Prev
Next 
20. Flavonoidok folyadékkromatográfiás meghatározása növényi alapú élelmiszerekből
Tanulási célok
Flavonoidok folyadékkromatográfiás meghatározása növényi alapú élelmiszerekből

Bevezetés

Bevezetés

A flavonoidok növényi másodlagos anyagcseretermékek, melyekhez számos biológiai funkció társítható. Ezek a vegyületek részét képezik a növény védelmi rendszerének, így például nagy mennyiségben szintetizálódnak a különböző stresszhatások következtében, mint például UV besugárzás, sérülés, vagy gombás fertőzések. A flavonoidok egy jellegzetes csoportja, az antocianinok viszont számos növény lila, vörös színének kialakításában játszanak főszerepet. Mindezeken túl táplálkozási szempontból is jelentősek, hiszen epidemiológiai vizsgálatok tapasztalatai azt mutatják, hogy amennyiben növényi alapú élelmiszerek fogyasztásával flavonoidokat viszünk a szervezetünkbe, számos jótékony hatás társítható hozzájuk. Többek között leírták gyulladáscsökkentő szerepüket, valamint jótékony védő hatásukat például szív-érrendszeri és rákos megbetegedések, vagy éppen cukorbetegség esetén. Elsősorban a flavonoidokhoz társítható biológiai hatások és így táplálkozási jelentőségük teszi szükségessé olyan korszerű analitikai módszerek alkalmazását, amelyekkel ezen alkotók vizsgálata korszerűen megvalósítható. Ugyanakkor további élelmiszeripari vonatkozásként említhető, hogy jellemző flavonoidok vizsgálatával válaszokat kaphatunk például borok eredetére és fajtaösszetételére vonatkozóan is.
A flavonoid kifejezés gyűjtőfogalom, amely rendkívül sokszínű molekulacsaládot takar. Kémiai szempontból flavonoidok a C6-C3-C6 felépítésű difenil-propán alapvázzal rendelkező molekulák, melyek középső pirán gyűrűje különböző oxidáltságú lehet. A flavonoidok az alapváz telítetlensége és szubsztitúcíós mintázata alapján számos alosztályba sorolhatók. Ezeken a csoportokon belül az alapvázon található hidroxilcsoportok mennyisége és mintázata alapján változatos egyedi képviselőket találunk. Néhány jellemző flavonoid felépítését szemlélteti az 1. ábra. A flavonoidok további fontos jellemzője, hogy nitrogéntartalmú részt nem tartalmaznak.
A flavonoidokra jellemző, hogy bár a növényekben szabad formában is megtalálhatók, legtöbbször különböző cukrokkal alkotott konjugátumaik (glikozidok) formájában fordulnak elő. A legjellemzőbb cukrok a glükóz és a ramnóz, illetve a diglikozidok közül a rutinóz, melyek főként az alapváz 3-as és 7-es szénatomján található -OH csoporton keresztül kapcsolódnak. A variációs lehetőségeket, így a flavonoidok sokszínűségét bővíti, hogy gyakoriak az olyan flavonoid-glikozidok, melyekhez két-három cukormolekula is kapcsolódik, továbbá a kapcsolódott cukormolekulák további származékokat képezhetnek fenolos vagy alifás szerves savakkal. Mindezeket számba véve az ismert és leírt flavonoidok száma mintegy 6000-8000. A flavonoidok analitikai vizsgálatakor e molekulacsalád összetettségét nem szabad figyelmen kívül hagyni. A flavonoid-glikozidokra példaként az egyik legelterjedtebb flavonoid glikozid, a kvercetin-3-O-rutiozid (más néven: rutin) látható a 2. ábrán.

Alkalmazott minta-előkészítési eljárások

Alkalmazott minta-előkészítési eljárások

Már a minta-előkészítés tervezésekor figyelembe kell venni, hogy a flavonoidok (különösen a glikozidok) a növény saját enzimeinek hatására degradálódhatnak. Ennek csökkentése érdekében az extrakciót megelőző mintafeldolgozás során célszerű a homogenizált minta víztartalmát csökkenteni. Ehhez kiválóan alkalmazható technika a fagyasztva szárítás, más néven liofilezés, mellyel kíméletesen, hőterhelés nélkül szárítható a minta. Az analitikai minta-előkészítés egyik legfontosabb lépése a vizsgálni kívánt alkotók izolálása. Általánosságban elmondható, hogy a növényekben található flavonoidok extrakciójához leggyakrabban 20-80% alkoholtartalmú alkohol-víz elegyet használnak. Amennyiben kimondottan valamely vegyülettípus mennyiségi meghatározása a cél, ennél specifikusabb extrakciós eljárásokat is alkalmazhatunk. A komponensek polaritása döntő szerepet játszik az alkalmazandó kivonószer megválasztásakor. A kevésbé poláros flavonoidok (flavononok, metilezett flavonoidok) szelektív kivonásához akár apoláros szerves oldószereket is használhatunk, mint például kloroform, etil-acetát. A jóval polárosabb glikozidok és monomer antocianinok kivonásához azonban főként alkoholok (metanol, etanol) illetve a már említett alkohol-víz elegyek alkalmasak. Amennyiben antocianinokat is vizsgálni kívánunk, az extrakció hatékonyságának növelése és az antocianinok stabilitásának érdekében a kivonóoldatba célszerű 1-5% ecetsavat, vagy hangyasavat keverni. Az extrakció kivitelezhető egyszerű mágneses keverővel történő keveréssel, illetve ultrahangos készülékek alkalmazásával. Az extrakcióval előállított kivonatot centrifugálással vagy szűréssel választjuk el az üledéktől. Ezt követően – a vizsgálni kívánt alkotóktól és a mérési módszertől is függően – további minta-előkészítési eljárások következhetnek.

A kinyerhető információ és a vizsgálati módszer kapcsolata

A kinyerhető információ és a vizsgálati módszer kapcsolata

A flavonoidok sokszor csak mint molekulacsoport érdekesek, és ilyenkor egyetlen összegző méréssel kívánunk információt nyerni egy minta „összes” flavonoid-tartalmáról. Ez a megközelítés nem ritka az analitikában, hasonló logika alapján végezzük például a zsírtartalom és fehérjetartalom-meghatározást. Ilyenkor az említett példákhoz hasonlóan a molekulacsoport valamely közös jellemzőét használjuk ki a mérés során. Visszatérve a flavonoidokhoz, amennyiben a vizsgálat célja azonban az, hogy a mintából kivont flavonoidokat és azok glikozidjait egyedi módon, mennyiségileg határozzuk meg, mindenképpen valamilyen kromatográfiás módszer szükséges az egyes alkotók elválasztásához. Ez gyakorlatilag folyadékkromatográfiát jelent, ezen belül is a fordított fázisú HPLC a legszélesebb körben alkalmazott eljárás. Ilyenkor az eltérő szubsztitúciós mintázatú egyedi flavonoidmolekulák és ezek cukrokkal alkotott különféle konjugátumai analitikai szempontból mind-mind egyedi molekulaként értelmezendők. Ezeknek az alkotóknak a kromatográfiás retenciós ideje az eltérő fiziko-kémiai tulajdonságok miatt ugyanis különbözni fog. Kromatográfiás módszereknél a mennyiségi meghatározáshoz szükségünk van a meghatározni kívánt molekula standard referenciaoldatára. Ebből a referenciaanyagból több különböző koncentrációjú hígítás kromatogramját felvéve a csúcsterületek és a hozzájuk tartozó ismert koncentrációértékek alapján meghatározzuk a kalibrációs összefüggést. A szokásos eljárásoknak megfelelően, minden vizsgálni kívánt alkotóra egyedi kalibrációs összefüggést határozunk meg. Mint azt korábban említettük, flavonoidok esetében a lehetséges kombinációk (lásd szubsztitúciós mintázat, illetve a konjugátumok jelenléte) rendkívüli módon megnövelik a mintában természetes módon előforduló molekulák számát. Sokszor egyrészt nem áll rendelkezésre információ arra vonatkozóan, hogy milyen egyedi molekulák jöhetnek számításba, másrészről a rendelkezésre álló standard anyagok száma is korlátozott. Más szavakkal, a kromatográfiás eljárásoknál hagyományosan mennyiségi meghatározásra alkalmazott módszerek nem mindig kivitelezhetőek. A flavonoid vizsgálatoknál ezért alternatív megoldásokat kell alkalmaznunk, melyek közül a három legelterjedtebbet röviden ismertetjük.

Mennyiségi meghatározás lehetőségei

Kiválasztott célkomponensek vizsgálata
Amikor előzetes ismereteink vannak arra vonatkozólag, hogy az adott típusú mintában milyen flavonoidok találhatók, kézen fekvő megközelítés, ha csupán ezekre összpontosítunk. Példaként említhető, hogy feketeribiszke esetén az antocianin-tartalom zömét az alábbi négy komponens alkotja: delfinidin-3-rutinozid, cianidin-3-rutinozid, delphinidin-3-glükozid és cianidin-3-glükozid. A legtöbb esetben a mintában található antocianin-összetételt kiválóan jellemzik a fő flavonoidokra mért koncentrációértékek. Továbbá, amennyiben ezeknek a meghatározott célkomponenseknek az aránya jelentősen nem változik tételről-tételre, nincs szükség arra sem, hogy minden jelentős mennyiségben jelen lévő alkotót mennyiségileg meghatározzunk. A célnak ilyenkor az is megfelel, ha csupán egyetlen kiválasztott célkomponenst használunk egy tétel antocianin-tartalmának meghatározására. Ezt a megközelítést választva mind az extrakció tervezésekor, mind a mennyiségi meghatározás során csupán a célkomponensekre kell összpontosítanunk.

