Elméleti alapok

Hazánkban az 17/1999. (VI.16.) EüM rendelet élelmiszeranalitikai szempontból legérdekesebb módosítása 2003-ban következett be a 9/2003. (III. 13.) ESZCSM rendelet révén, amikor megszűnt a tengeri eredetű élelmiszerekre meghatározott, mintatípustól függő 1,0-3,0 mg/kg összes arzén határérték. A változtatás oka egyértelmű: a tengeri eredetű élelmiszerek – kifejezetten az állati eredetű mintákra kell gondolni – összes arzéntartalmának csak kisebb részét teszik ki a toxikus arzénmódosulatok, az arzenit és arzenát, a többi arzénkomponens túlnyomó többsége még a konyhasóénál is nagyobb értékekkel bír. A tengeri növényi eredetű élelmiszerekre ez kevésbé igaz, mi több, a távol-keleti konyha „hijiki” fogása kiemelten sok szervetlen és így erősen toxikus arzénmódosulatot tartalmaz. Az alapvető különbség oka az, hogy általában a növényi arzénmetabolizmus és –detoxikáció sok növényi törzsnél kisebb mértékben alakítja át a környezetből felvett szervetlen arzénmódosulatokat az ember számára kevésbé toxikus módosulatokká, mivel a növények arzéntoleranciája jóval nagyobb lehet az állatvilághoz képest. Ráadásul, az evolúciós szempontból fejlettebb növények, többek közt a zárvatermők törzsébe tartozó, a világ élelmezése szempontjából kulcsfontosságú rizs /Oryza sativa L./ a bonyolult szerkezetű arzenocukrokat szintetizáló, fejletlenebb tengeri algákhoz képest sokkal egyszerűbb és „rosszabb” hatásfokú arzénkonverziót képes végrehajtani. Nem véletlen, hogy Kínában nem összes arzéntartalomra, hanem a toxikus szervetlen arzén mennyiségére vonatkozó határérték (0,15 mg/kg) van érvényben az étkezési célból termesztett rizsre.
A lenti ábrán a legfontosabb és leginkább tanulmányozott arzénmódosulatokat mutatja be, az ismert értékekkel együtt. A metiláció növekedésével az arzénmódosulatok humán toxicitása csökkenő értéket mutat, ugyanakkor az adott módosulatban az arzén oxidációs állapota is megszabja, hogy milyen értékkel lesz jellemezhető: az módosulatok mindig toxikusabbak az módosulatokhoz képest. Arzenocukrokat jelenlegi ismereteink szerint csak a növények /azon belül is az alacsonyabb rendű algák és moszatok/ állítanak elő, míg a különböző metilációs fokú arzénmódosulatok főként az állati arzénanyagcsere termékei.
Az ábrán bemutatott módosulatok közül kiemelt figyelmet kell szentelni az arzenobetainnak. Ez a komponens a tengeri állatok szervezetében lejátszódó arzéndetoxikáció legfőbb végterméke, ami az emberi szervezet számára biológiailag nem hozzáférhető és ártalmatlan vegyület. Mivel relatív mennyisége az összes arzéntartalomra vetítve elérheti a 90%-ot, érthető, miért nem állta meg a helyét a korábbi magyar jogszabály, amely nem vette figyelembe a különböző arzénmódosulatok eltérő toxicitását.

A vízben jól oldódó arzenobetain nem csupán a tengervízből felvett szervetlen arzénmódosulatok detoxikációja miatt halmozódik fel a tengeri állatok szöveteiben. Mennyisége pozitívan korrelál a tengervíz sótartalmával, így feltételezhető, hogy a szerkezetileg azonos, de nitrogéntartalmú analóg vegyületével, a glicin-betainhoz hasonló módon a sejtek ozmotikus egyensúlyának fenntartásában is szerepet játszik.
Az állati eredetű (tengeri) élelmiszerek esetén az összes arzéntartalom meghatározásán túl az arzenobetain mennyiségének megállapítása gyors becslést tesz lehetővé annak eldöntésére, hogy kell-e számolni élelmiszerbiztonsági kockázattal az adott termék fogyasztásával kapcsolatban. Ennek az az analitikai és fiziológiai háttere, hogy az arzenobetain nem csupán vízben oldódó, tehát a mintából viszonylag könnyen kinyerhető komponens, hanem a szervetlen és toxikus arzenithez képest nincs sem kovalensen, sem pedig másodlagos kötésekkel kötve a minta fehérje- és peptidalkotóihoz. Ez a megfigyelés egyrészt alátámasztja az ozmotikus folyamatokban betöltött szerepkört, másrészt felhívja a figyelmet a toxikus arzénmódosulatok kvantitatív kinyerésének nehézségeire.

