Ugrás a tartalomhoz

Háromdimenziós szövettenyésztés

Dr. Bartis Domokos, Dr. Pongrácz Judit (2011)

Pécsi Tudományegyetem

„Scaffold”-ok készítése

„Scaffold”-ok készítése

A „scaffold”-ok már több alkalommal kerültek említésre az előző fejezetekben. Ezek természetes vagy szintetikus anyagok, amelyek mintegy vázul, „állványzat”-ként szolgálnak a 3 dimenziós szövetkonstrukciók számára. Van néhány alapvető kritérium a „scaffold”-ok tekintetében: a biokompatibilitás fontos, mivel a „scaffold”-ok nem válthatnak ki immunológiai reakciót, mert így a beültetett anyag csak krónikus gyulladást okozna. Az anyag felszínének kémiai tulajdonságai is nagy jelentőséggel bírnak: fontos, hogy a sejtek és a természetes ECM molekulák kapcsolatba tudjanak lépni a „scaffold”-dal. Mindenképpen szükséges, hogy a „scaffold” támogassa az olyan sejtfunkciókat, mint az adhézió és migráció. A „scaffold”-okra ültetett sejtek egyenletes eloszlását és a szövetkonstrukció beültetés utáni vaszkularizációját is biztosítani kell, éppen ezért a „scaffold”-nak sok egymással kapcsolatban levő pórust kell tartalmaznia, ajánlott a 90% feletti porozitás. A biodegradációs tulajdonságokat is figyelembe kell venni "scaffold"-ok esetében. Ideálisan, a „scaffold” lebomlik a recipiens szervezetében és helyét átveszi a sejtközötti állomány, melyet a beültetett vagy később odavándorló sejtek termelnek.

Ha olyan szövetet állítunk elő, amely fizikai terhelésnek van kitéve (például csont- vagy porcszövet), akkor a „scaffold” mechanikai tulajdonságai különösen fontosak. Ellen kell állniuk a tenyésztés során például a kompressziós vagy húzó-feszítő bioreaktorokban keletkező erőbehatásoknak, és a röviddel a beültetés után keletkező mechanikai terhelésnek is. Az egyensúly azonban kényes ebben az esetben is, mivel az erősebb „scaffold”-ok degradációs sebessége lassabb.

Sok „scaffold”-nál követelmény, hogy az anyagba gyógyszereket vagy más bioaktív molekulákat ágyazzunk be, melyek a degradáció során kontrolláltan szabadulnak fel a „scaffold” anyagából. Ezek gyakran növekedési vagy sejtdifferenciációt irányító faktorok, melyek serkentik az új szövet kialakulását. Fontos az is, hogy a „scaffold” interakcióba lépjen az ECM-el is, hiszen a degradáció során ezek a molekulák fogják betölteni a „scaffold” helyét. Fontos körülmény az is, hogy a beültetésig a „scaffold” fogja meghatározni a kialakuló szöveti struktúrát, a sejtek táplálását és a sejtek differenciációját is irányítani fogja, ebben a tekintetekben gyakorlatilag átveszi az ECM funkcióját.

„Scaffold”-ok készítéséhez használt módszerek

Öntéses-kioldásos módszer (Solvent casting & particulate leaching, SPCL, V-1. ábra) a legegyszerűbb és legolcsóbb módszer a „scaffold”-ok készítésére.

V-1. ábra: Solvent casting & particulate leaching

Gyakorlatilag az öntőformát megtöltjük valamilyen pórusképző anyaggal és a „scaffold” oldószerben feloldott anyagát beleöntjük a formába. Az oldószer elpárolgásával a „scaffold” megszilárdul, és a pórusképző anyagot ki kell oldani egy másik oldószerrel. Az SPCL technika egyszerű és olcsó, és nem szükséges speciális laboratóriumi eszköz vagy képzettség a végrehajtáshoz. Természetesen vannak hátrányai ennek a technológiának, a legnagyobb talán az, hogy a „scaffold”-ot alkotó polimert leggyakrabban toxikus szerves oldószerben oldják fel, amelynek a maradványait nehéz teljesen eltávolítani, így a kiültetett sejtek károsodhatnak a visszamaradó oldószer miatt.

A fázis-szeparációs módszereket szintén gyakran alkalmazzák „scaffold”-ok készítésében. A „scaffold” alapanyagát feloldják két, egymással nem-keveredő oldószer keverékében, és ezután melegítés segítségével telített oldatokat készítünk. A magas és alacsony polimer-tartalmú fázisok elválnak egymástól magasabb hőmérsékleten, és a hőmérséklet csökkenésével a polimer kiválik a fázishatáron a túltelített oldatokból. Az oldószereket kivonással, elpárologtatással vagy szublimáció útján eltávolítják. Az így készített „scaffold”-okra jellemző az igen magas porozitás.

