6. Tengeri eredetű élelmiszerek metil-higany tartalmának meghatározása során felmerülő mérési bizonytalanságok azonosítása

Tanulási célok

Tengeri eredetű élelmiszerek metil-higany tartalmának meghatározása során felmerülő mérési bizonytalanságok azonosítása

Bevezetés

Bevezetés

Az előző fejezethez hasonlóan egy gázkromatográfiai feladat kiterjesztett mérési bizonytalanságának meghatározásáról van szó. A jelenlegi célkomponens a tengeri eredetű élelmiszerekben, azon belül is főleg az olyan gyakran fogyasztott ragadozó halakban, mint pl. a tonhalban feldúsuló toxikus higanymódosulat, a metil-higany (1. ábra). A metil-higany leginkább a magzatokra és a kisgyermekekre veszélyes vegyület; a vér-agy gáton átjutva kiterjedt idegkárosodást okoz – gyermeket váró nőknél ebből kifolyólag nem ajánlott a gyakori tonhalfogyasztás. A metil-higany volt a felelős a Minamata-öbölben lejátszódó, legsúlyosabb, szándékos emberi nemtörődömségből fakadó japán ipari katasztófáért is, amelyben több ezer ember halt meg és több tízezer szenvedett ideiglenes vagy maradandó egészségkárosodást.

A metil-higany meghatározás a higany-módosulatanalitika leggyakoribb feladata, ebből fakadóan több mintaelőkészítési és mérési módszert dolgoztak rá ki. A következőkben a lúgos hidrolízisre és SPME /szilárd fázisú mikroextrakció/ eljárásra épített, GC-AFS kapcsolt rendszerrel végrehajtott módszer mintaelőkészítési lépéseit és az azokhoz kapcsolódó mérési bizonytalanságokat vesszük sorra, egy viszonylag kis koncentrációjú hiteles anyagminta /CRM/, a TORT-2 példáján.

Felhasznált vegyszerek és mintaelőkészítés

Felhasznált vegyszerek, standardok és hiteles anyagminták

25%-os KOH-os illetve 18%-os NaOH-os metanol oldat
1%-os nátrium-tetrafenil-borát ( $Na_B\left( C_6H_5 \right) _4$ , rövidítve )
1 M Na-acetát puffer, pH=5,0
szerves oldószerek (hexán, toluol, metanol)
cisztein, réz-szulfát, nátrium-klorid
6 M-os sósav
0, 1M
1000 mg -es metil-higany és etil-higany törzsoldat, metanolban; hígabb standard oldatok ioncserélt vízzel hígítva készülnek
szervetlen higany () standard oldatok 1000 mg törzsoldat (Merck) ioncserélt vízzel való hígításával készültek, 1%(v/v) savtartalmuk 65%-os tömény (Merck) adagolásával lett beállítva.

Lúgos feltárást és SPME-t alkalmazó mintaelőkészítési eljárás

Az eljárás alapját Cai és Bayona által kidolgozott módszer képezte (Journal of Chromatography A, 1995, 696:113-122.). 250 mg liofilizált halmintát vagy CRM-et mérünk be egy 30 ml térfogatú teflonos szeptummal lezárható üvegedénybe, majd 5 ml, KOH-ra nézve 25%(m/v)-os metanol oldatot, vagy 18%(m/v) NaOH-ot tartalmazó metanol oldatot (mindkettő 4,5 M-os) adunk a mintákhoz. Az edények lezárását és alapos összerázását követően 3 órán át 75ºC-os vízfürdőben ultrahangozzuk az így elkészített elegyet. Szobahőmérsékletre való lehűlést követően, a hígítási lépéseket az aktuális minta MeHg tartalmától tesszük függővé. Kis higany koncentrációjú (100 ng g^-1

körüli) minták előkészítése során a feltárt 5 ml oldat teljes mennyiségét centrifugáljuk (15 perc, 4100 g, 20ºC), majd a felülúszóból 1,0 ml aliquot mennyiséget MeHgCl standard addícionálását követően 10,0 ml-re hígítjuk.
A származékképzéshez az adalékolt oldatból 1,0 ml aliquot mennyiséget egy 30 ml térfogatú szeptummal lezárható üvegedénybe viszünk, melybe előzetesen bemérünk 10,0 ml 1 M acetát puffert (pH=5,0), illetve belehelyezünk egy teflonos bevonatú keverőbabát. Végül az így összeállított elegyhez 1,0 ml 1%(m/v)-os frissen készített NaBPh_4

