Ugrás a tartalomhoz

Háromdimenziós szövettenyésztés

Dr. Bartis Domokos, Dr. Pongrácz Judit (2011)

Pécsi Tudományegyetem

Bioanyagok

Bioanyagok

Mindenféle „tissue engineering” célra használt bioanyag szigorú követelményeknek kell megfeleljen. A biokompatibilitás az egyik legfontosabb tényező, mivel a „scaffold” vagy a bioreaktorok anyaga is szükségszerűen szövetbarát és sem válthat ki semmiféle immunológiai reakciót sem. Ezen felül még fontos, hogy a „scaffold” felszínén olyan kémiai csoportok, módosítások legyenek, amelyek lehetőleg támogatnak bizonyos sejtfunkciókat, mint letapadás (adhézió), differenciáció és növekedés. A porozitás is rendkívül fontos tényező a „scaffold”-oknál, ez biztosítja a sejtek egyenletes eloszlását kiültetéskor valamint a későbbi sikeres vaszkularizációt. Legjobb, ha a porozitás a 90%-ot túllépi. A szabályozott biodegradáció azt biztosítja, hogy a beültetett anyag fokozatosan lebomlik a recipiens szervezetében.

A bioanyagok lehetnek természetes vagy szintetikus eredetűek.

Természetes bioanyagok

A természetes bioanyagok (IV1. ábra) előnyei közé tartozik, hogy leginkább in vivo forrásból származnak, éppen emiatt általában viszonylag olcsóak és nagy mennyiségben állnak rendelkezésre.

IV-1. ábra: Természetes eredetű bioanyagok

További előnyeik közé tartozik, hogy – mivel természetes eredetűek – a biokompatibilitás általában nem okoz nagyobb problémát, és ezek az anyagok már eleve tartalmazzák a megfelelő biológiai kötőhelyeket a sejtek adhéziós molekulái számára. Természetesen hátrányok is akadnak; éppen az in vivo forrás miatt az egyenletes minőség biztosítása nehézkes, mindig van különbség a különböző sarzsok között és a mechanikai tulajdonságok is behatároltak. Másrészt a potenciális szennyezőanyagok nem kívánt immunológiai reakciót válthatnak ki és az ismeretlen kórokozók jelenléte soha nem zárható ki teljesen.

A kollagén a leggyakrabban használt és éppen emiatt a legtöbbet tanulmányozott biológiai anyag. Gazdag in vivo források állnak rendelkezésre, mivel minden állati eredetű kötőszövet alapvető alkotója ez a mindenhol jelenlevő (ubikviter) molekula. A kollagén szálas szerkezetű, és az integrin adhéziós molekulák számára kötőhelyeket tartalmaz (ún. RGD motívumok, mely elnevezés az arginin-glycin-aszparaginsav egybetűs rövidítéséből ered). Mivel a kollagén evolúciósan konzervált molekula, az immunológiai tolerancia magas szintű és a biokompatibilitás kitűnő. A sejtek differenciációját rendkívül sok irányban képes támogatni, éppen ezért a kollagén a „scaffold”-ok nagyon gyakori komponense.

Másik könnyen hozzáférhető és nagy mennyiségben rendelkezésre álló „scaffold” komponens a fibrinogén. A fibrinogént (emberi) plazmából lehet izolálni. A hasítatlan formája vízoldható, ám thrombinnal hasítva a fibrinogén megalvad és olyan hidrogélt képez, amelynek nagyon komplex 3 dimenziós struktúrája van. A fibrinogén 100%-ban biokompatibilis mivel a sebgyógyulás élettani folyamatában is fibrinogén képződik. Gyakran használják is amolyan biológiai „ragasztóként”, amikor a sejteket „scaffold”-okra ültetik (pl. posztószerű biotextilekre vagy más porózus anyagokra). Ekkor a kiültetés előtt először fibrinogén-tartalmú oldatban szuszpendálják a sejteket, majd, a kiültetést követően thrombinos kezelés következik és a megalvadt 3D-szerkezetű hidrogél rögzíti a sejteket a „scaffold”-hoz. A fibrin támogatja az embrionális őssejtek differenciációját és a differenciálódott sejtek tenyésztését is. A fibrint jelenleg szív- és érrendszeri, porc, csont, és idegrendszeri szövetkonstrukciók előállításához alkalmazzák.

