Ugrás a tartalomhoz

Háromdimenziós szövettenyésztés

Dr. Bartis Domokos, Dr. Pongrácz Judit (2011)

Pécsi Tudományegyetem

Aggregátum kultúrák

Aggregátum kultúrák

Aggregátum kultúrák típusai

Természetes aggregátumok

Noha számos szövettípus kialakításához szükséges a “scaffold” rendszer, mint alapváz felhasználása a szövetek megfelelő formájának meghatározásához és ezzel a fiziológiás morfológia és funkció megalapozásához, az is nyílvánvalóvá vált, hogy a vázrendszer nem szükségképpen előre elkészített, hiszen azt a sejtek önmaguk is képesek ECM-et szekretálni, amiből a vázat kialakíthathatják. Ez a megfigyelés, illetve az, hogy a sejtek egymáshoz és számos felszíni struktúrhoz is tudnak tapadni, (XI-1. ábra) képezik a technológia alapját.

XI-1. ábra: Sejt adhézió

Szuszpenziós aggregátumok. Számos más szövettípushoz hasonlóan, a kondrociták monolayer kultúrában de-differenciálódnak, míg sejt-mátrix kapcsolatok, amelyek többszörös differenciálódási folyamatokat szabályoznak, képesek megőrizni a szövetek differenciáltságát. Szuszpenziós kultúrákban a fenotipikusan stabil kondrociták először ugyan diszpergálódnak a médiumban, de később aggregátumokat kezdenek kialakítani. Ez az aggregációs folyamat in situ interakciókat reprodukál, mivel a natív fenotípusú porcszövet jellemzői fenntarthatók aggregátum vagy üledék kultúrákban. A kondrocita aggregátum kultúrák specifikus molekuláris mechanizmusainak vizsgálata fényt derített mind sejt-sejt, mind sejt-mátrix kapcsolatokra az aggregátum kialakulása során. A molekuláris mechanizmusokról bebizonyosodott, hogy amíg (1) sejt-sejt kapcsolatok nem játszanak döntő szerepet, sokkal inkább (2) aggregáció II-es típusú kollagénhez és „cartilage oligomeric protein” (COMP)-ben gazdag mátrixhoz, és (3) β1-integrinhez, amely a kollagének hármas helikális GFOGER szekvenciájában található. β1 integrinről az is ismert, hogy II-es típusú kollagénhez tud kötődni, α1, α2, α10, vagy α11 β1 integrinekkel. A porc fejlődésében, homeosztázisának fenntartásában, degradációjában vagy a sejtek túlélésében a sejt-mátrix és a sejt-sejt kapcsolatok igen fontos szerepet töltenek be. Ezeket az interakciókat a végtag kezdemények mezenchimális sejt kondenzációja kapcsán alapos vizsgálatnak vetették alá, amely, mint a korai porcfejlődés, úgy tűnik, hogy sejt-fibronektin kapcsolatok által szabályozott. A kezdeti kondenzációs lépés után a sejt-sejt közötti kapcsolatok megerősödnek a homotipikus sejt adhéziós molekulák NCAM és N-cadherin segítségével. Az NCAM és N-cadherin aktivitás zavarai csökkent vagy megváltozott sejt aggregációhoz vezetnek mind in vitro, mind in vivo porcképződés közben. Később azonban NCAM és N-cadherin molekulák eltűnnek a porcszövetből és differenciált kondrociták nem expresszálják őket. Egészséges, felnőtt porcban nincs sejt-sejt kontaktus, sokkal inkább funkcionális sejt-mátrix kapcsolatok, azaz kondrocita-extracelluláris mátrix között létrejövő kötődés, amely integrinek által szabályozott folyamat.

Érthető módon, az I-es típusú kollagén adagolása kondrocita szuszpenzióhoz növeli az aggregáció mértékét, míg kollagenáz alkalmazása gátolja.

Gravitás aggregátumok (Függő csepp azaz „Hanging drop” (HD) kultúrák). Számos sejttípus in vitro aggregálására fejlesztették ki a függő-csepp kultúrákat (XI-2. ábra és XI-3. ábra).

