Ugrás a tartalomhoz

Háromdimenziós szövettenyésztés

Dr. Bartis Domokos, Dr. Pongrácz Judit (2011)

Pécsi Tudományegyetem

Szabályozott hatóanyag-leadás

Szabályozott hatóanyag-leadás

A biomolekulák vagy növekedési faktorok irányított célhoz juttatása, felszabadulása nagyon fontos a „tissue engineering” szempontjából, már csak azért is, mert ezek a biológiailag aktív molekulák képesek az adhézió, a differenciáció és a proliferáció szabályozására és így segítik a funkcionális szövet kialakulását. A szabályozott hatóanyag-leadásra képes rendszerekkel megoldható a növekedési faktorok hatásidejének elnyújtása és lokális koncentrációjának szabályozása.

A „scaffold”-ok következő generációja nem csak a szövetkonstrukció megfelelő mechanikai és szerkezeti támogatására lesz képes, hanem aktívan szabályozza majd a sejtek differenciációját, proliferációját, adhézióját is. Ezt úgy lehetséges elérni, hogy a „scaffold”-ok funkciója kiterjed a biológiai jelek leadására is, melyek képesek a celluláris funkciók kívánság szerinti szabályozására a növekedési faktorok és más molekulák tárolásával és szabályozott leadásával, amely mimikálja az ECM élettani funkcióit. Többféle bioaktív anyag szabályozott leadásának képessége egy időben a sejtek viselkedésének tökéletesebb kontrollját és sikeres szöveti regenerációt tehet lehetővé. Jelenleg ennek lehetőségei még nincsenek meg a feladat bonyolultsága és a szükséges eszközök (kontrollált leadást lehetővé tevő anyagok és a rekombináns fehérje növekedési faktorok) költsége egyaránt magas.

Elterjedten alkalmazott növekedési faktor célba juttatási módszerek

A fehérje injektálása. Ennek a módszernek az a hátránya, hogy a diffúzió és a fehérje degradáció miatt nagyon rövid ideig van jelen a növekedési faktor a hatékony koncentrációban.

A növekedési faktort kódoló gén(ek) bejuttatása. Ez a leggyakrabban alkalmazott módszer a VEGF elválasztás megnövelésére a beültetett szövetkonstrukciókban. Ha a tisztított plazmid DNS-t juttatjuk be, akkor lebomolhat és a plazmid felvétele sem hatékony. Adenovírus vektorok nem épülnek be a genomba és leginkább hámsejtek transzfektálhatóak, a retrovírusok viszont csak proliferáló sejteket fertőznek meg, viszont beépülve a genomba a növekedési faktor szekréciója folyamatos. Lehetséges még géncsendesítés elérése is siRNS vagy más oligonukleotid-konstrukt útján.

A növekedési faktort termelő sejtek bejuttatása. Talán ez a megoldás a leghatékonyabb, ilyenkor már eleve genetikailag manipulált sejtek kerülnek kiültetésre a „scaffold”-ra, melyek folyamatosan és konstans mennyiségben képesek az adott növekedési faktor szekréciójára.

A fehérje beágyazása kollagén vagy más porózus „scaffold”-ba. Ez a módszer lassú és folyamatos leadást biztosít a fehérjék és a növekedési faktorok számára.

Állandó leadás ozmotikus pumpa útján. Ez a módszer meglehetősen egyszerű és olcsó, de a hatékonysága megkérdőjelezhető mivel a növekedési faktorok élettani szintje nem biztos, hogy elérhető ezzel a módszerrel.

A fehérje kontrollált leadása biodegradálódó anyagba beágyazva (IX-1. ábra).

IX-1. ábra: Felszívódó polimerbe ágyazott fehérje kontrollált leadása

Nagyon sok tanulmány foglalkozik a biológiailag degradálódó mátrixba ágyazott fehérjék kontrollált leadásának alkalmazási lehetőségeivel. Annak ellenére, hogy sokan bizonyították, hogy a polimerekbe ágyazott fehérjék biológiai aktivitása megmarad, nagyon sok bizonyíték utal a mégoly kis koncentrációban jelen levő szerves oldószerek a beágyazott fehérjék szerkezeti és funkcionális épségére gyakorolt negatív hatására. Fehérjéket egyébként adszorbeáltatni is lehet a „scaffold” felszínére, például szintetikus oligopeptideket, amelyek a fibronektin adhéziós szekvenciáját tartalmazzák. Azzal, hogy kémiailag módosított bionyagokat használunk a hatóanyagok kontrollált leadásához, jelentősen kiterjeszthetjük az így stimulált sejtek populációját és megnövelhetjük a hatóanyag felvételének hatékonyságát.

Bioaktív molekulák bejuttatása „scaffold”-okba

Egyenletesen eloszlatott hatóanyagok. Nagyon gyakran a növekedési faktorokat vagy más hatóanyagot egyszerűen belekeverik a kontrollált leadást végző mátrixba. Ezek leggyakrabban hidrogél természetűek, és egyúttal „scaffold”-ként is szolgálnak a sejtek számára. Bizonyos körülmények fennállása esetén sejtek vagy bioaktív anyagok a gél megalvadása előtt belekeverhetőek a mátrixba. A beágyazott molekulák felszabadulásának sebessége és más jellegzetességei könnyen befolyásolhatók a keresztkötések számával, a felhasznált keresztkötő anyagok mennyiségével, pórusmérettel, stb.

