Prev
Next 
16. Élelmiszerminták összes polifenol-tartalmának meghatározása fotometriás eljárással
Tanulási célok
Élelmiszerminták összes polifenol-tartalmának meghatározása fotometriás eljárással

Elméleti alapok

Elméleti alapok

A polifenolok /vagy másképpen fogalmazva, a növényi fenolok és fenolos vegyületek/ napjaink talán legnépszerűbb, élelmiszerekkel és táplálkozás-élettannal kapcsolatos kutatási területét jelentik. Polifenol a kulcs többek közt az úgynevezett francia paradoxonként ismert, rezveratrol-tartalomra visszavezetett borfogyasztás vs. szív- és koszorúér betegségek vizsgálatokban, a zöld teáknak tulajdonított egészségvédő hatásban, a bogyós gyümölcsök fogyasztásának ösztönzésében etc. A polifenolok ugyanakkor analitikai szempontból egy meglehetősen inhomogén, több ezer vegyületet magába foglaló csoportot jelentenek, amelyet a következő tulajdonságokkal lehet körülhatárolni: (a) növényi eredet /zöldségek, gyümölcsök, gyógynövények/, (b) többnyire vízben jól oldódó komponensek, (c) antioxidáns tulajdonsággal rendelkeznek, (d) legalább egy fenolos hidroxil-csoport vagy annak származéka jellemzi őket. Ezek alapján legalább három fő csoportot érdemes elkülöníteni: az egyszerű fenolokat, a flavonoidokat és a komplex polifenolokat. Ezek általános szerkezetét és legismertebb képviselőiket az alábbi ábra mutatja be.
Mivel a polifenol-tartalmú minták nem egyetlen típusú polifenolos vegyületet, hanem többnyire azok keverékét hordozzák, az úgynevezett „polifenol profil”, tehát a különféle polifenolok mennyiségének és egymáshoz viszonyított arányának meghatározása lehetőséget nyújt olyan összetett és bonyolult vizsgálatok elvégzésére, mint pl. eredetmeghatározás, élelmiszer-hamisítás kimutatására, vagy az élelmiszerek gyümölcstartalmának megállapítása. A polifenolok egymás melletti minőségi és mennyiségi mérése azonban nagyon költséges folyamat, beleértve mind a polifenolok standard vegyületek beszerzését, mind pedig a szinte kötelezően alkalmazandó, megfelelő szelektivitást biztosító HPLC-ESI-MS csatolt rendszer alkalmazását. Ugyanakkor szükség van egy olyan módszerre is, amely költséghatékony módon, robusztus műszerre építve biztosítja az összes polifenolos vegyület együttes mérését és a minták összehasonlítását.
A polifenolokban szerkezetüktől függetlenül közös, hogy antioxidáns hatásúak, tehát oxidálószerrel reagáltathatók. Ez azt jelenti, hogy a mintából történő „szelektív” extrakciójukat követően (ami a vízben való oldódásukra utal), nyomon követhető és sztöchiometriailag kézben tartott redox folyamatban az összes vegyület részt vesz és a minták összevetésére alkalmas eredményt szolgáltat – röviden ez az alapelve az úgynevezett összes polifenol-tartalom meghatározásnak.

Gyakorlati végrehajtás

Gyakorlati végrehajtás

A gyakorlatban elterjedt és bormintáknál szabványosításra (MSZ 9474:1980) is került eljárás Singleton és Rossi módszerére épül (Singleton V.L., Rossi J.A. 1965. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol. Vitic. 16. 144-158., 1965). A reakció a Folin-Ciocalteu elegy alkalmazására épít: az ebben lévő foszfowolframsav (H_3PW_12O_40) és foszfomolibdénsav (H_3PMo_12O_40) oxidálja a fenolos komponenseket, és a keletkezett kék elszíneződés arányos a fenolos vegyületek mennyiségével. A kék szín intenzitását a komplementer tartományában, spektrofotometriás úton, a szabvány szerint \lambda = 760 nm-en határozhatjuk meg. Az elnyelési maximum a vizsgált mintától és végrehajtástól függően változhat, legtöbbször a 700-800 nm tartományba esik.
A mennyiségi meghatározáshoz kalibrációra van szükség. Mivel azonban „általános polifenol standard” nem létezik, ki kell választani egy, a reakciót mutató, nagy tisztaságban, költséghatékonyan beszerezhető fenolos komponenst. A gyakorlatban legtöbbször galluszsavat használunk, erre építjük fel a kalibrációt és a minta összes polifenol-tartalmát galluszsav-egyenértékben, µg/ml-ben vagy µg/g-ban adjuk meg.
A mintaelőkészítés és a reakció menete a következő:

Reagensek
  1. metanol (puriss, MeOH) : ioncserélt víz = 80 : 20 v/v%
  2. Folin-Ciocalteu elegy, hígítva 1 + 9 arányban ioncserélt vízzel
  3. 0,7 M Na_2CO_3 /M=105,99/ oldat (7,42 g / 100 ml ioncserélt víz)
  4. 3*10^-4 M galluszsav /3,4,5-trihidroxibenzoesav, M=170,12/ oldat; készítéséhez először oldjunk fel 5,1 mg-ot 10,0 ml MeOH : ioncserélt víz elegyben /3*10^-3 M/, majd az oldatot 1+9 arányban tovább hígítjuk MeOH : ioncserélt víz eleggyel a végleges koncentrációra.
  5. 3*10^-4 M aszkorbinsav / M=176,13/ oldat; készítéséhez először oldjunk fel 5,3 mg-ot 10,0 ml MeOH : ioncserélt víz elegyben /3*10^-3 M/, majd az oldatot 1+9 arányban tovább hígítjuk MeOH : ioncserélt víz eleggyel a végleges koncentrációra.
Mintaelőkészítés
  1. Egy teafilterből készítsünk teát a dobozon ismertetett eljárás szerint (pl. forró vízben 2-3 percig áztatás).
  2. A szabadon választott homogenizált /darált/ friss gyümölcsből, gyümölcskonzervből vagy lekvárból mérjünk be táramérleg pontossággal 2 grammot egy 50 ml centrifugacsőbe, majd 20 ml ioncserélt vízzel vortex segítségével 2 percig pépesítsük az elegyet. Ezt követően centrifugáljuk a mintát /4000 g, 15 perc, szobahőmérséklet/ és a felülúszót tiszta mintatartó csőbe öntsük le.
  3. Az 1. Táblázatban ismertetett módon kémcsövekben állítsuk össze a Folin-Ciocalteu + metanol : ioncserélt víz + minta / galluszsav / aszkorbinsav elegyeket, vortex segítségével homogenizáljuk, majd 1 perc elteltével adjuk hozzá a nátrium-karbonát oldatot, majd újból homogenizáljuk az elegyet.
  4. A kémcsöveket 5 percre 50°C hőmérsékletű vízfürdőbe helyezzük.
  5. A mintákat a kalibrációs sor tagjaival kezdve sorban küvettába töltjük és \lambda = 760 nm hullámhosszon leolvassuk az abszorbancia értékeket.
  6. A kialakított, 0-5 µg/ml tartományú külső kalibrációhoz lineáris, általában 0,1-0,6 közötti abszorbancia értékek tartoznak /lásd 2. Táblázat/, és az összefüggés 1,0 abszorbancia értékig általában még lineáris. Amennyiben a mintákra kapott értékek ebben a tartományban helyezkednek el, úgy a kalibrációs összefüggés extrapolálásával a számítás végrehajtható. 1,0 abszorbancia érték felett a mintákat 1+9 arányban hígítani kell. A minta összes polifenol-tartalmának kiszámításánál természetesen figyelembe kell venni az aktuális hígítási lépéseket is, beleértve a mintaelőkészítési folyamatot. Az aszkorbinsavra kapott abszorbancia körülbelül megegyezik az azonos koncentrációban felhasznált galluszsav értékével.
1. Táblázat. Összeállítási rend összes polifenol-tartalom meghatározáshoz.
F.-C. oldat
MeOH : H_2O
galluszsav-vagy mintaoldat
Na_2CO_3 oldat
c_gal., µM
c_gal., µg/ml
1
1250 µl
250 µl
-
1000 µl
0
0
2
1250 µl
200 µl
50 µl
1000 µl
6
1,02
3
1250 µl
150 µl
100 µl
1000 µl
12
2,04
4
1250 µl
100 µl
150 µl
1000 µl
18
3,06
5
1250 µl
50 µl
200 µl
1000 µl
24
4,08
6
1250 µl
-
250 µl
1000 µl
30
5,1
7
1250 µl
150 µl
100 µl aszkorbinsav
1000 µl
-
-
8
1250 µl
200 µl
50 µl /tea/
1000 µl
-
-
9
1250 µl
-
250 µl /gyümölcs/
1000 µl
-
-
2. Táblázat. Példa külső kalibrációs eredmények kiértékelésére. A fotométert a vak oldatra nullázzuk, így az egyenes illesztésénél a tengelymetszetet nullára állítjuk be. (*: hígítási és mintaelőkészítési lépések figyelembe vétele nélkül)
Galluszsav koncentráció, µg/ml
Abszorbancia
0
0
1,02
0,087
2,04
0,176
3,06
0,262
4,08
0,344
5,1
0,427
Analitikai mérőgörbe meredeksége: 0,0844
Analitikai mérőgörbe illeszkedése: 0,9997
Mintára kapott párhuzamos mérések eredményei: 0,185; 0,189
Minta polifenol-tartalma* galluszsav egyenértékben: 2,22 μg/ml

