Prev
Next 
9. Zöldségfélék nitrit- és nitrát-tartalmának meghatározása: hagyományos és enzimes mintaelőkészítéssel végrehajtott mérések összehasonlítása
Tanulási célok
Zöldségfélék nitrit- és nitrát-tartalmának meghatározása: hagyományos és enzimes mintaelőkészítéssel végrehajtott mérések összehasonlítása

Elméleti bevezetés

Az élelmiszerekben jelenlévő - például egyes tartósított húskészítményekben, sajtokban engedélyezett -, valamint az ivóvízben lévő nitrát látszólag nem veszélyes az emberi szervezetre. A nitrát csak akkor okozna heveny mérgezést, ha több kanállal fogyasztanánk belőle. A nitrát nitritté az ember szájában és bélrendszerében alakul át, mégpedig a baktériumok közreműködésével. A nitritek - szemben a nitrátokkal - már akut mérgezést is okozhatnak. A folyamatot methemoglobinémiának nevezi a szakirodalom, amelynek következtében a szervezetben oxigénhiány jön létre. Mivel a vérben az oxigént a vörösvértestekben lévő hemoglobin szállítja, ha a nitrát megköti a hemoglobint, az képtelen ellátni a feladatát. Bár methemoglobin normális körülmények között is keletkezik a vérben, nem támad zavar a szervezetben, ha mennyisége nem nagyobb a hemoglobin 0,5-1 százalékánál. A methemoglobinémia tünetei: aluszékonyság, bágyadtság, koncentrációs zavarok, szellemi és fizikai teljesítőképesség-csökkenés. A nitritmérgezés felnőtteknél nagyon ritka, ám a három hónapnál fiatalabb csecsemők fokozottan veszélyeztettek. A kisbabák hemoglobinja ugyanis könnyebben köti meg a nitritet, illetve a lebontó enzim működése még fejletlen. Három éves korra fejlődik ki teljesen ez az enzim, s csökken le a mérgezés veszélye. A nitrit jelenlétével kapcsolatos másik probléma a rákkeltő nitrózaminok keletkezése, amelyek rákos elváltozásokat okoznak, főleg a gyomorban, a májban és a tüdőben.

A nitrit és nitrát nem elsősorban húskészítményekkel, hanem zöldségfélékkel és ivóvízzel jut a szervezetünkbe. Az ország egyes területein az ivóvíznek igen magas a nitrát-tartalma, mégpedig azért, mert a műtrágyából kioldódó nitrátok a talajba, onnan pedig az ivóvízbe jutnak. Mivel a nitrátot forralással nem lehet a vízből eltávolítani, ezért ez a víz nem használható még főzéshez sem.
Az élelmiszerek nitrát tartalma igen sok tényezőtől függ, s a növények fejlődéséhez bizonyos mennyiségű nitrátra szükség is van. Egy felnőtt átlagos napi nitrátbevitele 75 mg, mely mennyiség nagy hányada (87 százaléka) a zöldségekből, kisebb része (6 százaléka) gyümölcsökből, elenyésző hányada (2,6 százaléka) pedig ivóvízből származik. Aki csak növényi koszton él, annak a vegyes táplálékon élőknél 3,5-szer több nitrát jut a szervezetébe. A nitrátos víz, a magas nitrát-tartalmú zöldség, gyümölcs elsősorban a csecsemőkre, a kisgyerekekre és a várandós kismamákra nézve jelent, hiszen kisbabáknál akár a rejtélyesnek nevezett bölcsőhalál oka is lehet a methemoglobinémia.
A különböző zöldségfélék, mint a fejessaláta, spenót, káposzta, cékla, retek, torma nagy mennyiségű nitrátot tartalmazhatnak. A rukkola ugyancsak nagy mennyiségű nitrát felvételére és tárolására képes. Az EU jelenleg tervezi a spenótban és salátában lévő nitrát-tartalomra vonatkozó határérték megemelését, továbbá rukkola esetében határérték megállapítását. A nitrát expozíció csökkentése érdekében javasolt a szezonális zöldségek fogyasztása, mert esetükben kisebb nitrát-tartalommal kell számolni, hiszen az optimális termesztési körülményeknek köszönhetően ezeknél kevesebb műtrágyát alkalmaznak.

A témában az Európai Élelmiszer-biztonsági Hivatal /EFSA/ állásfoglalása 2008-ban jelent meg.

Csecsemők kiegészítő táplálékaként többféle gyümölcsöt, zöldséget használunk, amelyek segítik a baba egészséges fejlődését. Nyolc hónapos kor alatt azonban fokozottan figyeljünk a nitrát kumuláló zöldségekre a methemoglobinémia elkerülése végett. Régiónkban igen elterjedt a cékla, mint vérképzést segítő zöldség, az egy évesnél fiatalabb gyerekek táplálásában. Sajnos, nem egy esetben okozott súlyos állapotot a főtt cékla és a nitrátban feldúsult céklalé.

Nitrát tartalom szempontjából élelmiszer-növényeinket az alábbiak szerint csoportosíthatjuk.

Fák, cserjék, gabonafélék

Gyökérzetük a nitrátot rövid idő alatt elbontja, ezzel magyarázható a gyümölcsök, gabonafélék elenyésző nitrát tartalma.

Szabadon és fólia alatt termesztett, NEM nitrát kumuláló zöldségfélék

Nitrát tartalmuk általában nem éri el a 200 mg/kg értéket.

Nitrát kumuláló növények:
Rendszerint 400 mg/kg-tól több ezer mg/kg-ig terjedő nitrát tartalommal rendelkeznek. Magyarországon legismertebb nitrátkumuláló növények: cékla, fejes saláta, gyökérzöldség, karalábé, mangold, paraj, retek, sárgarépa, sóska.

Az első két csoportba tartozó zöldség/gyümölcsfélék - nitrát tartalom szempontjából - csecsemő táplálásra alkalmasak, azok laboratóriumi vizsgálata nem szükséges.

Az analitikai meghatározás elvi alapja

Az analitikai meghatározás elvi alapja

Nitrát-tartalom meghatározása
1., Boehringer teszt segítségével – alsó méréshatár 2 mg/kg friss minta
2., Na-szaliciláttal – mérési tartomány - alsó méréshatár 50 mg/kg friss minta
Nitrit-tartalom meghatározása
Gries – Ilosvay reakció segítségével – alsó méréshatár 5 mg/kg friss minta

Szükséges eszközök, berendezések, műszerek, vegyszerek

Eszköz és műszerigény
250 vagy 500 cm^3-es Erlenmeyer lombik, 50,0 és 250,0 cm^3-es mérőlombik, bepárló csésze, tölcsér, redős szűrőpapír, elektromos főzőlap, spektrofotométer 1 cm-es üvegküvetta pár, szárítószekrény
Vegyszerigény

a., mintaelőkészítéshez
Carrez I. oldat: K_4[Fe(CN)_6.3H_2O (7,5 g 50 cm^3 végtérfogatra kiegészítve)
Carrez II. oldat: (CH_3COO)_2Zn.2H_2O (11 g + 1,5 cm^3 jégecet, 50 cm^3 végtérfogatra kiegészítve.
A fehérje lecsapásához használt Carrez I. és Carrez II. oldat kb 2 hétig tartható el. A Carrez II oldatot sötétben kell tárolni.

b., nitrát meghatározás enzimatikus módszerrel
3 részes Boehringer teszt

c., nitrát meghatározás spektrofotometriás módszerrel
1 mg/cm^3 NaNO_3 törzsoldat (0,1371 g/100,0 cm^3), 0,5%-os Na-szalicilát oldat, cc. kénsav, 10 mol/dm^3 NaOH oldat

d., nitrit meghatározás spektrofotometriás módszerrel
1 mg/cm^3 NaNO_2 törzsoldat (0,1500 g/100,0 cm^3), szulfanilsav oldat (0,6 g szulfanilsav + 70 cm^3 desztillált víz + 20 cm^3 cc. HCl/100 cm^3 végtérfogatra kiegészítve), \alpha-naftilamin oldat (0,215 g  \alpha-naftilamin 25 cm^3 0,4 mol/dm^3 HCl-ban feloldva, kissé melegítve és 75 cm^3 végtérfogatra kiegészítve), 1 mol/dm^3 Na-acetát oldat

