejtek leginkább a szövetkonstrukció perifériáján koncentrálódnak, míg forgó vagy perfúziós bioreaktorokban a sejtek eloszlása sokkal egyenletesebb az egész „scaffold”-ban. A perfúziós bioreaktorok egy pumpából és egy hozzá csőrendszerrel csatlakoztatott szövettenyésztő kamrából állnak, ahová a tenyészteni kívánt szövetkonstrukciót helyezik. A pumpa átnyomja a szövettenyésztő folyadékot a porózus „scaffold”-on keresztül, amelyre a sejtek ki vannak ültetve. A „scaffold” rögzítve van a folyadék áramlásának útjában, így a szövettenyésztő médium gyakorlatilag átfolyik a „scaffold” pórusain, így biztosítva az egyenletes tápanyag- és oxigénellátást az egész térfogatban. A médiumcserét egy külső tartályból lehet biztosítani. A közvetlen folyadék-átáramoltatás hatásai nagyban függnek az áramlási sebességtől. Éppen azért, mert a különböző mesterséges szövetkonstrukciók tápanyagigénye és nyíróerő-tűrése más és más, a tenyésztési körülményeket előkísérletekben optimalizálni szükséges. Az áramlási sebességet úgy kell beállítani, hogy az egyensúly biztosítva legyen, a tápanyag-transzport és az anyagcsere-végtermékek eltávolítása között, a frissen szintetizált ECM komponensek helyben maradjanak és a megfelelő nyíróerő-szint legyen jelen a „scaffold”-on belül.

Perfúziós bioreaktorok alkalmazása csontszövet előállításában. A sejtek egyenletes kiültetésére a perfúziós bioreaktorok hatékonyabbnak bizonyultak mind a kevertetett mind pedig a forgó bioreaktoroknál. A csontszöveti differenciációs markerek (alkalikus foszfatáz, oszteokalcin és a Runx2 transzkripciós faktor) következetesen magasabb szinten voltak jelen a perfúziós bioreaktorokban tenyésztett szövetkonstrukciókban, mint a másfajta bioreaktorban tenyésztetteknél. Ezen kívül itt a szervetlen anyagok lerakódása, a mineralizáció foka is nagyobb volt. Hogy a túl magas nyíróerők hátrányos hatását elkerüljük, nagyon fontos az áramlási sebesség gondos beállítása. Kísérletek igazolták, hogy az állandó áramlási sebességnél előnyösebb a dinamikusan változó, pulzálva áramló folyadék.

Kétkamrás bioreaktor. A legutóbbi forradalmi újítás a mesterségesen előállított szövetek terén a „tissue engineering” segítségével előállított majd beültetett légcső volt. Ezt a konstrukciót egy speciális kétkamrás bioreaktorban állították elő. A donorsejtektől megtisztított (decellularizált) légcső külső felszínére a recipiens autológ porcsejtjeit ültették, amelyeket csontvelői őssejtekből differenciáltattak előzőleg. A decellularizált cső belső felszínére pedig saját légúti epitélsejteket ültettek. A cső elrendezése forgó bioreaktorhoz hasonlított, és az a megoldás, hogy a cső fala által elválasztott külső és belső tér nem kommunikált egymással, tette lehetővé a két különböző típusú sejt kiültetését. Az így elkészített szövetkonstrukciót aztán egy tuberkulózis miatt légcsőszűkületben szenvedő betegbe ültették be.

A jelenlegi bioreaktorok hátrányai

A jelenlegi „tissue engineering” módszerek rendkívül laborintenzív folyamatok, speciálisan képzett szakemberek tudják elvégezni ezeket a feladatokat. A mostani bioreaktorok nagyon speciális berendezések, bonyolult a szét- és összeszerelésük. A megfelelő számú sejt növesztése lassú és nem túl hatékony. Ezen kívül a bioreaktorban fejlődő szövet szerkezetének és más tulajdonságainak valós idejű monitorozása nem megoldott. Például, a kompressziós bioreaktorok esetében az egyik leggyakoribb probléma a szivárgás, mivel mozgó alkatrészeket tartalmaznak. Éppen a szivárgás miatt nő a befertőződés veszélye. A másik gond az alkalmazott „scaffold” minősége: a szövetkonstrukciónak ki kell bírnia a mechanikai nyomást, stimulációt. Éppen emiatt erősebb szerkezetű „scaffold”-ok szükségesek, amelyek degradációs ideje a szervezetben szükségszerűen hosszabb, ami természetesen lehetőleg kerülendő. Éppen emiatt kiegyensúlyozott kompromisszum szükséges a „scaffold” merevsége és a degradációs idő között.