Elméleti alapok 1.

Az E-vitamin létfontosságú szerepét az emberi szervezetben napjainkban senki sem vitatja, azonban a napi bevitelre ajánlott mennyisége nem teljesen ismert. Az elmúlt évek jelentős klinikai vizsgálatai /pl. a „SELECT”, Selenium and Vitamin E Cancer Prevention Trial, National Cancer Institute, USA/ arra engednek következtetni, hogy a korábbi ajánlásokhoz képest kevesebb E-vitaminra van szüksége a kiegyensúlyozott táplálkozást követő személyeknek, ill. az E-vitamin túladagolása valós problémaként jelentkezhet az étrendkiegészítőket és a természetes vagy dúsított formában E-vitamint tartalmazó élelmiszereket együttesen fogyasztók esetében. Érdemes megemlíteni, hogy az E-vitaminnal ellentétben a D-vitamin ajánlott beviteli mennyisége folytonosan emelkedő tendenciát mutat.
A zsírban oldódó vitaminok (A, D, E, K, illetve a méréstechnikailag közel álló, vitaminoid ) mennyiségi meghatározása a mintaelőkészítés számos pontjában igényel körültekintőbb tervezést a vízben oldódó vitaminokhoz képest. Elsőként a kinyerési hatásfok kérdéskörét kell említeni. A vízben oldódó vitaminokkal ellentétben nem lehet egyetlen olyan oldószert kijelölni, amely segítségével az összes zsírban oldódó vitamin a minta legfeljebb háromszori extrahálásával kvantitatív módon (>99%), a lehető legkevesebb mátrixbeoldódással és egyúttal költséghatékonyan nyerhető ki. Az apoláros n-pentán és poláros aprotikus oldószerek közé tartozó tetrahidrofurán például az összes felsorolt vitamint képes jó hatékonysággal kinyerni a mintából, azonban kiemelkedő beszerzési költségük és környezetterhelő voltuk miatt használatukat korlátozzuk. A poláros protikus oldószerek közé tartozó metanol és izopropanol olcsóbb és „zöldebb” megoldást jelentenek, azonban a mintából több zavaró mátrixalkotót oldanak ki. További probléma az oxidáció megelőzése, mivel a zsírban oldódó vitaminok kinyerésére használható oldószerekben a vízhez képest az oxigén jobban oldódik: metanol és víz esetében 25°C hőmérsékleten és légköri nyomáson a különbség ötszörös / ~ 40 mg metanol/. A célkomponens választott mérési módszerétől függetlenül az oxidáció lehetősége minden szempontból zavaró, mivel a célkomponens sztöchiometrikus és gyors oxidációjára ez az oxigénmennyiség még általában nem elegendő, így a mérés szempontjából a leginkább elkerülendő, átmeneti /részben oxidált – részben redukált/ állapot jön létre. Ha a zsírban oldódó vitamin oxidációra érzékeny, de oxidált formában is mérhető, akkor egyöntetű és gyors oxidálásra nyílik mód, például segítségével. Ha a redukált formát kell megőrizni bármilyen – méréstechnikai vagy tudományos /többek közt a redukált vs. oxidált arány meghatározási/ – okból, akkor a vizsgált vitamin oxidált formáját redukálni képes, zsírban oldódó vegyületet kell a mintához adni. Ez lehet egy másik vitamin, vagy egy szintetikus komponens, legtöbbször a butil-hidroxi-toluol /BHT, 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol/ is. Ehhez a területhez kapcsolódik, hogy a zsírban oldódó vitaminok jellegzetesen fényre érzékenyek, így tárolásuk kizárólag barna edényzetben, fénytől elzárva oldható meg.

Elméleti alapok 2.