reagens oldatot adunk, majd a szeptumos kupakkal gyorsan lezárjuk az üveget. Az SPME kivitelezéséhez az üveget mágneses keverőre helyezzük és intenzív kevertetés mellett (700 rpm) előzetesen optimált időtartamig gőzfázisú mintavételt végzünk. Az SPME-t követően gázkromatográfiás elválasztást és AFS detektálást alkalmazunk. A szilárdfázisú mikroextrakció folyamatát szemlélteti a 2 .ábra szemlélteti.

A bizonytalansági források megnevezése, a számolások során alkalmazott törvényszerűségek, képletek ismertetése

A bizonytalansági források megnevezése, a számolások során alkalmazott törvényszerűségek, képletek ismertetése

Első lépésként meg kell határozni a mérendő mennyiség (vagyis a metil-higany higanyban kifejezett koncentráció értéke, μg Hg g^-1

szilárd minta sz.a.) kiszámolásához szerkesztett képletet. TORT-2 esetében az 1. egyenlet alakul ki, ahol c koncentráció a „végső” oldatban (az a derivatizációs elegyben, amiből az SPME-t végrehajtjuk) mért koncentráció, a térfogatmérésre vonatkozó jelölések (V,L) a mintaelőkészítés során alkalmazott hígítási lépéseket tükrözik, az m_b

a szilárd mintából történő bemérésre vonatkozik, a 10^6

-os osztó pedig a ppt-ben mért koncentráció (c) és a szilárd mintára számolt ppm-ben értendő koncentráció közti átváltás miatt szerepel a képletben. A jelölések részletesebb magyarázata az 1. táblázatban található.

$y = \frac\fracc(v_1 + v_2 + v_10)v_1v_3 * L_10* v_5 / m_b * 10^6$

1. egyenlet

A következő lépést az eredmények precizitását befolyásoló bizonytalansági források megjelölése jelentette. Ezek egy része látható a fenti egyenletekben, mint például a mintaelőkészítés során alkalmazott tömeg,- és térfogatmérések, a bizonytalansági források másik része viszont tételesen nincs feltüntetve. Ennek oka elsősorban az, hogy akármelyik koncentrációtartomány mérése is a cél, igen összetett eljárást kell alkalmazni a mintaelőkészítés során, kezdve a feltárástól a hígításokon át, az alkalmazott derivatizációs lépésekig, illetve az ezt követő szilárd fázisú mikroextrakcióig, ráadásul mérni csak akkor tudunk, ha minden egyes lépés szinte teljesen (nagy hatásfokkal) megvalósul. Mivel az egyes részfolyamatok pl. derivatizáció, vagy SPME stb. és az eredmény kapcsolatát nem egyszerű matematikai formulával leírni, úgy lehet venni, hogy a fenti egyenletekben szereplő ún. „c” koncentráció tag bizonytalansága foglalja magába a feltárás ismételhetőségét, a derivatizációs reakció ismételhetőségét, az SPME ismételhetőségét, a kalibrálási bizonytalanságot, a deszorpció folyamatának és a mérőműszer teljesítményének, karakterisztikájának esetleges változását. A definiált bizonytalansági források az 1. táblázatban kerülnek bemutatásra.

1. táblázat. A TORT-2-re kidolgozott módszer alkalmazása során fellépő bizonytalansági források. „a” derivatizáláshoz felhasznált 1 ml hígított mintaoldatra vonatkozik, „b” az 1 ml NaBPh_4

reagensre vonatkozik, „c” az 5 ml feltárt elegyből történő 1 ml mintarészlet kivételére vonatkozik.