Mintaelőkészítés

(a) A frissen darált, homogenizált mintából – annak nitrit- és nitráttartalmától függően - 5-15 g-nyi mennyiséget mérünk be az Erlenmeyer lombikba.
(b) Hozzáadunk 100 cm^3 desztillált vizet
(c) Forró vízfürdőben 15 percen keresztül extraháljuk
(d) A kihűlt oldatot maradék nélkül 250,0 cm^3-es mérőlombikba mossuk, a lombikban levő extrahált mintát több részletben, kis mennyiségű desztillált vízzel átöblítjük
(e) A mérőlombikba mosott mintához 4 cm^3 Carrez I. és 4 cm^3 Carrez II oldatot adunk a minta fehérjetartalmának lecsapása céljából. Többször összerázzuk az oldatot, majd jelre töltjük
30 percig állni hagyjuk
(f) Redős szűrőpapíron szűrjük az oldatot, a szűrlettel dolgozunk tovább

Nitrát tartalom meghatározása enzimatikus módszerrel

(a) Előállítjuk a Boehringer teszt oldatait: az I.. oldatot hígítás nélkül használjuk (ez imidazol puffer, pH \approx 7,8). A II. oldat (NADPH és FAD tartalmú) elkészítéséhez mintánként 1 tablettát oldunk fel 1 cm^3 I.. oldatban, így jutunk a II* reagenshez. A III. oldatot 0,8 cm^3 kétszer desztillált vízzel hígítjuk, így jutunk a III* reagenshez.
(b) A táblázatnak megfelelően állítsuk össze a vak és a minta oldat reakció elegyét:
Küvettába pipettázni
Vak
Minta
II* reakcióelegy
1,000 cm^3
1,000 cm^3
Mintaoldat
-
0,100 cm^3
Mérési hullámhossz: 340 nm
Alaposan rázzuk össze az elegyet, majd 3 perc után mérjük meg a minta abszorbanciáját a vakkal szemben (A_1),
majd elindítjuk a reakciót a III* elegy hozzáadásával
III* reakció elegy
0,050 cm^3
0,050 cm^3
Az elegyet újra összerázzuk, majd 40 perccel az A_1 abszorbancia mérését követően ismét megmérjük az abszorbanciát (A_2), majd 20 perc elteltével megismételjük a mérést (A_3)
Amennyiben egy fényutas spektrofotométer áll rendelkezésünkre, a vakminta abszorbancia értékeit a mintával azonos időközönként kell megmérni.

(c) Mérési adatok kiértékelése
  • Számítsa ki az abszorbancia különbségeket:\Delta A= (A_1-A_2) – 2x (A_2-A_3). Amennyiben
    \Delta A > 1,000, akkor a minta nitrát-tartalma túl magas, a meghatározást a látható tartományban a spektrofotometriás módszerrel kell folytatni.
  • Általános átszámítási összefüggés
c = \fracV * MG\varepsilon * d * v * 1000 * \Delta A [mg/ml]
Az átszámítási összefüggésben szereplő paraméterek:
c= nitrát koncentráció, mg/cm^3
V= végső térfogat, cm^3
v= minta térfogat,cm^3
MG= a meghatározandó szubsztrát molekulatömege, g/mol
d= fényút, cm
\varepsilon= A NADPH abszorpciós koefficiense, 340 nm-nél 6,3 dm^3*mmol^-1*cm^-1

A konstansok behelyettesítésével kapott összefüggés:
c=\frac3,050* 62,06,3 * 1,00 * 0,100 * 1000* \Delta A=0,3000* \Delta A\text \left[ \textmg/ml \right]
  • c_minta= a minta nitrát tartalma mg/ml mintaoldat, hígítási faktor (50,0 és 250,0 cm^3-es mérőlombikokat alkalmazva) és a bemérés (m_bemeres) figyelembe vételével az eredeti friss minta nitrát-tartalmának meghatározása mg/kg friss minta egységben