A szerves oldószerek használatából fakad a harmadik problémakör. Mind a standardok készítésénél, mind a mintaelőkészítés során a vízhez képest nagyságrendekkel gyorsabban párolgó oldószerek szignifikáns mérési hibát okozhatnak. Térfogati kimérésnél a hagyományos pipettahegyeket elő kell nedvesíteni a csepegés megakadályozása céljából, vagy ún. húzott hegyeket kell alkalmazni. „A” jelű mérőlombikok használata mellett, ahol pontos térfogatra való feltöltés lehetősége nem áll fenn, analitikai mérleggel kell nyomon követni a hígítási és mintaelőkészítési lépéseket. Ez utóbbi azért is fontos, mivel a felhasznált oldószerek sűrűsége jóval kisebb a víznél, hígításkor és a végső, a HPLC elválasztás szempontjából megfelelő oldószerre való módosításnál többkomponensű oldószerelegy jön létre, tehát a „szokásos” 1,00 g ~ 1,00 ml kerekítést nem lehet alkalmazni.
A negyedik kérdéskör a vitamerek problémáját érinti, amely az E-vitamin analitika esetében alapvető fontosságú, hiszen az „E-vitamin” nem egyetlen fajta molekulát, hanem egy vitamin-családot jelent. A természetben előforduló négy α-, β-, γ-, δ-tokoferolon és négy α-, β-, γ-, δ-tokotrienolon kívül az élelmiszerek és étrendkiegészítők esetében a mesterségesen előállított /tehát mind a három királis szénatomon racém/, nagyobb stabilitásukból fakadóan kiszereléstechnikailag kedvezőbb tokoferol-észterekkel /-acetátokkal és -szukcinátokkal/ is számolni kell, így élelmiszeranalitikai szempontból a teljes E-vitamin család elméletileg ((4*8)*3) /tokoferolok/ + (4*8) /tokotrienolok/ = 128 tagot számlál. A mesterséges ill. természetes eredetű vitamerek egymás mellett is előfordulhatnak, mivel az E-vitamin különböző vitamerjeit antioxidánsként számos élelmiszerekben is felhasználják /E-306-309 jelzésekkel/. Ugyanakkor étrendkiegészítőkben szinte kizárólag a megfelelő tisztaságban és költséghatékonyan beszerezhető, mesterséges eredetű α-tokoferol-acetát fordul elő a nyolc sztereoizomer formájában, amelyből az emberi szervezet négyet képes hasznosítani. Ebből fakadóan analízis előtt feltétlenül tisztázandó, hogy a mérésnek mi, konkrétan melyik vitamer a célja, ugyanis a különböző feladatok nagyságrendekkel eltérő költségvonzattal járnak.
Az étrendkiegészítők analitikailag nem minősülnek bonyolult mátrixnak, mivel jellegzetesen homogének, por kiszerelés esetén dozírozottak, a célkomponensek várható koncentrációja ismert, és általában legfeljebb 100-200 alkotóból álló összetétel jellemzi őket. Mindezek mellett ugyanakkor gyakori eset, hogy a biológiailag és kémiailag is aktív komponensek viszonylag nagy koncentrációja miatt a gyártási folyamat közben nem várt mellékreakciók, főleg redox folyamatok indulnak be, amelyek a végtermék minőségét és az analitikai mintaelőkészítés hatásfokát olykor drasztikusan mértékben megváltoztatják. Az esetek többségében erre a jelenségre kell gyanakodni akkor, ha a célkomponens várt koncentrációértékétől jelentősen eltérő eredményre jutunk, ugyanis a több szinten ellenőrzött premixekből gyógyszergyári minősítésű berendezésekkel kikevert és dozírozott termékek alkotóinak eloszlása ritkán inhomogén.

A meghatározás elve

A mintából szerves oldószerrel kivonjuk az α-tokoferol-acetátot, majd az együtt kinyert mátrixalkotóktól fordított fázisú HPLC oszlopon elválasztva, szelektíven meghatározzuk λ=290 nm UV hullámhosszon. A nyolc sztereoizomer egy csúcsban eluálódik és mennyiségileg egyszerre értékelhető.


Felszerelés és vegyszerigény

HPLC-UV rendszer; fordított fázisú oszlop, 150 mm * 4,6 mm * 5 μm; analitikai mérleg; ultrahangos szonda; vortex; centrifuga (legalább 4000 g terhelésig) és centrifugacsövek; digitális pipetta-sorozat; 10,0 és 25,0 ml „A” jelű barna mérőlombikok; α-tokoferol-acetát standard (1, 2, 4, 8 μg , metanolban oldva), metanol, n-hexán vagy n-propanol, eldobható PTFE fecskendőszűrő, Eppendorf-csövek.

Meghatározás körülményei

Eluens: metanol; izokratikus elválasztás; térfogatáram: 1,0 ml ; injektált térfogat: 100 μl; szobahőmérséklet; UV: 290 nm; elúció időtartama: 10 perc.


Mintaelőkészítés és mérés

A minta étrendkiegészítő; deklarált E-vitamin tartalma α-tokoferol-acetát formában 40 mg kapszulatöltet. Három kapszulát felnyitunk, tartalmukat homogenizáljuk. 15 ml térfogatú centrifugacsőbe bemérünk ~ 0,1 g homogenizált mintát, amelyhez 8 ml n-propanolt vagy n-hexánt adunk. A mintát vortexszel elkeverjük, majd 30 másodperces időtartamig ultrahangos szondával extraháljuk. A centrifugacsövet bezárjuk, 10 percig 4°C hőmérsékleten centrifugáljuk A felülúszót 25,0 ml mérőlombikba töltjük, majd az extrakciót megismételjük és a mérőlombikot jelre töltjük metanollal. Homogenizálást követően az extraktumból 2 ml-t hidrofób PTFE membránon átszűrünk, a szűrletből 500 μl-t 10,0 ml mérőlombikba töltünk és metanollal jelre töltjük. A HPLC rendszerre az 1. Táblázatban megadott formában elkészített mintákat ill. standard addíciós kalibrációra szolgáló oldatokat juttatjuk. A kromatogramokban (2. ábra) a standard addícióval azonosított csúcsterületeket integráljuk, és Excel segítségével meghatározzuk a kalibrációs összefüggést a mennyiségi meghatározáshoz (2. Táblázat).

Kiegészítések és megjegyzések

Az E-vitaminok mérését magyar szabvány / MSZ EN 12822:2000; „Élelmiszerek. Az E-vitamin meghatározása nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiával. Az α-, β-, γ- és δ-tokoferol mérése”/ alapján is el lehet végezni. Ez az eljárás a különböző észterekből szappanosítással /metanolos KOH-dal, redukálószer jelenlétében/ szabadítja fel a szabad tokoferolokat, majd normál fázisú kromatográfiát jelöl ki a négy tokoferol elválasztására, lehetőség szerint fluorimetriás detektálással. A bemutatott, acetát forma mérésére használható eljárás ill. a szabvány összevetése során a következő kérdések átgondolására van szükség: