Ugrás a tartalomhoz

Háromdimenziós szövettenyésztés

Dr. Bartis Domokos, Dr. Pongrácz Judit (2011)

Pécsi Tudományegyetem

Kereskedelmi forgalomban lévő termékek

Kereskedelmi forgalomban lévő termékek

A szerv elégtelenség fogalma olyan funkcionális elégtelenség, mely lehetetlenné teszi a normál homeosztázis fenntartását klinikai intervenció hiányában. A klinikai közbeavatkozás lehet konzervatív, szervfunkciót támogató terápia és sebészeti rekonstrukciós terápia. Sok esetben azonban ezek a terápiák nem gyógyítják meg a beteget. Jelenleg az egyetlen esély a gyógyulásra a szerv transzplantáció.

A szövetkészítés kommercializálása az orvoslás legutóbbi előrelépése. A szövetkészítés gyors fejlődése lehetővé teszi számos termék kommercializálását, mivel a fejlett országokban piac mutatkozik az így elkészített szervek felhasználására. Különösen, hogy az öregek száma dramatikusan nő a fejlett országokban és az öregedéssel együttjáró, krónikus betegségek által kiváltott szervelégtelenségek gyakorisága is nő. Egyre több terméket engedélyeznek rutin klinikai felhasznására, és növekvő számú beteganyagnál használják az így készült szerveveket, szöveteket. Minden orvosi teméket vagy műszert az emberi terápiába történő elfogadása és piacra kerülése előtt – törvényi előírások alapján – hatóságilag jóváhagyott teszteknek kell alávetni. Az Egyesült Királyságban ez a hatóság a Gyógyszereket és Egészségügyi Temékeket Szabályozó Ügynökség (Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency (MHRA)), míg Európa többi részén a tagállamok olyan direktívákat dolgoznak ki, melyek az Európai Unio által meghatározott alapelveken nyugszanak. A bioanyagok és orvosi műszerek tesztelésére kidolgozott legfőbb ajánlást a hatalmas méretű, ISO 10993 elnevezésű dokumentum tartalmazza, amely részletezi azokat a legfontosabb paramétereket, melyeket figyelembe kell venni mind anyagok, mind műszerek készítése során.

Szív-érrendszeri betegségek

Mű szívbillentyűket már hosszú ideje alkalmaznak sérült szívbillentyűk cseréréje. A legtöbbjük mechanikus szívbillenytű, melyet biokompatibilis fémötvözetből és műanyagból készítenek. Tartós szerkezetük miatt éveken keresztül is képesek a folyamatos működésre. A legnagyobb gondot a mechanikus szívbillentyűk esetében a nem-biológiai felszínek jelentik. Véralvadást válthatnak ki vagy baktérium kolóniák telepedhetnek meg a nem-biológiai anyagokon.

A biológiai szívbillentyűk állati eredetűek, pl. disznó, és ezeket az állati eredetű billentyűket először sejtmentesítik, hogy alkalmassá tegyék őket az emberi szívbe való beültetésre. Vannak más típusú biológiai billentyűk is, melyek sejtmentesített ló vagy szarvasmarha perikardiumot tartalmaz egy kerethez erősítve. Az így készített billentyűt sebészeti úton jutattják a szívbe. Sajnos azonban a jelenleg használatos biológiai billentyűk kevésbé állnak ellen az igénybevételnek, mint a mechanikusak.

A biotechnológiai módszerekkel (Tissue engineered) készített szívbillentyűket különféle váz felhasználásával készítik, melyre endotheliális sejteket telepítenek. Az ilyen típusú szívbillentyűk kombinálják az előző típusokat: majdnem olyan szinten bírják a folyamatos igénybevételt, mint az egészséges emberi szívbillentyűk, miközben teljes mértékben biológiai a felszínük. A biotechnológiai eljárásokkal készült szívbillentyűk esetében nincs vérrögképződési kockázat vagy fertőzésveszély. Ma már BMSC-vel is készül szívbillentyű, de csak a tüdő keringés számára (a szív jobb oldala).

Vér erek, artériák és vénák. Arteriális „szervelégtelenség” leggyakrabban atherosclerosis eredményeként következik be, míg vénás „szervelégtelenséget” a véna tágulatok okozzák. Általában artériák beültetésére kerül sor, mivel ezek az erek természetes úton nem helyettesítődnek. Az alsó végtagok sérült vénáit egyszerűen kivágják (varicectomy). A súlyosan károsodott vagy elzáródott artériákat azonban helyettesíteni kell. Arteriális graftok készülhetnek a szervezet más helyéről származó, azaz saját artériából vagy mesterséges artériákból. Néha xenograftokat is használnak vaszkulatúra készítésére, amelyek lehetnek kutya, disznó vagy nyúl sejtmentesített vénái, uréterei vagy beleik szubmukózális része. Mostanában már sejtmentesített emberi vénás allograftokat is használnak. Vérerek nyomtathatók is az új, „szövet nyomtatási” technológia segítségével, mint azt már részleteztük a XII. fejezetben. Röviden: a sejtekből olyan „biológiai tinta” készül, amely símaizom és endotélium keveréke. Kétségtelen, hogy további munkát igényel olyan vaszkulatúra készítése, amely képes a vérnyomásnak megbízható módon ellenállni.

Ér-graftok alkalmazása sebészeti gyakorlatban autograftokat jelent, azaz a beteg saját vénáinak és artériáinak felhasználását az elzáródott érszakasz áthidalására. Pl. a koszorúerek bypass graftjaként a sebészek mell artériát vagy autológ véna saphenat alkalmazzák a koszorúér elzáródásának megszűntetésére. Előfordul, hogy egy betegben 3–4 graftot is használnak. Egy másik módszer az elzáródott artériák kezelésére az ér-sztent. Ennek a módszernek a lényege az, hogy fém vagy szintetikus sztent behelyezésével megnyitják az elzáródott érszakaszt. A beültetett sztent nem-felszívódó, ezért az eret átjárhatón tartja. A graftot bőrön keresztül végzett koszorúér beavatkozással helyezik el a koszorú artériákban. Nagyobb graftok használhatók a hasűri aorta aneurizmájának kezelésére.

Mesterséges véredényeket szintetikus anyagból pl. teflonból is készítenek. Ezeket súlyosan beteg, elzáródott perifériás artériák áthidalására használják (pl. a comb vagy a bél artériák). Ez esetben az aortát összekötik a beteg artériával oly módon, hogy az elzáródás helyét megkerüljék (pl. aortofemorális bypass). A beteg azonban folyamatos antikoaguláns kezelésre szorul és a fertőzés veszélye is nagy.

Biotechnológiai úton előállított xenograft erekhez állatok (kutya, disznó vagy nyúl) sejtmentesített vénáit, urétereit vagy bélnyálkahártya alatti szöveti területeket használnak. Humán allograftok alkalmazása is megkezdődött. BMSC-vel benövesztett szintetikus anyagok, pl. PCLA-PGA kopolimerek klinikai kipróbálás alatt állnak. Ezeket a graftokat gyermekekbe ültették be, de jó eredményeket csak az alacsony nyomású pulmonáris keringés esetében értek el.

Biotechnológiai módon történő erek (tissue engineered blood vessel (TEBV)) előállítása nem könnyű. Egyik kipróbált módszer HUVEC és símaizom sejteket használt, amelyeket először hagyományos szövettenyészetként, monolayer-ben szaporítottak. Hetekkel később a sejt monolayer-eket egy rétegben felszedték, majd inert csövekre tekerték úgy, hogy koncentrikus rétegeket alakítsanak ki. A belső réteg dehidratált fibroblaszt réteg volt, melyet símaizom, majd egy külső fibroblaszt réteg követett. Az így elkészített és feltekert szerkezeteű kultúrákat hetekig tenyésztették együtt, hogy a sejtek kapcsolódhassanak egymáshoz, osztódjanak és ECM-t termeljenek. Végül, endoteliális sejtekkel fedték be a belső felszínt. Egy ér ilyen módon történő elkészítése 3 hónapot vesz igénybe.

Porc kezelésére készített termékek

Porc sérülés kezelése & regenerációja a biotechnológia eljárásokkal készített szöveteket elsősodleges felhasználója. Akut porc sérülést általában traumatikus sérülés okoz, míg krónikus porc károsodás gyulladást követő degeneráció eredménye. Ez a folyamat jellemzi az artritiszt és artrozist. A porc regenerációja lassú és nagy kiterjedésű sérülés vagy krónikus betegség következményeként szöveti degeneráció következik be. A fejlett világban gyakori porcsérülések súlyos hatást gyakorolnak az életminőségre. A legnagyobb kihívás biotechnológiai módon előállított porc esetében az, hogy a folyamatos mechanikai terhelésnek ellenálljon. Ezért érthető módon hialinos és nem fibrotikus porcra van szükség, így mechanikai stimulációra szükség van a szövet elkészítése során.

Autológ kondrocita beültetés (autologous chondrocyte implantation (ACI)) bevált és széleskörben alkalmazott eljárás. Első lépésként kb 200–300 mg porcot nyernek arthroszkópos eljárással súlynak kevésbé kitett porcos felszínekről (pl. az intercondylaris fossa-ból). Ezután a mátrixot enzimatikusan emésztik, hogy a kondrocitákat izolálhassák. A sejteket négytől hat hétig tenyésztik, míg végül a sérült porcra helyezik őket nyitott térd műtét során (melyet arthrotomiának is neveznek). Ezek az autológ sejtek beilleszkednek az új környezetükbe és porcot formálnak. A Carticel® szolgáltatást a Genzyme nevű cég vezette be. A Carticel® szolgáltatás keretein belül a kinyert porcot először a Genzyme laboratóriumba küldik, amely elvégzi a kondrociták kinyerését, tenyésztését és proliferáltatását. Végül a sebész megkapja az implantációra-kész, differenciált sejteket.

A mátrix indukálta ACI (Matrix-induced ACI (MACI)) valamelyest különbözik a fent leírt módszertől. A MACI módszert használva az implantáció során a kondrocitákat előzetesen egy váz-hálóra helyezve, vázzal együtt helyezik a sérült porc felszínre. A MACI módszer során a kinyert kondrocitákat hialin vagy kollagén mátrixokon növesztik. Klinikai eredmények szempontjából szignifikáns különbség nem mutatható ki az ACI és MACI között. A MACI módszerben kondrociták helyett MSC-k felhasználása kipróbálás alatt álló eljárás. A porc készítés legnagyobb kihívása jelenleg, hogy a kondrocita differenciálódást a hialin és ne a rostos porc kialakulásához vezető folyamatok felé irányítsák.

Májműködést segítő termékek

A májműködést segítő biomesterséges eszközt (Bioartificial Liver Assist Device (BAL)) mind akut, mind krónikus májelégtelenség esetén alkalmazzák. Leginkább arra az időszakra veszik igénybe ezt az eszközt, amíg megfelelő donort sikerül találni a beteg számára. Más esetekben akut májelégtelenség esetén arra használják ezt az eszközt, hogy a máj feladatát részben átvegye és időt adjon a májnak a regenerációra. BAL szintén használatos transzplantáció során addig, amíg a beültetett donor máj működése beindul. Az egyik típusú BAL az üreges rosttal töltött vese dialízis rendszerre hasonlít. A májsejteket géles oldatban szuszpendálják, mint például a kollagén, amelyet az üreges rostokba fecskendeznek. Kollagén esetében a szuszpenzió géllé formálódik a rostokban, amely általában hőmérsékletcsökkenés eredményeként jön létre. A hepatociták beilleszkednek a kollagén mátrixba és összehúzzák azt, ezzel csökkentve a szuszpenszió térfogatát és lehetővé téve az áramlási tér létrejöttét a rostokon belül. Tápanyagot tartalmazó médiumot cirkuláltatnak a rostokban a sejtek életben tartása érdekében. Az eszköz használata során a beteg vérplazmáját betöltik a rostok üregeibe. A rostok, amelyek féligáteresztő membránok is, segítik a toxinok, tápanyagok, kémiai anyagok átjutását a vérplazma és a májsejtek között. A membránok távol tartják az immunoglobulinokat és fehérvérsejteket a májsejtektől, ezzel megakadályozva az immunreakciók kialakulását.

A dialízis típusú eszközökkel összehasonlítva a BAL előnye az, hogy a toxinok eltávolításán túlmenően a metabolikus funkciók (mint pl. lipid és plazma lipoprotein szintézis, karbohidrát homeosztázis regulációja, szérum albumin és véralvadási faktorok termelése, stb) is működnek egy egységben és nincs szükség további eszközök használatára. Jelenleg számos BAL eszköz klinikai kipróbálása folyik.

Sorozatos vizsgálatok bizonyították, hogy a BAL használata kb felére csökkentia az akut májelégtelenség halálozási statisztikáját. A vizsgálatok összehasonlítható eredményeket adtak a standard bioreaktoros kezelési eljárásokkal, melyekben sertés májsejteket alkalmaztak. A máj dialízis toxinmentesítési eljárás májelégtelenségben szenvedő betegek számára, de ugyancsak máj-vese szindrómában szenvedő betegek esetében is reményekkel kecsegtető megoldás. Az eljárás alapelve nagyon hasonlít a hemodialíziséhez.

A molekuláris adszorbens recirkulációs rendszer (Molecular Adsorbents Recirculation System (MARS)) a legjobban ismert és legalább tíz éve használt testen kívüli máj dialízis rendszer. Két különálló dialízis áramlási kört tartalmaz. Az első körben szérum albumin van, amely a beteg vérével van kontaktusban egy szemipermeábilis membránon keresztül és két speciális filtert is tartalmaz, amelyek megtisztítják az albumint miután a toxinokat abszorbálta a beteg véréből. A második áramlási körben egy hemodializáló gép van amit arra használnak, hogy tisztítsák az albumint mielőtt visszajuttatják a szemipermeábilis membránhoz, ahol újra kontaktusba kerül a beteg vérével. A MARS rendszer el képes távolítani a toxinokat, mint pl. ammónia, epesavak, bilirubin, réz, vas és fenolok.

Bőr sérülések terápiájához készített termékek

Bőr graftokat gyakran használnak súlyos sérülések esetén, amikor a bőr nagy felületen sérült. Ilyenkor a sérült bőrfelületet először eltávolítják és ezután végzik a graft beültetését. A graft fő feladata: (1) lecsökkenti a kezelés időtartamát (és a kórhában töltött időt), és (2) javítja a bőr funkcióit és megjelenését a sérülés helyén. A bőr graftoknak két típusa van. A gyakrabban használt graft típus esetében egy vékony réteg bőrt távolítanak el a test ép bőrrétegéből, avagy teljes bőrvastagságú graftok készítenek a donor területről. A vékony rétegű graft használata kockázatosabb abból a szempontból, hogy a beteg területre rá tud-e nőni a bőr, míg a donor területen viszont sokkal kisebb heget hagy. A sebész dermatome-ot (egy speciális szerkezet, amivel vékony szeleteket vág a bőr felszínéből) használ, hogy kivágja a graftot a donor helyről. A seb nem lehet túl mély, különben a graft nem sikerül, hiszen a vérerek, amik a bőr táplálását végzik a seb dermis rétegének ereiből kell belenőjenek az új szövetbe. A teljes vastagságú bőr graft készítésekor a donor rész gyakran gyorsabban gyógyul, mint a sérülés, és kevésbé fájdalmas, mint a vékony graft. Teljes vastagságú bőrgraftok gyakran szükségesek a súlyosabb égési sérülések kezelésére. Ilyen esetben a bőr mindkét rétegét graftolják. Teljes-vastagságú autograftokat készíteni nehezebb, mint részleges vastagságú graftokat, de sokkal jobb kontúrt biztosít, természetesebb a színe és a graftolt terület kevésbé húzódik össze. A bőrdarabot az alatta levő izommal és érhálózattal együtt transzplantálják. Ezt a beavatkozást akkor végzik, amikor a szövetsérülés kiterjedt, mint pl. az alsó végtag nyílt törése esetén, ahol a bőr elvesztése szignifikáns és esetlegesen el is fertőződött. A hát és a has bőrét gyakran használják teljes-vastagságú donorként. A teljes vastagságú bőr graft negatívuma az, hogy a donor terület sebe nagyobb és gondosabb ápolást igényel. Gyakran előfordul, hogy vékony bőr graftot kell alkamazni, hogy befedjék a vastag bőrgraft kimetszési helyén a donor területet.