A selyem, amely „scaffold”-ok anyagaként is használatos, egy fehérje, amely néhány ízeltlábú speciális mirigyében termelődik. Speciális harmadlagos szerkezete ismétlődő aminosav-motívumokból áll, amely átfedő béta-lemezszerkezetet képezve egyedülállóan magas szakítószilárdságot biztosít a selyemnek. Nagyon sok próbálkozás történt a selyemhez hasonlító anyagok ipari szintézisére; ennek eredményeképpen napjainkban egyre növekszik a rekombináns selyem-analógok száma. A selyemhernyó (Bombix mori) selyme 2 fehérjekomponensből áll, a fibroinból és a sericinből. Ez utóbbi adja a selyemszál külső burkolatát, ettől lesz a selyemszál csúszós és elasztikus. A fibroin biokompatibilis és kitűnőek a mechanikai tulajdonságai. Éppen emiatt a fibroint alkalmazzák „scaffold”-ként „tissue engineering” céljaira csont-, porc-, és ízületi szalagok előállításához. A fibroin kémiai módosítása lehetséges, pl. RGD motívumokkal, amelyek kötőhelyeket biztosítanak az integrinek számára és növelik a szervetlen kalciumsók lerakódását, valamit a csontsejtek differenciációját. Bár a selyem biodegradációja nagyon lassú, de végül csontszövet fogja elfoglalni a „scaffold” helyét. A fibroin ezen kívül előnyösebb tulajdonságokkal rendelkezik a kollagénnél a porcszövet képződésének serkentésében.

A poliszacharid-alapú bioanyagok olyan polimerek, amelyek cukorszerű monomerekből állnak. Amelyek a „tissue engineering” célra használatosak, általában növényi (alga) vagy állati eredetűek. Mivel néhány poliszacharid nem kívánt immunreakciót válthat ki, ezért gondosan kell megválasztani a felhasznált anyagot. Általában a poliszacharidok hidrogél „scaffold” formájában használják fel, mert így önmagukban képesek 3 dimenziós hálózatot kialakítani és ezzel a kiültetett sejtek számára támasztékul szolgálni. Sokszor a hidrogélek injekció formájában kerülnek felhasználásra, így közvetlenül a sérülés helyére injektálják a hidrogélt önmagában vagy a belekevert sejtekkel együtt, így segítve a sebgyógyulást és a sejtek differenciációját.

Az egyik leggyakrabban használt növényi eredetű „scaffold” anyag az agaróz, mely tengeri vörösmoszatból és más algákból kerül izolálásra. Az agaróz fő polimervázát galaktóz monomerek alkotják. Immunológiailag inert, nem vált ki nem kívánt immunreakciót. A legnagyobb előnye a felhasználási lehetőségek sokfélesége és a fizikai tulajdonságok rugalmas változtatásának a lehetősége: nagyon könnyen változtatható az agaróz gélek keménysége, porozitása. Az agarózt porc-, szívizom- és idegszövet előállítására használják, ezen felül támogatja az őssejt-differenciációt is.

Az alginát a barnamoszatok poliszacharid sejtfalkomponense, savas kémhatású anyag, így leginkább kationos sók formájában kerül felhasználásra „tissue engineering” céljaira. A nátrium-alginát gyakran használatos az élelmiszeriparban állományjavítóként (E401) és a gasztronómiában is gyakran alkalmazzák. A nátrium-alginát másik felhasználási területe az iparban, hogy jól köti a zsírt és a nehézfémionokat. A kálium-alginát tulajdonságai és felhasználási területe nagyban hasonlít a nátriumsóéhoz, itt leginkább emulgeálószerként és stabilizátorként használják élelmiszeriparban.