Mintaelőkészítés

Analitikai szempontból tekintve az arzenobetain mérését nagyban segíti, hogy a legtöbb arzénmódosulattól eltérően rendelkezésre áll kereskedelmi forgalomban beszerezhető standard vegyület és mátrix CRM is /BCR-627 (IRMM)/. A molekulát szelektíven meghatározni vagy arzéntartalma alapján, arzénspecifikus eljárással /hidridfejlesztéssel kapcsolt atomfluoreszcenciás rendszerrel (HG-AFS) vagy induktív csatolású plazma tömegspektrométerrel (ICP-MS)/ vagy pedig molekulatömege és fragmentációs viselkedése alapján ESI-MS rendszerrel lehet. Mindhárom detektor kizárólag kapcsolt rendszerbe ágyazva, HPLC elválasztást követően alkalmas a feladatra. Bár a szelektivitás oldaláról a HPLC-ESI-MS összeállítás a legmegfelelőbb, beruházási és üzemeltetési költségeket tekintve a HPLC-HG-AFS a legkedvezőbb, a mérés és a mintaelőkészítés robosztussága szempontjából azonban a HPLC-ICP-MS a legmegbízhatóbb rendszer, ezért ennek az alkalmazását mutatjuk be.

Az arzenobetain kinyerését célzó mintaelőkészítést alapvetően arra kell alapozni, hogy a vízzel tökéletesen kioldható vegyülettel a lehető legkevesebb mátrixalkotó extrahálódjon együtt. Ebből a szempontból leginkább a kromatográfiás elválasztást nagyban hátráltató zsírok és olajok kizárására kell törekedni, amit az extraháló közeg helyes megválasztásával lehet elérni: célszerűen metanol:ioncserélt víz elegy alkalmazása a célravezető, mivel az arzenobetain metanolban is jól oldódik, azonban a zsírok és olajok metanol jelenlétében kevésbé képeznek emulziót a mintából kioldódó egyéb vegyületekkel együtt. A két oldószer arányát a minta víztartalma határozza meg: szárított vagy liofilezett minták esetén legalább 60 v/v% ioncserélt víz használata szükséges, míg friss vagy nedves /pl. konzerv/ minták esetén fordított az arány.
A következő lépések paradicsomos kagyló (vagy hal) konzerv mintaelőkészítését írják le:

A mintaelőkészítés során alkalmazott nyitott terű ultrahangos szonda nagy hatásfokú mintafeltárást tesz lehetővé. Bár ekkor az oxidáció jelentős mértékű lehet, az arzenobetain erre a folyamatra nem érzékeny és veszteség nem lép fel.

HPLC-ICP-MS vizsgálat

A kromatográfiás elválasztást ICP-MS detektálás esetén a szerves oldószerek használatának mellőzésével erős kationcserés oszlopon érdemes végrehajtani. Erre az ad lehetőséget, hogy az arzenobetain, mint viszonylag erős szerves sav /=2,2/ disszociációja pH=2,6-nál savasabb kémhatáson kellően visszaszorul ahhoz, hogy a molekula pozitív töltésű legyen és kationcserés oszlopon visszatartást mutasson. A kationcserés elválasztás még két további előnnyel jár: egyrészt a mintából származó kloridionok a holttérfogattal eluálódva nem okozhatnak addukt képződést, így nincs szükség hélium ütközési gázra az ICP-MS működtetésénél. Másrészt, a mintából extrahálódott összes, az arzenobetainnál kisebb vagy nagyobb mértékben toxikusabb szervetlen /arzenit, arzenát/ és szerves /MMA, DMA/ arzénmódosulat ugyancsak a kromatogram elején jelenik meg, így megbecsülhetjük ezen módosulatok az arzenobetainhoz képest mutatott arányát.
Az 1. Táblázat a HPLC-ICP-MS csatolt rendszer paramétereit ismerteti. Az arzén (m/z=75) mellett figyelni érdemes az elvileg a szelén két izotópját mutató m/z=77 és 82 tömegszámokat is, mivel a addukt esetleg elhúzódó (tailing) kloridzavarásra utalhat akkor, ha ezzel egyidőben a izotópon nem látunk arányos jelet.

A 2. Táblázat a kvantitatív meghatározáshoz szükséges standard addíciós összeállítást ismerteti. A standard addíció azért szükséges, mert az arzenobetainnal egyidőben biztosan eluálódnak egyéb, nem arzéntartalmú komponensek is, amelyek az előző fejezetben leírt módon mátrixhatást és érzékenység-növekedést okoznak, tehát a külső kalibráció alkalmazásához képest szignifikáns mértékben változtatnák meg a végeredményt. Abszolút értékben számolva 100 pg addíciós lépéssel érdemes kezdeni a kalibrációt, mivel ennek a mennyiségnek megfelelően működő készülék esetén már jóval az LOQ /mennyiségi meghatározási határ/ felett kell lennie.

Az alábbi ábra egy halkonzerv minta kationcserés HPLC-ICP-MS kromatogramját mutatja. Az arzenobetain mellett még egy komponens, a nagyon jó visszatartást mutató, konstans kation szerkezetű tetrametil-arzónium-kation /röviden TETRA/ mutatható ki. Ez a vegyület az arzenobetain bomlásterméke; mennyisége általában töredéke a kiindulási komponensnek.
A standard addíciós mérések elvégzése után az összes arzéntartalom ismeretében kiszámítható az arzenobetain aránya. Bár ez az érték erőteljesen függ a minta típusától, származási helyétől és a feldolgozás módjától, általában csak izomszövetből /halhús/ végzett extrakció során 80% feletti, míg más szövetet is tartalmazó élelmiszerek /kagyló, halmáj/ esetében 50-60% körüli érték várható. Ez utóbbi minták esetén az arzenobetain és a TETRA mellett számottevő lehet az arzéndetoxikáció elsődleges végterméke, a dimetil-arzinát (DMA) jelenléte is.