A bőr graft procedúrák legfontosabb lépése a seb előkészítése a graftolásra. A bőr graftok ugyanis nem tapadnak meg és maradnak életképesek, ha az érhálózat csekély (pl. porc vagy inak területén) vagy olyan szöveti területeken sem maradnak életképesek, amelyet sugárkárosodás ért. A beteg területet teljesen meg kell tisztítani a halott szövetektől, idegen anyagtól vagy bakteriális szennyezettségtől.

Amennyiben a test több mint 30–40%-a megégett, a bőrt biotechnológiai módszerekkel készített termékek felhasználásával próbálja pótolni a sebész. Az INTEGRA® Dermal Regeneration Template (bőr regenerációs templát) (XIV-1. ábra) egy innovatív termék, amely a bőrt teljes mélységében segíti regenerálni.

XIV-1. ábra: Integra® bőr-helyettesítő

Két rétegből áll: az első, azaz a szilikon külső réteg funkcionál epidermiszként. A második réteg egy pórusos mátrix, amely a dermiszt hivatott pótolni. Amikor egy égett területre helyezik, a dermális rész vázként funkcionál és stimulálja a bőr regenerációját. A szilikon réteg pedig védi az égési sérülést a fertőzésektől és a hővesztéstől. Amint a dermális sejtek visszanőttek a templáton keresztül, a szilikon réteget eltávolítják és egy vékony epidermális bőr graftot helyeznek a felszínére. Az INTEGRA® templát lassan bio-degradálódik és ami a helyén marad az flexibilis, hajlékony és növekvő bőr. Az INTEGRA Templátot az FDA először égésekre engedélyezte. Az engedélyezés óta több mint 10 000 betegnél használták.

Az epiteliális allograft kultúrákat (Cultured Epithelial Allograft (CEA)) először 1981-ben vezették be. Az eljárás során 3–4 cm2-es meg nem égett bőrt vesznek pl. a szemérem-tájékról. Emberi epidermális sejteket apró bőr biopsziákból izolálják, majd előzetesen besugárzással osztódás gátolt 3T3 fibroblaszt „feeder”-rétegen tenyésztik, melynek az a szerepe, hogy a mesenchimális kapcsolatot biztosítsa in vitro. A „feeder réteg” biztosítja az osztódó epiteliális sejtek és keratinociták optimális klonális expanzióját. Ezen feltételek mellett, néhány keratinocita osztódni kezd és kolóniákat képez, majd 3–4 héttel később a 8–10 sejt vastag CEA réteggé válik. A tenyésztett epiteliális réteget egész sejtrétegként enzimatikus úton választják le a műanyagról. Ezután nagyon óvatosan valamilyen támasztó anyagra kell helyezni, mint pl. vazelines gézre a transzplantáció előtt. A fenti módszer kiváló eredményei annak köszönhetők, hogy az epitélium bazális-apikális orientációjú és ezt megtartja akkor is, amikor a sebre helyezik a tenyésztő edényből. 3 vagy 4 hét elteltével, a 3-cm2-es biopszia több mint 5 000–10 000-szeresre növelhető és elegendő bőrt szolgáltat egy felnőtt teljes test felszínéhez. Ezt a módszert (CEA) önmagában vagy INTEGRA ®-val kombinálva is alkalmazzák.