Az alkotók uniformizálása hidrolízissel

A kiválasztott célkomponensek vizsgálata csak akkor eredményez megbízható eredményt, ha az adott mintatípusban ismertek a fő flavonoidok. Egy-egy kiválasztott ún. index-komponensre alapozott analízis további feltétele, hogy a jellemző flavonoidok aránya jó közelítéssel állandó legyen. Amennyiben mindezek nem állnak fenn, más eljárást kell alkalmazunk. Legelterjedtebb módszer az, amikor a kivonatban megtalálható sokféle flavonoid-alkotót egységes formára hozzuk, azaz uniformizáljuk. Ilyenkor általában sósavas hidrolízisnek vetjük alá a kivonatot, melynek következtében a flavonoid-glikozidokban a flavonoid alapmolekula (ún. aglikon) és a kapcsolódó cukor/cukrok közötti glikozidos kötés felbomlik. Ennek eredményeképpen a kivonatban eredetileg jelen levő konjugátum a hidrolízist követően szabad aglikon formájában lesz jelen. A kromatográfiás vizsgálat során csupán a glikozid részeiket elvesztett aglikonokra kell összpontosítanunk. Ezt az eljárást alkalmazzák például szója alapú étrendkiegészítők izoflavonoid [1] tartalmának meghatározására. Ekkor a mintában jelenlévő két legfontosabb izoflavonid (genistein és daidzein) származékait nem vizsgáljuk külön-külön, hanem azokat összegezve genistein- ill., daidzein egyenértékben adjuk meg. Az uniformizálás következtében a mennyiségi meghatározás lényegesen leegyszerűsödik, ugyanakkor ezáltal lecsökkentjük az analízisből kinyerhető információmennyiséget. Becsülni sem tudjuk, hogy egy adott aglikon eredetileg hányféle származék formájában volt jelen a mintában. Ennek azért van jelentősége, mert egy-egy flavonoidhoz társítható biológiai aktivitás összefüggésbe hozható annak konkrét formáival.

Ismeretlen konjugátumok mennyiségi meghatározása
Amennyiben nem ismerjük a mintatípusban megtalálható flavonoidokat, vagy a mennyiségi meghatározáshoz nem áll rendelkezésre referenciaanyag, azonban fontos az egyes konjugátumok mennyisége, más megoldáshoz kell folyamodnunk. Ilyenkor kihasználhatjuk a flavonoidoknak azt a tulajdonságát, hogy a rendkívüli változatosságuk ellenére a különböző molekulák alapváza többé-kevésbé hasonló. Ez a hasonlóság megnyilvánul spektroszkópiás tulajdonságaikban is. Az ultraibolya-látható tartományba eső (UV-VIS) fény elnyelésekor a kromofór molekularészleteket tartalmazó flavonoid alapváz játszik érdemi szerepet. A glikozil oldalláncok nem befolyásolják jelentősen az elnyelési spektrumot. Ezt példával is illusztrálva a 3. ábrán az apigenin (aglikon) és az apigenin-7-O-glikozid UV-VIS spektruma látható.
A példában bemutatott apigenin esetében tehát a 340 nm detektálási hullámhosszat univerzálisan alkalmazni lehet az apigenin származék esetében is. Ezek alapján a mennyiségi meghatározáskor gyakran alkalmazott eljárás, amikor csupán az aglikon esetében határozzuk meg kalibrációval a koncentráció-abszorbancia összefüggést, és ez alapján határozzuk meg ismeretlen származékok koncentrációját. Fontos hangsúlyozni, hogy csak azonos csoporthoz tartozó flavonoidok esetében alkalmazható ez a módszer elfogadható megbízhatósággal.
Áttekintő-kiegészítő kérdések
  1. Milyen oldószereket alkalmaznak legelterjedtebben flavonoidok kivonása során?
  2. Mit értünk uniformizálás alatt, a minta-előkészítési eljárásokhoz kapcsolódóan?
  3. Miért nem különbözik érdemben egy szabad aglikon és egy cukorral alkotott flavonoid-konjugátum UV-VIS abszorpciós spektruma?

[1] Izoflavonoidok esetén a flavonoid alapvázban lévő fenilcsoport nem a pirán gyűrű 2-es, hanem a 3-as szénatomjához kapcsolódik.
 Prev
Next