XI-2. ábra: Mikrogravitás kultúra (Függő-csepp) I.

XI-3. ábra: Mikrogravitás kultúra (Függő-csepp) II.

Mikrogravitás kultúrákban sejteket egy csepp folyadékban tartanak, miközben a folyadék egy üveg fedőlemezen „függ” egy apró bemélyedés felett. Az ilyen kultúrák kivitelezésének segítésére fejlesztették ki a steril műanyagból készült plate-eket (Terasaki plate). A Terasaki plate-ek mind 60-lyukú, mind 72-lyukú formátumban készülnek, orvosi tisztaságú polisztirénből. Minden egyes lyuk térfogata kb.10 l, ezért lyukanként 20 l-nyi folyadékkal fejjel lefelé fordítva a plate-eket kialakulnak a függő-cseppek, melyeket a kapilláris hatás tart a műanyaghoz rögzítve. Egy ilyen folyadék cseppben a szuszpenzióban levő sejtek lassan szedimentálódnak és aggregátumot képeznek. Mivel a kicsi térfogatban a tápanyag mennyisége limitált, amint az aggregátum kialakult, a mikro-szövetet nagyobb szövettenyésztő edénybe kell áthelyezni. Embrioid testek (EB) készítéséhez mind a szuszpenziós, mind a függő-csepp aggregátum kultúrákat sikeresen alkalmazták. Enzimatikusan emésztett differenciálatlan, emberi őssejtek halmazaiból (hESCs) embrioid testeket (EBs) sikerült készíteni in vitro aggregációval. hESC-ek aggregációja lehetővé teszi a sejtek spontán differenciációját endodermális, mezodermális és ektodermális irányba. Az aggregációs módszerek lehetővé teszik növekedési faktorok exogén hozzáadását vagy különféle szabályozó gének túlexpresszáltatását a differenciáció megnövelésének és felgyorsításának érdekében. A hozzáadott faktorok közé tartoznak: hemopoetikus citokinek kombinációban mezoderma indukáló BMP-4-gyel, amely colony-forming unit (CFU) jelenlétében akár 90%-os tisztaságban CD45+ hemopoetikus sejtet tud kialakítani.

Gravitás aggregátum II (Lecentrifugált aggregátumok). Hogy a sejtek közötti távolságot csökkentve az aggregátumok kialakulásának lehetőségét növeljük, tisztított sejttípusokból álló akár rágcsáló, akár humán sejt szuszpenziós kultúrákat összecentrifugálva képezhetünk szerv-aggregátum-kultúrákat. Az ilyen típusú aggregátum kultúrákat könnyű összeállítani, sejt összetételüket tetszés szerint lehet kiválasztani, a sejtek az aggregáció előtt manipulálhatók (gén expresszió módosítás, fiziológiás festés, stb), ezért ez a módszer kiválóan alkalmas kontrollált jelátviteli vizsgálatok kivitelezésére vagy patológiás folyamatok modellezésére és tanulmányozására.

Szintetikus sejt aggregátumok

A szintetikus sejt aggregátumok fő koncepciója az, hogy polimer hidak segítségével kapcsolódjanak a sejtek egymáshoz, amelyek stabilizálják az aggregátumot (XI-4. ábra).

XI-4. ábra: Szintetikus sejt aggregátum

A polimert helyettesíteni lehet sejt adhéziós molekulákkal, ami a keresztkötés után segíti a sejt agglomerátumok kialakulását. Különféle anyagokat használnak a szintetikus sejt aggregáció kivitelezésére, köztük chitosan-t, módosított polietilén glikolt (PEG), lektineket és származékaikat, PLGA nanogömböket, stb. Sejtek kémiai keresztkötésére biotinilált sejt keresztkötő molekulákat is használnak (XI-5. ábra).

XI-5. ábra: Biotinilált sejt keresztkötés

Sejteket nagy sejtdenzitású szuszpenzióban lyukacsos vázra szélesztjük. A pórusokba szorulva a sejtek aggregációja megindul. Bioreaktorokban a médium mozgása elősegíti a tápanyagok és oxigén cseréjét, amely növeli az osztódást, melynek következménye a további sejt aggregáció.