Nitrát tartalom meghatározása spektrofotometriás módszerrel

(a) 50 mg/dm^3 nitrát törzsoldat hígítása, amelyből a kalibrációs oldatsor készül (az 1 mg/cm^3 oldatból 2,5 cm^3-t 50,0 cm^3 végtérfogatra hígítunk)
(b) 25 cm^3-es bepárló csészében összeállítjuk a reakcióelegyet: 5,0 cm^3 minta + 1 cm^3 Na-szalicilát. Alaposan összekeverjük, majd szárítószekrényben 100ºC-on szárazra pároljuk. A kalibrációs sorhoz ugyanígy készítjük elő a mintát: a hígított nitrát törzsoldatból rendre bemérjük a következő térfogatokat: 1,0; 3,0; 5,0 cm^3, mindegyikhez 1 cm^3 Na-acetátot adunk, majd elkeverést követően szárítószekrényben 100 ºC-on szárazra pároljuk
(c) A szárazra párolt mintákhoz – miután kihűltek – 1 cm^3 cc. kénsavat adunk, alaposan elkeverjük, majd 10 percig állni hagyjuk.
(d) Kb. 30 cm^3 desztillált vízzel óvatosan felhígítjuk a kénsavas mintákat és maradék nélkül 50,0 cm^3-es mérőlombikba mossuk a bepárló csészék tartalmát.
(e) 7 cm^3 10 mol/dm^3 NaOH oldatot adunk a mintákhoz. Megvárjuk, míg lehűlnek az oldatok és jelre töltjük a lombikokat.
(f) 20 perc reakció idő eltelte után 410 nm hullámhossznál mérhető a jellegzetes sárga színű vegyület abszorbanciája
(g) A mérési adatok kiértékelése:
  • Kalibrációs egyenes megszerkesztése
  • Az egyenes egyenletének megállapítása
  • A minta abszorbanciája és a kalibrációs egyenes egyenlete alapján a minta nitrát- tartalmának kiszámítása \rightarrow c (mg/dm^3 nitrát)
  • Hígítási faktor (50,0 és 250,0 cm^3-es mérőlombikokat alkalmazva) és a bemérés (m) figyelembe vételével az eredeti friss minta nitrát-tartalmának meghatározása
\frac2,5 * 10^3 * cm mg nitrát/kg friss tömeg

Nitrit tartalom meghatározása spektrofotometriás módszerrel

(a) 10 mg/dm^3 nitrit törzsoldat hígítása, amelyből a kalibrációs oldatsor készül (az 1 mg/cm^3 oldatból 0,5 cm^3-t 50,0 cm^3 végtérfogatra hígítunk)
(b) 50,0 cm^3 mérőlombikban a reakcióelegy összeállítása: 5,0 cm^3 minta +1 cm^3 szulfanilsav →2 perc reakció idő, majd 1 cm^3 \alpha-naftilamint, végül 1 cm^3 Na-acetátot mérünk össze és jelre töltjük az elegyet.
(c) 15 perc reakció idő eltelte után 520 nm hullámhossznál mérhető a jellegzetes pirosas színű vegyület abszorbanciája.
(d) 50,0 cm^3 mérőlombikban a kalibráló oldatsor elkészítése: 0,5 cm^3, 1,0 cm^3 és 1,5 cm^3
10 mg/dm^3 nitrit törzsoldatot mérünk ki (így rendre 0,1; 0.2; 0.3 mg/dm^3 nitrit koncentrációjú oldathoz jutunk).
(e) A reakció elegynél ismertetett sorrendben hozzáadjuk a reagenseket, és 15 perc reakció idő eltelte után mérjük a kalibráló oldatok abszorbancia értékét 520 nm hullámhossznál.
(f) A mérési adatok kiértékelése:
  • Kalibrációs egyenes megszerkesztése
  • Az egyenes egyenletének megállapítása
  • A minta abszorbanciája és a kalibrációs egyenes egyenlete alapján a minta nitrit- tartalmának kiszámítása → c (mg/dm^3 nitrit)
  • Hígítási faktor (50,0 és 250,0 cm^3-es mérőlombikokat alkalmazva) és a bemérés (m) figyelembe vételével az eredeti friss minta nitrit-tartalmának meghatározása
\frac2,5 * 10^3 * cm mg nitrit / kg friss tömeg