Forrás megnevezése xi	bizonytalanság jelölése u(xi)	mértékegység	becslés típusa
koncentrációmérés	$u \left(c\right)$	pg ml	A
térfogatmérés (pipettázás 1 ml) a		ml	A
térfogatmérés (pipettázás 1 ml) b		ml	A
térfogatmérés (pipettázás 10 ml)		ml	A
térfogatmérés (lombik jelretöltés, 10 ml)		ml	A
térfogatmérés (pipettázás 5 ml)		ml	A
térfogatmérés (pipettázás 1 ml) c		ml	A
tömegmérés (szilárd minta bemérése)		g	B

Ezek után lehet mennyiségileg meghatározni az egyes bizonytalansági forrásokat, vagy méréssel („A” típusú becslés), vagy becsléssel („B” típusú becslés) [ISO/GUM 1993]. Az erre vonatkozó adatok a 2. táblázatban szerepelnek.
A táblázatban szereplő pipettázások és lombikjelretöltés ismételhetőségét jelző szórásértékeket többször elvégzett művelettel meg lehet határozni, és a már ismertetett 1. egyenlet alkalmazásával ezek eredményre gyakorolt hatását is ki lehet számolni. A koncentrációmérés bizonytalansága is megbecsülhető, de mindazon folyamatok bizonytalanságáról, amik ebben u(c)-ben megnyilvánulnak nincsen információ. Ebből kiindulva olyan kísérletsorozatot kellett tervezni, mely lehetővé tette a „c” bizonytalanságának a felbontását, és az ebben foglalt folyamatok (feltárás, derivatizáció, kalibráció, SPME, deszorpció, műszerállandóság) bizonytalanságának egyenkénti, méréssel történő meghatározását.

2. táblázat. „A” és „B” típusú becslések a TORT-2 mérésére vonatkozó, 1. egyenletben szereplő bizonytalansági forrásokhoz. A bekeretezett u(c) értéke, a c komplexitásából adódóan kezdetben ismeretlen, magyarázat, illetve meghatározásának menete a szövegben található.

biz.jelölése

mértékegység

párhuzamosok száma

átlag

szórás

„A” típusú becslések

u (c)

0,9989

0,0061

0,9989

0,0061

9,9589

0,0948

9,9839

0,0332

4,9712

0,0487

0,9989

0,0055

„B” típusú becslések

biz.jelölése

mértékegység

becsült átl. hiba

eloszlás típusa.

0,250

± 0,0001

négysz.

5,77 E-5

A számolások során minden egyes paraméter bizonytalanságának (szórásának) eredményre gyakorolt hatását külön meg kell vizsgálni, vagyis az eredmény bizonytalansága (u(y_i))

és az adott paraméter bizonytalansága (u(x_i))

közti függvénykapcsolat (f) x_i

szerinti első parciális deriváltját (2. egyenlet) kell képezni. A számolás során azzal a feltételezéssel érdemes élni, hogy megfelelően kis intervallumokat véve alapul az f függvény az x_i

értéke körül lineáris, így végső soron a 3. egyenlet alakul ki, vagyis minden egyes paraméter esetén ki kell számolni a paraméter átlagának és szórásának összegével a végeredményt, illetve az adott paraméter átlagával számolt végeredményt, és a kettő különbsége megadta az adott paraméter bizonytalanságának eredményre gyakorolt hatását.

$\left (\frac\partial f\partial x_i \right )$

2. egyenlet

3. egyenlet

Az összesített, vagy kombinált bizonytalanságot az egyes u(y_i)

tagok kombinációjával az ISO/GUM útmutatásai alapján a 4. egyenletben meghatározott módon képezzük, ahol n a bizonytalansági források száma.

$u (y) = \sqrt u^2 (y_1) + u^2 (y_2) + \dots + u^2 (y_n)$

4. egyenlet

A kísérletek menete, az eredmények és azok értékelése

A kísérletek menete, az eredmények és azok értékelése

A témával kapcsolatos kísérletek során a mérések precizitása szempontjából valószínűleg legkritikusabb „c” bizonytalansági forrással érdemes foglalkozni, tehát célszerű szétbontani és meghatározni az ebben foglalt egyes folyamatok bizonytalanságának hatását a mért értékekre.

Első lépésben az SPME-deszorpció-műszerállandóság kérdését kell megvizsgálni. Ehhez a TORT-2 minta esetében készítünk egy derivatizációs elegyet (10 ml acetát puffer + 1 ml feltárt és hígított minta + 1 ml NaBPh_4

reagens), melyből többször végrehajtunk szilárdfázisú mikroextrakciót. A kapott integrált csúcsterületek szórását ebben az esetben kizárólag az SPME-, a GC injektorában történő deszorpció- és a műszer állandóságának bizonytalansága okozza. E három bizonytalansági tényezőt egymástól elválasztani nem lehet, és a továbbiakban u(SPME) néven kezeljük őket. A kísérlet során ezen forrás bizonytalanságának az eredményre gyakorolt hatását az 1. egyenlet segítségével lehet megállapítani. Az eredmények a 3. és 4. táblázatban „a” jelzéssel kerültek bemutatásra.

A következő lépésben a derivatizáció bizonytalanságának hatását kell meghatározni. Ezen vizsgálatok úgy folytak, hogy a mintaelőkészítés során összeállított 10 ml-es oldatokból többször ki kell venni 1 ml-t, majd ezek mindegyikét derivatizálni szükséges (10 ml acetát pufferrel és 1 ml fenilezőszerrel), a fenilezett származékokat pedig extraháljuk és mérjük. A kapott jelek szórását ebben az esetben a derivatizáció-, SPME-, deszorpció,- műszer-, illetve a derivatizációs elegy összeméréséhez alkalmazott pipettázások bizonytalansága határozza meg. Ezen hatások közül, ismerve az előző kísérletből az „SPME-deszorpció-műszer”-ből adódó bizonytalanságot, valamint a pipettázásokból adódó bizonytalanságot is, a 4. egyenlet alapján kiszámolható az eredmény derivatizáció ismételhetőségéből adódó bizonytalansága. Ez az érték megtalálható a 3. és 4. táblázatban „b” jelzéssel.

A feltárási folyamat ismételhetősége oly módon vizsgálható, hogy több párhuzamos feltárást végzünk, majd a megfelelő hígítási lépések után derivatizáció, extrakció és mérés következik. Az eredményeket csupán a jelintenzitás alapján értékeljük, kalibráció alkalmazása nélkül. Az így kapott szórásértékekben minden eddig tárgyalt bizonytalansági forrás hatása megnyilvánul, kivéve a kalibrációét. Mivel minden egyéb forrás eredményre gyakorolt hatása már ismert, a 4. egyenlet segítségével kiszámolható a lúgos feltárás bizonytalanságának hatása a mért eredményre. Az így kiszámolt értékek a 3. és 4. táblázatban „c” jelzéssel szerepelnek.

Végül a kalibráció bizonytalanságának eredményre gyakorolt hatását határozzuk meg. Ehhez több párhuzamos feltárást végzünk, mindegyik esetben standard addíciós kalibrációt alkalmazva. A számolt koncentrációértékek (az átlag TORT-2 esetében 63 pg ml^-1

volt) szórásában minden bizonytalansági forrás szerepet játszik, így a kalibráció is. Mivel minden más bizonytalansági forrás hatása már ismert, a kalibráció bizonytalanságának eredményre gyakorolt hatása a 4. egyenlet alapján számítható. Ez az érték szerepel a 3. és 4. táblázatban „d” jelzéssel.

A kísérletileg meghatározott 4 bizonytalansági forrásból az 5. egyenlet alkalmazásával kiszámolható az u(y)_c

, illetve ennek segítségével a 2. táblázatban bekeretezett módon ábrázolt, kezdetben ismeretlen u(c).
Végül, miután minden bizonytalansági forrás nagysága már ismert, meghatározható a módszerre jellemző eredő bizonytalanság.

3. táblázat. A TORT-2 CRM minta mérése során alkalmazott módszer összetett mérési bizonytalansága (első rész). A koncentrációmérés bizonytalansága - az u(c) - az „a”, „b”, „c”, illetve „d” tagokat foglalja magába. Az ide tartozó magyarázatot a szöveg tartalmazza.

bizonytalansági tényező,
u(SPME+deszorpció+mérőműszer)	6,44 E-3
u(derivatizáció)	4,41 E-3
u(feltárás)	1,29 E-2
u(kalibráció)	9,92 E-3

u(c) = 7,5251

5. egyenlet

4. táblázat. A TORT-2 CRM minta mérése során alkalmazott módszer összetett mérési bizonytalansága (második rész). A koncentrációmérés bizonytalansága - az u(c) - az „a”, „b”, „c”, illetve „d” tagokat foglalja magába. Az ide tartozó magyarázatot a szöveg tartalmazza.

A módszer egészére vonatkozó összesített bizonytalanság
Biz. tényező
$u\left(c\right)$	63	7,5251	1,80 E-2	3,26 E-4
	1	0,0061	-8,40 E-4	7,06 E-7
	1	0,0061	7,69 E-5	5,91 E-9
	10	0,0948	1,19 E-3	1,43 E-6
	10	0,0332	5,02 E-4	2,52 E-7
	5	0,0487	1,47 E-3	2,17 E-6
	1	0,0061	-9,17 E-4	8,40 E-7
	0,250	5,77 E-5	-3,63 E-5	1,32 E-9
			$\sum u^2 (y_i):$	3,32 E-4
	összesített bizonytalanság		$u(y)=\sqrt \sum u^2 (y_i):$	1,82 E-2
	mért érték : 0,151 μg , eredő bizonytalanság: ± 0,018

A táblázat adatait, illetve a kísérletek eredményeit teszi szemléletesebbé a 3. és 4. ábra. Az előbbi, az egyes bizonytalansági források (u(x_i))

eredményre gyakorolt hatását (u(y_i))

ábrázolja, az utóbbi azt mutatja, hogy az összesített bizonytalanság négyzete, az u^2(y)

, hogy oszlik meg az egyes u^2 (y_i)

tagok között. Bár az egyes bizonytalansági források eredményre gyakorolt hatásainak arányai megváltoztak a négyzetre emelések során, a 3. ábra alapján kijelenthető, hogy függetlenül a mért koncentráció tartománytól a mérés precizitása szempontjából elsősorban a feltárás-, másodsorban a kalibráció bizonytalansága a meghatározó.

A feltárás viszonylag nagy bizonytalansága leginkább az ultrahangos fürdőnek tulajdonítható. Befolyásolhatja az eredményeket ugyanis, hogy hány mintát kezelünk egyszerre, hova helyezzük a kádban a mintákat, mennyi vizet töltünk a minták köré, mekkora mintatérfogatot alkalmazunk stb. A fent említett tényezők hatását gyakorlatilag nem lehet külön-külön vizsgálni, így a fent említett tényezőkben érdemes keresni a bizonytalanság elsődleges okait.
Viszonylag nagy a kalibráció bizonytalanságának tulajdonított világoszöld mező is. Ez abból adódhat, hogy a minták mérése során minden egyes feltáráshoz külön–külön készítünk standard addíciós sorozatot (ez feltárásonként 3-4 minta mérését jelentette). Az eredmények tükrében megállapítható, hogy feleslegesen nagy bizonytalansági faktort jelent ilyen módon végezni a kalibrációt, a továbbiakban inkább célszerű mintatípusonként egyet addícionálni, és a párhuzamos feltárások eredményeit annak az egy egyenesnek az egyenletével számolni. Fontos azonban megjegyezni, hogy különböző mintatípusok mérésekor (pl. a halminták esetében) jelentős mértékű regressziós eltérések tapasztalhatók az egyes minták között, így az egy minta mérése során kapott kalibrációs egyenes egyenletével nem lehetett kiszámolni a többi minta koncentrációját.

Az SPME és a derivatizáció ismételhetőségét összehasonlítva jól látszik, hogy az előbbi bizonytalansága a kisebb koncentrációjú TORT-2 minta mérése során meghatározóbb. A térfogatmérések és főleg a tömegmérés bizonytalansága ennél a mérési feladatnál gyakorlatilag elhanyagolható – az utóbbi általánosan ismert jelenség, ám a térfogatmérések bizonytalanságának kis relatív értéke ritka esetnek számít.

Megjegyzések

Megjegyzések

Mindenképpen hangsúlyt kell arra fektetni, hogy az ismertetett bizonytalansági számolás a mérés pontosságáról nem ad információt! A “recovery” problémája mindig kulcskérdés minden módszer esetén, meghatározása sok esetben igen bonyolult, szinte csak a CRM minták szolgálhatnak segítségül.
Ráadásul a kalibrációs standard oldatok készítése a MeHgCl erősen toxikus jellegéből adódóan szigorúan betartott óvintézkedések mellett történik, így minden igyekezet ellenére a standard oldatoknak tulajdonított koncentrációértékek kissé eltérhetnek a tényleges koncentrációktól. További problémát jelenthet a MeHgCl standard oldatok kétséges stabilitása. A pontosságot sem az SPME, sem a derivatizáció nem korlátozza, ha előzetesen meggyőződünk arról, hogy ezen folyamatok gyakorlatilag maximális hatásfokkal mennek végbe.