A gáz-habosítás egy speciális technológia, amivel a szuperkritikus állapotban levő szén-dioxidot használják a „scaffold” elkészítésére. A módszer során speciális nyomásálló kamrába töltik a „scaffold” alapanyagát, általában granulátum vagy por formájában. Ezután a kamrát lassan megtöltik szén-dioxiddal, ami igen magas nyomáson eléri a szuperkritikus állapotot és folyadékként viselkedik szobahőmérsékleten. Ebben az állapotban a „scaffold” anyaga (részben) feloldódik a szén-dioxidban. Amikor a nyomást gyorsan csökkentjük a folyadékból hirtelen gáz keletkezik, és a fázishatáron kicsapódik a feloldott polimer. Tulajdonképpen a felszabaduló gázbuborékok mintegy felfújják a „scaffold”-ot, így különösen magas porozitású anyag érhető el, és további előny, hogy toxikus oldószer-maradványok miatt sem kell aggódnunk. Ezen kívül újabb kutatások szerint élő sejtek is képesek túlélni a módszerben alkalmazott extrém nyomásváltozásokat rövid ideig, ami a sejtkiültetést rendkívül hatékonnyá teszi.

Az elektroszövés (electrospinning, V-2. ábra) nem csak „scaffold”-ok előállításában, hanem ipari szűrők gyártásában is gyakran alkalmazott módszer.

V-2. ábra: Elektroszövés

A módszer lényege, hogy egy speciális injektor fecskendezi a feloldott polimert a levegőbe, míg az injektorral szemben egy elektromosan töltött lemezen gyűlik össze a kifecskendezett anyag, miközben a levegőben elpárolog az oldószer. A módszerrel egy nem-szövött szerkezetű, posztószerű struktúra jön létre, amelyet nagyon vékony szálak alkotnak. Az elektroszövés nagyon rugalmasan változtatható technika és nem szükséges extrém nyomás vagy hőmérséklet a szövet előállításához. A technika nagyon sokféle alapanyagú „scaffold”-ok előállításához alkalmazható, például PLA, PLGA, selyem fibroin, chitosan, kollagén, stb. További előny az is, hogy az így előállított textília paraméterei, mint pl. a szálvastagság, pórusméret, szálorientáció, stb. könnyedén szabályozható.

A nem-szövött struktúrákon kívül szövött biotextíliák előállítására is van lehetőség (fiber-mesh technológia). Ez a technológia is széles alkalmazási lehetőségekkel bír, az így előállított „scaffold”-ok struktúrája szabályos, szövött szálakat tartalmaz, melyek anyaga, vastagsága, a szövés mintázata, a pórusnagyság is rugalmasan befolyásolható, és az így előállított anyagok mind 2D mind 3D szerkezete pontosan szabályozható.

A spontán összeszerelődés (self-assembly) a molekulák spontán összeállását jelenti rendezett struktúrává. A „tissue engineering”-ben általában amphofil peptideket alkalmazunk, amelyek poláros fejjel és apoláros farokkal rendelkeznek, és képesek előre meghatározott struktúrákat kialakítani vizes oldatokban. Ezeknek a peptideknek a kémiai szerkezete kívánság szerint megváltoztatható: például foszfoszerin-csoport hozzáadása serkenti a mineralizációt csontszövet előállításánál, RGD motívumok segítik a sejtadhéziót, a ciszteinek keresztkötések kialakításával stabilizálhatják a szerkezetet, a GGG összekötő-motívum a feji és a farki rész között pedig a molekuláris szerkezet flexibilitását növeli.

Az automatikus gyártási technológiákat összefoglalóan „rapid prototyping”-nek nevezzük, melyek előre programozott 3D szerkezetű séma alapján készítik el a megadott szerkezetű tárgyat additív technológiával. Ez a módszer nem csak az iparban alkalmazott, hanem használatos „tissue engineering” technológiákban „scaffold”-ok előállításához. Ezzel a módszerrel gyorsan lehet előállítani azonos minőségű, azonos szerkezetű, mintázatú „scaffold”-okat. A technológia hátránya, hogy speciális, drága számítógép-vezérelt készülék szükséges hozzá.

Többfajta technológia tartozik az automatikus, komputer-vezérelt gyártási módszerek közé, például az FDM (fused deposition modeling). Ekkor egy robotikusan vezérelt gép egy polimer vagy más anyagból készült szálat tesz le a lerakófejen keresztül a beprogramozott minta szerint. A szálak egymás mellé- és fölé fektetésével rétegenként alakítja ki a készíteni kívánt tárgy 3D szerkezetét a programozás szerint. Másik technológia az SLS (selective laser sintering, V-3. ábra)

V-3. ábra: SLS technológia

Ekkor a kicsivel az olvadáspont alatt tartott formázni kíván szilárd anyagból por vagy granulátum-formában egy réteget leterít. A komputer-vezérelt lézersugár a beprogramozott mintázat szerint végigpásztázza az anyagot, amely a lézersugár hatására megolvadva összeáll. A következő rétegekkel ugyanez történik, míg végül rétegről-rétegre építkezve az anyag 3D szerkezete véglegesen kialakul a program szerint.