Szintetikus szilárd biodegradábilis anyagokat is teszteltek kontrollált leadás szempontjából különböző „tissue engineering” alkalmazásokban, leginkább nagyobb szilárdságú szövetekben, mint porc- vagy csontszövet. Annak ellenére, hogy elterjedten használják a szilárd „scaffold”-okat, sok kérdés merül fel a beléjük foglalt fehérjék leadásával és stabilitásával kapcsolatban. Éppen emiatt nagyon fontos a megfelelően kíméletes technológiák használata, mint a gáz-habosítás vagy az elektroszövés.

Immobilizált jelátvivő molekulák. A polimer „scaffold”-ok olyan módon is előállíthatóak, hogy a kérdéses bioaktív jelátvivő molekulákat vagy növekedési faktorokat a „scaffold” anyagához hozzákötve azokat immobilizáljuk, így a diffúzió sebességét jelentősen lecsökkentve, a leadási idő megnyúlik. A jel immobilizálása lehetséges a molekula „scaffold”-hoz való reverzibilis vagy irreverzibilis kötődésén keresztül. Lehetséges az is, hogy egy degradálódó molekuláris linker köti a kérdéses molekulát a „scaffold” anyagához. Sok minden befolyásolhatja az immobilizált jelek leadásának/felszabadulásának profilját, például a kötőhelyek száma, a kötés erőssége vagy a „scaffold” degradációs sebessége.

Egyéb fehérje-leadó rendszerek a „tissue engineering”-ben

A hatóanyagok kontrollált leadására szolgáló technológiák nagy segítséget nyújthatnak abban, hogy biológiailag aktív „scaffold”-okat tervezzünk, amelyek alkalmasak arra, hogy alacsony vagy magas molekulatömegű fehérjéket szabadítsanak fel a lokális szükségleteknek megfelelően. Először is, a rendszernek megfelelő védelmet kell biztosítania a tárolt fehérje degradációja és inaktiválódása ellen, amely állandó probléma biológiai rendszerekben. Másrészt a kontrollált leadási rendszer alakjának, összetételének és szerkezetének a változtatásával a leadási paraméterek finomhangolása meglehetősen hatékonyan változtatható, amivel elérhetjük a leadott biomolekula lokális koncentrációjának a megfelelően hosszú időn keresztül való biztosítását. Ez a stratégia ezen felül alkalmas lehet egynél több fehérje kontrollált leadására is.

Biodegradábilis és nem-degradálódó rendszerek

Egyszerű diffúzión alapuló nem-degradálódó platformok, mint például az etilén-vinil acetát kopolimerek (EVAC) és különböző szilikonok voltak az első ilyen célra alkalmazott platformok. Egyedül a pórusnagyság volt, ami a diffúzió sebességét szabályozta. Ma lehetséges sejtek beágyazása ilyen polimerekbe, ami képes hatékonyan megvédeni őket az immunológiai kilökődéstől.

Biodegradábilis rendszerek. A leggyakrabban használt szintetikus anyagok a PLA és a PLGA, amelyek azért is használatosak nagyon széles körben mert a biokompatibilitásuk kiváló. Emellett még az összetételük, szerkezetük és ez által a degradációs tulajdonságaik is rendkívül egyszerűen befolyásolható paraméterek, úgyhogy a degradációs idő hetek és évtizedek között változtatható. Jelenleg a piacon többfajta PLGA formulációjú rendszer van jelen, (Lupron Depot®, Sandostatin LAR® Depot, Nutropine Depot® és Zoladex®) és néhány sikeres növekedési faktor vagy más fehérje kontrollált leadása került leírásra az irodalomban.

A poli-ortho-észterek (POE) új generációja került nemrég az érdeklődés középpontjába, ezek a polimerek injektálható, viszkózus bioanyagok, ahol a fehérje egyszerűen belekeverhető a polimerbe, hő és oldószerek alkalmazása nélkül. Az így kifejlesztett alacsony olvadáspontú polimer (POE IV) olyan hőmérsékleten formálható és injektálható, ahol a fehérje megőrzi biológiai aktivitását.

A polianhidridek olyan biodegradábilis polimerek, melyek jelenleg intenzíven kutatnak új kontrollált leadási rendszerek tervezése tekintetében. Hidrofób gerinchez oldalláncok csatlakoznak hidrolítikusan instabil linkerekken keresztül. A PLGA-vel ellentétben a polianhidridekre elsősorban felszíni eróziós degradációs profil jellemző, amely jobban és egyszerűbben modulálható leadási profilt eredményez.

On-off hatóanyag-leadási rendszerek. A fehérjék vagy peptidek kontrollált leadása olyan módon is megoldható, hogy meghatározott ritmusban, mintegy „pulzálva” történjen a kibocsátás, egy-egy adagot gyorsan kibocsátva hosszabb – rövidebb leadási szünet után. Ezeket a rendszereket hívják programozott vagy indukált leadási rendszereknek. A programozott rendszerekre jellemző, hogy a leadás kontrollja teljes egészében belső szabályozó mechanizmuson keresztül szabályozódik, míg az indukált leadási rendszerek valamilyen külső szabályozás vagy inger hatására adják le a hatóanyagot. Ezek lehetnek például hőmérséklet, pH változás, elektromos vagy mágneses mező változása, ultrahang vagy besugárzás.

A programozott leadási rendszerek esetében pontosan időzített hatóanyag-leadás történhet a polimer spontán hidrolízise vagy enzimatikus lebontása útján. A fehérje egy-egy adagjának kibocsátására tervezett, tömeg- vagy felszíni erózió útján degradálódó rendszerekben a PLGA, hidrogél, polianhidrid komponens(ek) összetételének vagy szerkezetének változtatásával lehet befolyásolni a kibocsátási paramétereket.