Ugrás a tartalomhoz

Molekuláris diagnosztika

Dr. Balogh István, Dr. Kappelmayer János, Dr. Tőzsér József (2011)

Debreceni Egyetem

13. fejezet - 13. A molekuláris diagnosztika metodológiája

13. fejezet - 13. A molekuláris diagnosztika metodológiája

Tartalom

A diagnosztika során az adott molekuláris problémához kell választani a megfelelő módszertant. A mutációs szűrő módszereket akkor használjuk, ha ismert génben keresünk ismeretlen mutációt. Ezek a módszerek PCR amplifikáció alapúak és a DNS fizikai tulajdonságait használják fel. Korábban az egyszálú DNS konformációs polimorfizmust (SSCP, single strand conformational polymorphism), a denaturáló grádiens gél elektroforézist (DGGE) és a heteroduplex analízist használták.

Az SSCP során a PCR reakciót követően a mintát felhevítik, majd nagyon hirtelen lehűtik. Ekkor a komplementer DNS szálak nem tudják megtalálni egymást, így a stabilizáció az adott egyszálú DNS-en belül valósul meg. A termékek nem denaturáló elektroforézissel történő elválasztása során a konformáció különbség mobilitás különbségben mutatkozik meg. Hasonló alapelvű a heteroduplex analízis is, csak ott a lassú hűtés miatt a komplementer szálaknak lehetőségük nyílik a hibridizációra. A DGGE során a denaturáció egy grádiens gél elektroforézis során valósul meg.

Később a megfelelő műszerek optimalizálásával lehetőség nyílt egyfajta automatizációra (dHLPC, 13.1. ábra). A módszer használata azon alapul, hogy a rendszerben jelen van vad típusú és mutáns allél. PCR amplifikációt követő denaturációt végzünk, majd a rendszer megfelelő körülményeinek kiválasztásával engedjük a komplementer szálak rehibridizációját. Mutáció esetén két komplex alakulhat ki:

  • - homoduplexek, melyek a vad típusú sense és vad típusú antisense, valamint a mutáns sense és mutáns antisense szálak hibridizációjával alakulnak ki

  • - heteroduplexek, melyek a vad típusú sense mutáns antisense, valamint a mutáns sense és vad típusú antisense szálak hibridizációjával alakulnak ki.

A következő lépés egy speciális HPLC rendszeren történő elválasztás, részlegesen denaturáló körülmények között. A heteroduplexek és homoduplexek mobilitása a részlegesen denaturáló körülmények között különböző, így a detektált csúcsok száma utal az esetleges mutáció jelenlétére. A módszer, hasonlóan a többi mutáció szűrő módszerhez, nem ad felvilágosítást a mutáció minőségéről és a PCR terméken belül elfoglalt helyéről, ezért az aberráns mobilitást mutató mintákat tovább kell vizsgálni (pl. DNS szekvenálással) annak megállapítására, hogy az eltérés ártalmatlan polimorfizmus vagy csendes mutáció, esetleg a betegség hátterében álló patogén mutáció.

13.1. ábra - 13.1. ábra. Ismeretlen mutáció keresése (mutációs szűrő módszerek): denaturáló HPLC (dHPLC)

13.1. ábra. Ismeretlen mutáció keresése (mutációs szűrő módszerek): denaturáló HPLC (dHPLC)

Amennyiben az adott betegségben mutációs forró pont nem ismert, de az tudott, hogy az aminosav cserével járó mutációk kevéssé játszanak szerepet a fenotípus kialakításában, úgy a protein trunkációs teszt (protein truncation test, PTT) használata segíthet a molekuláris háttér felderítésében. A PTT az olvasási keret eltolódással, splicing helyet érintő, illetve nonsense mutációk vizsgálatára alkalmas, transzkripción és transzláción alapuló vizsgáló módszer. A kiindulási anyag vagy mRNS, amelyet reverz transzkripcióval cDNS-sé alakítunk, vagy ritkábban egy-egy nagy exon a genomiális DNS-ben. A módszer alkalmazása során módosított primerekkel start kodont építünk be a vizsgálandó mintába és in vitro transzkripciót, majd ezt követően transzlációt végzünk. A keletkezett terméket SDS-PAGE elektroforézissel választjuk el és detektáljuk valamilyen általában specifikus módon (pl. antitest segítségével). A módszer előnye és hátránya is az, hogy kizárólag olyan mutációkat tud vizsgálni, melyek a stop kodon helyét megváltoztatják (akár trunkáló módon, akár az eredeti stop kodon mutálódása miatt kialakuló hosszabb fehérje keletkezése miatt), aminosav cserével járó eltéréseket nem. Az ábra alsó részén példák láthatók mind trunkáló (3,8,11. sáv), mind az eredeti terméknél hosszabb fehérjét eredményező mutáció (5. sáv) vizsgálatára.

Mivel az in vitro rendszer nem tartalmazza a releváns komponenseket, a detektált eltérés nem biztos, hogy in vivo eljut a fehérje megszintetizálásának szintjére (nonsense-mediated mRNA decay nem történik meg a teszt használatakor). A PTT elterjedését gátolja nehéz, laborigényes kivitelezése.

13.2. ábra - 13.2. ábra. Mutációk patogenitás vizsgálata: protein trunkációs teszt (PTT, protein truncation test)

13.2. ábra. Mutációk patogenitás vizsgálata: protein trunkációs teszt (PTT, protein truncation test)