Felhasznált irodalom, érvényes szabványok

Felhasznált irodalom, érvényes szabványok
  • Nitrat in Rucola, Spinat und Salat . Aktualisierte Stellungnahme Nr. 032/2009 des BfR vom 06. Februar 2009. http://www.mebih.gov.hu/index.php/hu/szakmai-rovat/kemiai-veszelyek/346-zoeldsegek-nitrat-tartalma.html
  • Nitrate in vegetables. Scientific Opinion of the Panel on Contaminants in the Food chain1. (Question No EFSA-Q-2006-071). The EFSA Journal (2008) 689, 1-79
  • A BIZOTTSÁG 1822/2005/EK RENDELETE (2005. november 8.) a 466/2001/EK rendeletnek az egyes zöldségekben található nitrát tekintetében történő módosításáról. Az Európai Unió Hivatalos lapja L 293/11.
  • Methods of Biochemical Analysis and Food Analysis,Cat. No. 10 905 658 035 Boehringer Mannheim, R-Biopharm AG 1989.
  • Upor E., Mohai M., Novák Gy. (1978) Fotometriás nyomelemzési módszerek. Műszaki Könyvkiadó, pp. 271.
Jelenleg érvényben levő magyar szabványok listája
  • MSZ EN 12014-3:2005
    Élelmiszerek. A nitrát- és/vagy a nitrittartalom meghatározása. 3. rész: Húskészítmények nitrát- és nitrittartalmának spektrometriás meghatározása a nitrátot nitritté alakító enzimes redukció után
  • MSZ EN 12014-4:2005
    Élelmiszerek. A nitrát- és/vagy a nitrittartalom meghatározása. 4. rész: Húskészítmények nitrát- és nitrittartalmának ioncserés kromatográfiás meghatározása
  • MSZ EN 12014-1:1997/A1:2000
    Élelmiszerek. A nitrát- és/vagy a nitrittartalom meghatározása. 1. rész: Általános megfontolások
  • MSZ EN 12014-1:1999
    Élelmiszerek. A nitrát- és/vagy a nitrittartalom meghatározása. 1. rész: Általános megfontolások
  • MSZ EN 12014-2:1999
    Élelmiszerek. Nitrát és/vagy nitrittartalom meghatározása. 2. rész: HPLC/IC módszer zöldségek és zöldségtermékek nitrittartalmának meghatározására
  • MSZ EN 12014-5 :1999
    Élelmiszerek. Nitrát- és/vagy nitrittartalom meghatározása. 5. rész: Zöldségtartalmú bébi- és gyermekételek nitrát-tartalmának enzimes meghatározása
  • MSZ EN 12014-7:1999
    Élelmiszerek. Nitrát- és/vagy nitrittartalom meghatározása. 7. rész: Zöldségek és zöldségtermékek nitrát-tartalmának meghatározása folyadékáramlásos (CONTIFLO)
A feladat végrehajtását követően gondolja át a következő problémákat:
  1. Milyen élelmiszerek vizsgálata során érdemes az enzimatikus nitrát tartalom meghatározást elvégezni?
  2. Milyen mérési tartományban alkalmazható a Gries-Ilosvay reakció?
  3. Mit tenne, ha jellegzetesen vörös színű zöldséget (pl. céklát) kellene nitrit tartalom meghatározás során feldolgoznia? Mi a helyes eljárás ebben az esetben?
  4. A mérések minőségbiztosítása érdekében milyen megoldási lehetőségeket lát? (CRM, standard addició...)
 Prev
Next