A „tissue engineering”-ben leginkább a kalcium-alginát használatos; mivel vízben oldhatatlan gélszerű anyagot hoz létre. Az iparban és kémiai laborokban a Ca-alginátot leginkább enzimek „becsomagolására” (enkapszuláció) használták, és ugyanígy alkalmas élő sejtek becsomagolására, amelyek így nem hozzáférhetőek az immunrendszer számára. Így az idegen sejtek rejekciója hatékonyan megelőzető és a transzplantált sejtek minden biológiai funkciójukat képesek ellátni. Hasnyálmirigy szigetsejteket csomagoltak be Ca-alginátba és így transzplantálták őket I-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegekbe egy sikeresen záruló klinikai vizsgálatban. A sejtek életben maradtak, nem kerültek kilökődésre és az inzulintermelő képességüket is megtartották.

A hyaluronán vagy más néven hyaluronsav egy állati eredetű poliszacharid, mely elterjedten használatos „scaffold”-ok anyagaként „tissue engineering” célokra. A hyaluronsav egy szulfátcsoportot nem tartalmazó glükóz-aminoglikán, amely a sejtközötti állomány (ECM) egyik fő komponense a bőrben és a porcszövetben, de más szervekben is jelen van. Mint az ECM természetes makromolekuláris komponense, a biokompatibilitás adott, több kötőhelyet tartalmaz adhéziós molekulák számára. A hyaluronsav fontos szerepet játszik a sebgyógyulásban és a regenerációban, mitöbb, az embrionális őssejtek differenciációját, proliferációját és túlélését támogatja. A hyaluronsavat leggyakrabban hidrogél formájában alkalmazzák ideg-, porc- és bőrszövet előállításában.

A chitosan állati eredetű poliszacharid, melyet az erősen kationos kitin deacetilálásával állítanak elő. A kereskedelemben kapható chitosant az állati planktont alkotó apró ízeltlábúak külső vázából állítják elő, leggyakrabban pedig sebkötöző anyagként használatos, mivel nagymértékben gyorsítja a véralvadást. A chitosan-alapú „scaffold”-ok leggyakrabban csontszövet előállításában használatosak, mivel ez serkentőleg hat az oszteoblaszt differenciálódásra. Ezen felül a chitosan-kálcium-foszfát kompozit anyagok könnyen formázható, injektálható anyagot alkotnak, ha a pH enyhén savas. Amikor a pH átmegy fiziológiás tartományba, akkor a gél mintegy megalvad, magába zárva a belekevert csontsejteket. Mind tiszta, mint kollagénnel kevert chitosan alkalmazható a csontszöveti „tissue engineering”-ben, mivel mindkét forma támogatja az oszteoblaszt-differenciációt.

Szintetikus bioanyagok

A természetes eredetű bioanyagok mellett a „tissue engineering”-ben számos szintetikus bioanyag (IV2. ábra) is használatos.

IV-2. ábra: Szintetikus bioanyagok fajtái

A szintetikus anyagok legnagyobb előnye a minőség könnyű és következetes reprodukálhatósága, könnyű hozzáférhetőség és akár ipari mennyiség is termelhető belőlük. Kis változtatásokkal az összetételben a mechanikai, kémiai, biológiai, alaki és degradációs sajátosságok egyszerűen befolyásolhatóak az aktuális szükségletnek megfelelően. A hátrányok közé tartozik, hogy a szintetikus anyagokon alapvetően nincsenek a sejtadhéziót segítő molekuláris struktúrák és gyakran a biokompatibilitás és az őssejt-differenciálódást támogató képesség sem egyértelmű, azon kívül nem kívánt immunológiai reakciók is előfordulhatnak.

Poli-(laktát-ko-glykolát) vagy PLGA az FDA által engedélyezett „scaffold” alapanyag. A PLGA egy kevert kopolimer, tejsavat és glykolsavat tartalmaz különböző arányokban. A PLGA degradálódik a szervezetben, amely degradáció sebessége könnyen befolyásolható. A PLGA a leggyakrabban használt „scaffold” alapanyagok egyike, alkalmazzák ideg-, csont és porcszövet előállításában. Biokompatibilis és nem írtak le nem kívánt immunreakciókat alkalmazásával kapcsolatban. Ezen kívül támogatja az őssejt-differenciációt, osztódást és túlélést is. Figyelembe kell venni a PLGA alkalmazásánál, hogy a degradáció során keletkező bomlástermékek savas kémhatásúak, ami befolyásolhatja a sejtek anyagcseréjét.

A Polietilén-glikol (PEG) gyakran használt biokompatibilis polimer. A PEG amphofil, ami azt jelenti, hogy egy poláros fejcsoporttal és egy apoláros, változó hosszúságú farki résszel rendelkezik. A gyógyszeriparban meglehetősen elterjedt módszer a rekombináns fehérje-gyógyszerek „PEG-iláció”-ja, amellyel meghosszabbodik e fehérjék féléletideje a keringésben, mivel lassul a lebomlásuk. A PEG kémiai változtatása is gyakori, például heparinnal, peptidekkel vagy RGD motívumokkal. Gyakran alkalmaznak PEG-et csont-, porc-, ideg-, erek és májszövet előállításához. Nagyon rugalmasan alkalmazható különböző hidrogélek képzésére, könnyű kémiailag módosítani, és a gél paraméterei is széleskörűen változtathatóak: mindez nagyon széleskörű alkalmazást tesz lehetővé a „tissue engineering” területein. PEG alapú gélek nem csak sejtek lehorgonyzásához, hanem különböző növekedési faktorok (BMP. TGF) tárolására és irányított felszabadítására is használatosak.

A peptid-alapú bioanyagok rövid aminosav-szekvenciákból állnak, amelyek leggyakrabban amphofil tulajdonságúak, így spontán összeszerelődésre (self-assembly) képesek. A peptidek ilyen módú felhasználása képes ötvözni a szintetikus és a természetes anyagok előnyeit. A szintetikus úton előállított peptideknél nem merül fel a sarzsok közötti nagy különbségek kérdése és a tisztítás hiányosságaiból eredő problémák. Azon kívül a szekvenciába belefoglalhatók ismert aminosav-motívumok, amelyek a sejtadhézió szempontjából fontosak. Például a lamininból származó IKVAV szekvencia serkenti a neuritképződést, míg az RGD motívum biztosítja az integrinek kötődését, így serkentve a sejtadhéziót és vándorlást.

Kerámia-alapú bioanyagok csakis a csontszövet előállításban használatosak. Ezek a „scaffold”-ok részben vagy teljesen szervetlen anyagokból állnak. Általánosságban porózus, hővel kialakított, törékeny anyagokról van szó. Például a bioaktív üveg lassan degradálódik az élő szervezetben. Ioncserélő mechanizmus útján lassan hidroxiapatittá alakul át, felszíni biodegradáció útján, így a bioüveg biokompatibilis és implantátumokban használatos. A hidroxiapatit a csont szervetlen alkotója. Néha csak magában, szerves komponens nélkül használatos, mit nagymértékben porózus anyag, gyakrabban azonban más, szerves komponensekkel kombinálják, mint például a kollagén, PLGA vagy a chitosan. Az ilyen „scaffold”-okba akár bioaktív anyagok is belefoglalhatók, így serkentve a csontképződést.

A fémeket elsősorban implantátumokban használják. Általában alumínium vagy titánium-ötvözeteket használnak, mivel ezek biokompatibilisek. A fémek szívós anyagok, amelyek nagy mechanikai igénybevételt is képesek kibírni, ezért olyan területeken alkalmazzák őket, ahol nagy a fizikai terhelés (fogpótlás, ízületi protézis, műbillentyűk). Ezek a fémek általában biológiailag inertek, bár néha fémallergiás reakciók kialakulhatnak az arra érzékeny egyénekben. Mivel a fémek nem biodegradábilisek, ezért a „scaffold”-ként való felhasználásuk kétséges.