Prev
Next 
17. Étrendkiegészítők C-vitamin tartalmának meghatározása HPLC-UV eljárással
Tanulási célok
Étrendkiegészítők C-vitamin tartalmának meghatározása HPLC-UV eljárással

A C-vitamin sajátságai

A C-vitamin sajátságai

A C-vitamin kifejezés tulajdonkeppen egy gyűjtőfogalom, melyet minden olyan vegyületre alkalmazunk melynek biológiai hatása mennyiségi értelemben is egyenértékű az L-aszkorbinsavnak tulajdonítható hátassal. Ennek ellenére a természetben a C-vitamin hatásért felelős leglényegesebb alkotó maga az L-aszkorbinsav. A C-vitamin funkciói elsősorban reverzibilis biológiai antioxidáns képességen alapulnak. Többek között az élő szervezetben működő hidroxiláz enzimek - melyek működéséhez kofaktorként réz, vagy vas ionok szükségesek - egyaránt igénylik az aszkorbinsavat, mint elektron donort, hogy az említett ionokat redukált formában tarthassák. Ezen túl az aszkorbinsav, az \alpha-tokoferollal és \beta-karotinnal együtt fontos szerepet játszik a sejt oxidációs károsodása elleni védelemben. Ebben a minőségében az aszkorbinsav gyökfogó képessége révén, illetve például az \alpha-tokoferol redukált formájának regenerálása kapcsán jut szerephez.
Az ember a számára a létfontosságú C-vitaminhoz tápláléka útján jut hozzá. A C-vitamin klasszikus hiánybetegsége a skorbut, melynek elsődleges tünetei az íny, bőr, és a csont vérzése, valamint a lassú sebgyógyulás. Ezekhez a tünetek társulhat továbbá kedvetlenség, rossz közérzet és egyéb mentális hátasok. Az aszkorbinsav hétköznapi értelemben nem tekinthető toxikusnak, ugyanakkor nagymértékű napi fogyasztása – hajlamtól függően – egyeseknél megemelkedett oxálsavképződést eredményezhet, mely növelheti a vesekőképződés kockázatát. A C-vitamin élettani hatásait sorolva mindenkeppen illendő megemlíteni Szent-Györgyi Albert nevét, aki elsőként igazolta az aszkorbinsav skorbutellenes hatását.
A C-vitamint sokszor egyszerűen azonosítják az aszkorbinsavval. Ez a megállapítás hétköznapi értelemben alapvetően helytálló, de élelmiszerek és étrendkiegészítők C-vitamin tartalmának HPLC-UV eljárással történő meghatározásához nem elég mélyreható. Az aszkorbinsav név alatt ugyanis négy sztereoizomer molekulát is érthetünk. Nevezetesen, ez lehet L- es D-aszkorbinsav, illetve L- es D-izoaszkorbinsav. (1. ábra)
A D-aszkorbinsav és az L-izoaszkorbinsav a természetben nem fordul elő és nem is tulajdonítható nekik C-vitamin hatás. A D-izoaszkorbinsav (más néven D-eritroaszkorbinsav) szintén nem fordul elő a természetes módon az élelmiszerekben. Ugyanakkor kémiai és mikrobiológiai módszerekkel történő nagyléptékű előállítása az L-aszkorbinsavhoz viszonyítva olcsóbb es mindemellett (kémiai) antioxidáns hatása is összevethető az L-aszkorbinsavéval. Ezzel magyarázható, hogy az élelmiszeriparban E315-os kóddal széles körben elterjedt az antioxidánsként történő felhasználása. Azt azonban hangsúlyozni kell, hogy a D-izoaszkorbinsav, vagy más néven eritroaszkorbinsav csupán elhanyagolható C-vitamin hatással rendelkezik. Más szavakkal, az az élelmiszer, mely eritroaszkorbinsavat tartalmaz (melynek kizárólagosan antioxidánsként történő alkalmazása sem mindenhol engedélyezett) nem tekinthető C-vitaminnal dúsított élelmiszernek.
Az L-aszkorbinsav további sajátsága, hogy könnyen és reverzibilisen oxidálódik dehidro-aszkorbinsavvá (2. ábra). A dehidro-aszkorbinsav teljes értekű C-vitaminnak tekinthető, hiszen a szervezet képes aszkorbinsavvá redukálni.
Mindezek tükrében látható, hogy egy élelmiszer C-vitamin tartalmának meghatározása számos esetben összetett feladatként jelentkezik.

Analitikai módszerek áttekintése

Analitikai módszerek áttekintése

Az élelmiszerekből C-vitamin tartalom meghatározását célzó analitikai módszerek ideális esetben egyaránt számba veszik az aszkorbinsavat és oxidációs termekét, a dehidro-aszkorbinsavat, továbbá képesek megkülönböztetni ezeket a formákat az eritroaszkrobinsavtól. Az alkalmazandó módszer kimutatási képessége a műszeres eljárások esetében nem jelentkezik problémaként, hiszen az élelmiszerekben jól detektálható mennyiségben jó közelítéssel 15-150 mg/100g tartományba esik a C-vitamin mennyisége.
A klasszikus 2,6-dikloro-fenolindolfenolos térfogatos módszer az aszkorbinsav mellett ugyanakkor nem képes a dehidroaszkorbinsavat mérni. Ugyanígy az abszorpciós spektrofotometriás módszer sem alkalmas a dehidroaszkorbinsav mérésére. Ez utóbbi komponens ugyanakkor, kiválóan mérhető származékképzést követő fluoreszcens detektálással.
A teljes C-vitamin tartalom meghatározására alkalmas megoldást a fentiek alapján olyan módszerek jelenthetik, melyeknél a minta-előkészítés során a mintában egyaránt jelen levő aszkorbinsavat és dehidro-aszkorbinsavat azonos formára hozzuk. Ez a technika az ún. komponens-uniformizálás. Ez kétféle megoldási utat is kijelöl. Egyrészt ez jelentheti az aszkorbinsav oxidálását dehidro-aszkorbinsavvá, majd ilyen formán a teljes C-vitamin meghatározására a származékképzést követő fluoreszcens detektálás adódik a kézen fekvő választásként. Vagy ellenkezőleg, a dehidro-aszkorbinsavat redukáljuk aszkorbinsavvá, majd akár elektrokémiai detektálást, akar abszorpciós spektrofotometriás módszert választunk detektálási technikaként. Az alábbiakban ez utóbbi, redukciós uniformizálást alkalmazó abszorpciós spektrofotometriás módszer végrehajtási utasítását közöljük példaként.
Redukciót követő teljes C-vitamin meghatározás HPLC-UV technikával

A bemutatásra kerülő módszer az EN 14130:2003 számú szabványban foglalt eljárásokat veszi alapul. Az minta-előkészítés két fő lépésből, egy extrakciós és egy redukciós lépésből áll. Az extrakció az aszkorbinsav oxidációjának megelőzése érdekében a standardoldatokhoz is használt metafoszforsav oldattal történik. A redukciós lépés L-cisztein, mint redukáló ágens felhasználásával a dehidro-aszkorbinsav redukálódását biztosítja, mely lehetővé teszi a C-vitamin aszkorbinsav formában történő meghatározását.
Első lépésként a minta feldolgozása során a vizsgálandó élelmiszer mintát daráljuk, majd homogenizáljuk. A darált, szilárd mintákból (a várható koncentráció függvényében) 1 g-ot, illetve folyadék halmazállapotú mintákból 5 ml-t mérjünk be és ezt 10 ml 2%-os metafoszforsav oldattal extraháljuk. Az extrakciót követő centrifugálás után a felülúszót leszűrjük. A szűrletből 5 ml mennyiséget sötét üvegedénybe pipettázunk és a redukció végrehajtásához hozzáadunk 2,5 ml 4%-os L-cisztein oldatot. Ezt követően az oldat pH-ját hígított ammónia oldattal 7 és 7,2 közötti értékre állítjuk, és öt percen keresztül mágneses keverővel folyamatosan keverjük. Öt perc elteltével metafoszforsavval a pH-t 2,5 és 2,8 közé állítjuk be. A kívánt pH elérése után az oldatot vízzel 10,0 ml-re egészítjük ki, végül szűrjük. Ezt az oldatot használjuk a kromatográfiához.
A kromatográfiás elválasztás fordított fázisú izokratikus eljárással történik, metanol es 0,1% hangyasavat tartalmazó víz eluensekkel. Az eluensek aranyát oly módon kell beállítani, hogy az igen poláros aszkorbinsav a kromatográfiás fronttól egyértelműen elváljon. A detektálási hullámhossz 268 nm. A mennyiségi meghatározást külső kalibrációval végezzük. Amennyiben nem érhető el kielégítő kromatográfiás elválasztás (mely erősen állófázis függő) akkor a visszatartás növelése érdekében alternatívaként valamilyen ionpárképzővel (trifluoro-ecetsav, illetve heptafluoro-vajsav) módosított eluensrendszer alkalmazása javasolható. Ugyanakkor ezen ionpárképzők alkalmazása az eluensek okozta háttér-elnyelést növelni fogja.
Áttekintő-kiegészítő kérdések
  1. Az L-aszkorbinsavon kívül milyen további C-vitamin hatású vegyületeket ismer?
  2. Miért tekinthető a dehidro-aszkorbinsav C-vitaminnak, míg a D-aszkorbinsav nem?
  3. Miért van szükség az L-cisztein reagens adagolására a C-vitamin fentiekben bemutatott vizsgálatakor?
 Prev
Next