Prev
Next 
19. Növényvédőszer-maradékok meghatározása zöldségekből és gyümölcsökből HPLC-ESI-MS/MS technikával
Tanulási célok
Növényvédőszer-maradékok meghatározása zöldségekből és gyümölcsökből HPLC-ESI-MS/MS technikával

Bevezetés

Bevezetés

A gazdaságosabb növénytermesztés, illetve a kiszámítható élelmiszerellátás érdekében egyre nagyobb mértékben alkalmaznak kémiai úton előállított szintetikus növényvédőszereket. Ugyanakkor azzal is tisztában kell lennünk, hogy az alkalmazott szerek legtöbbje erősen toxikus anyag, így számos előnyük mellett az elfogyasztásra kerülő terméken/termékben maradt szermaradványok – az élelmiszerláncba, illetve a környezetbe kerülve – veszélyt jelentenek az emberi egészségre és a természeti környezetre egyaránt. Ennek megfelelően az élelmiszerekben jogilag eltűrt növényvédőszer-maradékokat és azokhoz társított legmagasabb megengedett szermaradék-határértékeket (Maximum Residue Limit, MRL) nemzetközi és nemzeti jogszabályokban rögzítik. Példaképpen megemlítjük, hogy a jelenlegi európai uniós joganyagok több, mint 300 terményre és több mint 500 hatóanyagra írnak elő határértéket. Az MRL értékek legnagyobb része jellemzően a 0,01-10 mg/kg koncentrációtartományba esik. Ezek hatékony ellenőrzése elképzelhetetlen lenne korszerű analitikai vizsgálati módszerek nélkül.
Sokkomponenses vizsgálati módszerek

A gyakorlatban alkalmazott módszerek legtöbbje ún. sokkomponenses módszer. Ez alatt azt értjük, hogy e módszerekkel egyetlen vizsgálatból több tíz, de akár több száz hatóanyag is egyidejűleg meghatározható. Az ilyen módszerek értékelésekor nem szabad azonban figyelmen kívül hagyni, hogy az egyes hatóanyag-csoportok képviselői nagymértékben eltérő fiziko-kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek (eltérő stabilitás, polaritás, detektálhatóság, minta-előkészítési igények) mely sajátságok a legtöbbször kijelölik a sokkomponenses módszerek alkalmazhatóságának határait.
A korszerű növényvédőszer-maradék vizsgálati módszerek döntő többsége kapilláris gázkromatográfiás (GC) vagy nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) elválasztási technikákon alapulnak. A két alternatíva közti választást számos tényező befolyásolja. A GC legnagyobb előnye a HPLC-vel szemben elérhető nagyobb kromatográfiás felbontás, különösen GC x GC rendszerek esetén. Ugyanakkor a GC csak korlátozottan alkalmas hőérzékeny komponensek vizsgálatára (pl.: acefát és metamidofosz) és hátrányaként említhető, hogy a technika sajátságaiból adódóan a vizsgálandó hatóanyaggal szemben támasztott illékonysági feltétel sok esetben csak származékképzéssel érhető el.
A detektálási módszer tekintetében legyen szó akár GC, akár HPLC elválasztásról, kétség kívül a tömegspektrometriás (MS) és tandem tömegspektrometriás (MS/MS) detektálási módszerek alkalmazása nyújtja a legszélesebb körű felhasználás lehetőségét. Általánosságban elmondható, hogy a GC technikák mellett a HPLC elválasztást és valamilyen légköri nyomáson működő lágy ionizációs technikát (főként elektrospray ionizációt, ESI) alkalmazó sokkomponenses módszereket egyre szélesebb körben alkalmazzák a növényvédőszer-maradékok rutinszerű meghatározására. A HPLC-ESI-MS/MS rendszerre épülő módszerek előnye különösen jelentős az egyre nagyobb számban előforduló poláros komponensek vizsgálatakor. Ilyenek például a gyümölcsök „post-harvest” kezelésére elterjedten alkalmazott fungicidek (tiabendazol, imazalil, karbendazim).
A számba jöhető MS készüléktípusok között kétség kívül a hármas kvadrupol (QqQ) elrendezés az, amely leginkább alkalmas a sokkomponenses növényvédőszer-maradék vizsgálatokhoz. Ennek magyarázata a hármas kvadrupol (QqQ) készülékekre jellemző ún. többszörös termékion-figyelés (Multiple Reaction Monitoring, MRM) pásztázási módhoz kapcsolódik. Ezzel a tömegspektrometriás detektálási alkalmazással – melynek részletes tárgyalása túlmutat a fejezet keretein – rövid idő alatt (\approx 1 sec) akár több száz célkomponens is szelektíven monitorozhatóvá válik. Ez azt jelenti, hogy egy tipikus HPLC kromatográfiás csúcs lefutása alatt, melynek szélessége 10-60 sec, minden gond nélkül (kvázi szimultán módón) mérni tudjuk az előre meghatározott nagyszámú szermaradék nyomokat. Az MRM pásztázás további előnye, hogy a gyorsaság mellé rendkívüli kimutatási képesség is társul. Egy tipikus MRM kromatogram látható az 1. ábrán.
Összegzésként fontos azt kihangsúlyozni, hogy a sokkomponenses növényvédőszer-maradék meghatározási módszerek gyenge pontját – amennyiben megfelelő műszerezettség rendelkezésre áll – manapság már nem a műszeres mérés jelenti, a szűk keresztmetszetet sokkal inkább minta-előkészítés korlátai adják.