Megjegyzések

Megjegyzések

A leírt módszer egyszerűen végrehajtható, a fotometriás detektálás miatt robusztus eljárásnak számít, ugyanakkor számos teljesítményjellemző területén gyengének számít. Az eljárás leginkább az általánosságban elvárt szelektivitásnak nem felel meg. Egyrészt nem is várható szelektivitás olyan módszertől, amelynek több ezer vegyületre kell válaszreakciót adnia, ugyanakkor – ahogy a táblázatban is szerepelt – olyan növényi vegyületek is reakcióba lépnek, mint a borokban található szulfitok, az aszkorbinsav, illetve a mintából kinyert, vízben oldódó fehérjék tirozin-tartalma /érdemes megjegyezni, hogy a leírt reakció Lowry-féle módosított változata kifejezetten fehérjék mérésére használható, érzékeny és jó kimutatási határú technika/. Mivel általában a gyümölcsök fehérjetartalma kicsi, inkább az aszkorbinsav jelenléte zavarja jelentősen a meghatározást, így érdemes azt szelektíven meghatározni és a kapott összes polifenol-tartalom értéket korrigálni / kiegészíteni az aszkorbinsav mennyiségével. Hasonló módon zavarják a mérést a cukrokból lúgos közegben kialakuló endiolok is (lásd alábbi ábra).
A módszer másik gyenge pontja a kinyerési hatásfokot érinti. Ugyanazon friss gyümölcs ill. az abból készített szárított/liofilezett gyümölcspor vizsgálatánál még a nedvességtartalom figyelembevételével is akár egy nagyságrendnyi eltérést tapasztalhatunk a polifenol-tartalomban a porított készítmény javára. Ennek az az oka, hogy a polifenolok jelentős része sejtfalhoz kötődik, így annak bármilyen mechanikai vagy hőkezeléssel történő feltárása szignifikánsan javítja a kinyerést. Ebből következően összehasonlító elemzéseknél törekedni kell a minták azonos előkezelésére.
A felsorolt problémák ellenére az eljárás – robusztusságánál és költséghatékonyságánál fogva – alkalmas többek közt étrendkiegészítők gyors, akár gyártásközi ellenőrzésére és eltarthatóságuk közelítő jellemzésére is.

Kiegészítő kérdések

  1. A mérés végrehajtása során hiányzik legalább egy elvárt fotometriai mérés: melyik az?
  2. Ismertesse, hogy mintaelőkészítési és a mérési lépések rontják a teljes folyamat reprodukálhatóságát!
  3. „Hány tizedes” pontossággal adható meg a végeredmény?
  4. Milyen számolási lépések hiányoznak a folyamatból?
 Prev
Next