Mintafeldolgozás és minta-előkészítés I.

Mintafeldolgozás és minta-előkészítés I.

A laboratóriumban végzett analitikai eljárások első lépéseként a beérkezett mintát fel kell dolgozni. Ez lényegében a minta homogenizálását jelenti, melyhez a háztartásokban is használatos turmixgépekhez hasonló, nedves aprító berendezéseket alkalmazunk. Az így kialakított mintát nevezzük vizsgálati mintának. Ez a mintafeldolgozási lépés növényvédőszer-maradék vizsgálatoknál rendkívüli jelentőségű, ugyanis egyáltalán nem mindegy az, hogy az egyes vizsgálatra váró termékeknek (pl.: zöldségeknek, gyümölcsöknek) mely részeit vizsgáljuk. A szermaradék-határértékeket előíró joganyagokban ezt is pontosan rögzítik, azaz hogy a terméknek mely részeire értendő a megadott MRL. Például saláta esetén az előírás úgy szól, hogy „a teljes termék a gyökerek és elhalt levelek, és (adott esetben) talaj nélkül”. Továbbá általános szabályként elmondható, hogy a termékek vizsgálat előtti megmosása szintén nem megengedett. Citrusféléknél, szintén a teljes termékre vonatkozik az MRL, amelybe a gyümölcs ehető részei és a (mosatlan) héj egyaránt beletartoznak. Ez utóbbi példa jól érzékelteti azt, hogy növényvédőszer-maradék vizsgálatoknál nem csupán az ehető részeket vesszük és nem étkezésre előkészített állapotban vizsgáljuk a termékeket. A citrusfélék példájánál maradva ezáltal a héjon nagyobb mennyiségben megtalálható felületkezelő szerek is hozzáadódnak a teljes termékre mért koncentrációhoz. Az így kapott sokszor ijesztően nagy koncentrációértékek megtéveszthetik a nem kellően tájékozott felhasználókat. Hangsúlyozni kell azonban, hogy az MRL értékek kialakításakor az imént elmondottakat figyelembe vették. Vagyis egy termékre előírt MRL nem egyértelműen feleltethető meg azokkal a különféle ajánlásokban foglalt értékekkel, melyek fogyasztáskor tolerálható szermaradék mennyiségekre vonatkoznak.
A vizsgálati minta kialakítását követően az analitikai minta előkészítése következik. Ennek a folyamatsornak a célja kettős. Egyrészt, a mérőrendszer sajátságaiból adódó zavaró hatásokat minimalizáljuk, miközben a berendezésbe juttatatott analitikai mintarészlet fizikai és kémiai sajátságait összhangba hozzuk a mérőrendszer igényeivel. Ez utóbbi azt jelenti, hogy például GC mérés esetén a berendezésbe juttatott mintarészlet gyakorlatilag vízmentes kell, hogy legyen, míg HPLC esetében a végső analitikai minta szerves oldószer tartalmát szintén a módszer sajátságaihoz kell igazítani.
A zavaró hatások legnagyobb része abból adódik, hogy a nyomnyi mennyiségben jelenlévő szermaradékok egy rendkívül összetett „hordozóközegben”, azaz magában a termékben találhatók. Ez a hordozóközeg, vagy szakszóval mátrix számos olyan alkotót tartalmazhat, amelyek zavarják a célkomponensek meghatározását. Ezek az interferáló komponensek jellemzően számottevően nagyobb mennyiségben fordulnak elő a mintában, mint maguk a meghatározandó molekulák. Legtöbbször éppen ez a nem ritkán sok nagyságrendnyi koncentrációbeli különbség az, ami miatt egy összetevő az adott vizsgálati módszernél problémát okoz. A minta-előkészítés során alkalmazott műveleteknek tehát oly módon kell ezeket a zavaró hatásokat csökkenteni, vagyis az interferáló összetevőktől megszabadulni, hogy a célkomponensek mindvégig változatlan formában és mennyiségben maradjanak. A sokkomponenses HPLC-ESI-MS/MS növényvédőszer-maradék vizsgálati módszerekhez egyre szélesebb körben alkalmazott módszert szeretnénk az alábbiakban példaként bemutatni. A bemutatásra kerülő jellegzetes minta-előkészítési műveletsor vázlata a 2. ábrán látható.

Mintafeldolgozás és minta-előkészítés II.

Mintafeldolgozás és minta-előkészítés II.

A homogén vizsgálati mintából mintatípustól függően 5-15 g mennyiséget mérünk be egy műanyag centrifugacsőbe, ez az ún. vizsgálati mintarész. Ez lesz a mintának az a része, amelyet a minta-előkészítési műveleteknek ténylegesen alávetjük. Fontos azt megjegyezni, hogy a végső koncentrációt erre az ún. friss tömegre kell vonatkoztatni. Olyan mintatípusok esetében, amelyeknek a víztartalma 80% alatt van (pl.: gabonák, fokhagyma) néhány ml víz hozzáadása javasolt, hogy az edényben található anyag víztartalma hozzávetőlegesen 10 g körül legyen. Ezt követően a mintához adjuk a kivonószert, mely vízzel elegyedő valamilyen szerves oldószer, jellemzően acetonitril, vagy metanol. Ekkor egy kis térfogatban belső standard oldatot adunk a mintához, melynek segítségével a mérés során nyomon követhetjük, hogy nem vétettünk-e esetleg valamilyen hibát a minta-előkészítési műveletek során, illetve megerősítést kapunk a mérőrendszerünk megfelelő működéséről. A belső standard olyan komponens, amely eredendően nem található meg a mintában. Ezt követően a lezárt edényeket intenzív rázásnak vetjük alá, ezzel biztosítva a hatékony kivonást. A komponensek stabilitása és az extrakció hatékonyságának fokozása érdekében a minta pH értékét és az ionerősségét sók hozzáadásával kontrolláljuk. A mintát további extrakciónak vetjük alá, majd centrifugáljuk és a felülúszóból pontosan meghatározott aliquot mennyiséget (6-8 ml) egy másik kisebb centrifugacsőbe mérünk. Az extraktumban lévő klorofill és karotionidok eltávolítását a kimért felülúszóhoz adagolt porított szorbensek hozzáadásával érhetjük el. A folyadékba diszpergált szorbensek akkor fejtik ki leghatékonyabban hatásukat, ha újra intenzív rázásnak vetjük alá a mintát. Ezután a fázisokat újabb centrifugálással választjuk szét. Ezzel elértük a minta-előkészítés azon célját, hogy izoláltuk a célkomponenseket és ezen túl megszabadultunk a nem kívánatos összetevőktől. Ezután a vizsgálati módszer igényeitől függően ún. oldószerváltást hajthatunk végre. Ez azt jelenti, hogy az eredeti extraháló szert (pl.: acetonitril, vagy metanol) elpárologtatjuk és a kívánt oldószerrel hígítjuk vissza a bepárlási maradékot. Magát a bepárlást inert szárítógázzal (pl.: nitrogén) célszerű végezni, erre a célra tervezett laboratóriumi bepárló berendezés segítségével. Egy ilyen célra alkalmazható egyszerű megoldás látható a 3. ábrán.
A bepárlást követő visszaoldáskor természetesen nem szükségszerű az eredeti térfogatra visszahígítani a mintát. Amennyiben kisebb mennyiségű folyadékban vesszük fel a bepárlási maradékot, az oldat relatíve töményedni fog. Ezt a módszert gyakran alkalmazzák olyan esetekben, amikor a mérőrendszer korlátozott kimutatási képessége az oldat töményítését teszi szükségessé. A bemutatott növényvédőszer-maradék vizsgálati módszerek esetén a mennyiségi meghatározás megbízhatóan szinte csak az ún. mátrixhoz illesztett kalibrációval érhető el. Ennél az eljárásnál a kalibrálósor készítéséhez használt „oldószer” maga az elkészített analitikai minta. Az ismertetett minta-előszítési módszerrel kapcsolatban végezetül hangsúlyozni szeretnék, hogy az HPLC és GC módszerekhez egyaránt alkalmazható.
Áttekintő-kiegészítő kérdések
  1. Vesse össze, milyen előnyei és korlátai vannak a GC és HPLC elválasztást alkalmazó analitikai módszereknek növényvédőszer meghatározások során?
  2. Mit értünk sokkomponenses analitikai módszer alatt?
  3. A bemutatott minta-előkészítési eljárásban mi a szerepe az oldószerváltási lépésnek?
 Prev
Next