Prev
Next 
12. Szelektivitás, mint teljesítményjellemző élelmiszerminták vizsgálatánál: szelenometionin és szelenocisztationin meghatározása csatolt HPLC-UV-ICP-MS berendezéssel
Tanulási célok
Szelektivitás, mint teljesítményjellemző élelmiszerminták vizsgálatánál: szelenometionin és szelenocisztationin meghatározása csatolt HPLC-UV-ICP-MS berendezéssel

Elméleti alapok

Elméleti alapok

Az analitikai vizsgálatok és a (műszeres) mérések teljesítményjellemzőinek egyik legfontosabb paramétere a szelektivitás, ami azt mutatja meg, hogy az adott mérési összeállítás milyen szelektíven ad jelet a meghatározni kívánt komponensre. Amennyiben a célkomponens és a minta más alkotói (a mátrixalkotók) egymástól el nem különíthető analitikai jelet adnak, interferencia vagy más néven zavarás lép fel, amelyet meg kell szüntetni mind a minőségi, mind pedig a mennyiségi vizsgálatok esetében is.
Leegyszerűsítve a problémát: a nem kellően szelektív mérési folyamat javítása vagy a mintaelőkészítés, vagy pedig a mérőrendszer átalakításával történhet meg. A két lehetőség közötti választást az alapvető „value for money” és a „fit for purpose” elveken túl befolyásolják a rendelkezésre álló emberi erőforrások, műszaki lehetőségek ill. az analitikai feladat részleges módosítása is – ez utóbbi nem elhanyagolható eshetőség, mivel a megbízó nem mindig van tisztában a mérési feladat korlátaival, még akkor sem, ha azokért részben ő a felelős, például nem megfelelően végrehajtott mintavétel okán.
A két fő változtatási lehetőség – a mintaelőkészítés ill. a mérőrendszer átalakítása – egymástól függetlenül is megcélozható, és óhatatlanul kihatnak egymásra, hiszen az igényesebb és szelektívebb mintaelőkészítés kevésbé szelektív /általában egyúttal kevésbé költséges/ mérőrendszer használatát teheti szükségessé és viszont. Ugyanakkor figyelembe kell venni, hogy a mintaelőkészítés folyamatának meghosszabbítása vagy lépéseinek megnövelése a célkomponens „bomlásával” /decomposition/ járhat, ami a célkomponens /analyte/ a rendelkezésre álló mérőrendszer által jelként detektált tulajdonságának ideiglenes vagy végleges megszűnését jelenti. Hasonló módon információvesztést okozhat az az eljárás is, amikor a szelektivitás javítása céljából végrehajtott mintaelőkészítés „bomlást” ugyan nem okoz, azonban a célkomponens mérendő tulajdonságát nem sztöchiometrikusan módosítja – jellegzetesen a származékképzéssel járó módszerek Achilles-sarka ez. Az előbbiek alapján egyértelmű, hogy amennyiben lehetséges („value for money”), a szelektívebb mérőrendszer irányába érdemes elmozdulni a lehető legkevésbé invazív mintaelőkészítés fenntartása mellett.
Erre a válaszútra mutat be egy valódi mérési megbízáson és feladaton alapuló példát a következő szakasz.

A mérési feladat

A mérési feladat

Az Európai Unió tagállamainak többségére jellemző, hogy geológiai és földrajzi okok miatt a táplálékkal felvett egyik létfontosságú mikroelem, a szelén mennyisége nem éri el az ajánlott /70-200 μg (nap*fő) ^-1/ értéket. Ehhez kapcsolódik, hogy az élelmiszerek összes szeléntartalma nem nyújt egyértelmű információt a szelénbevitelről, mivel a különböző a szelénmódosulatok, élelmiszermátrixok és az élelmiszeripari műveletek mind befolyásolják a szelén hozzáférhetőségét, akár 90%-kal csökkentve a felvehető mennyiséget. Konkrét példaként lehet felhozni a két szélsőséget: gombafélékből az összes szelén kb. 10%-a, míg lisztekből kb. 85%-a szívódik fel.
A felvétel optimálása és az élelmiszer-, étrendkiegészítő- vagy takarmány-alapanyagok jobb dozírozhatósága érdekében célszerű meghatározni az alapanyagokban található szelénmódosulatok típusait, hogy a jobb felszívódásból fakadó esetleges túladagolást el lehessen kerülni. Egyszerűsítve ugyanis az jelenthető ki, hogy a biológiailag hozzáférhető szerves szelénmódosulatok hasznosulása kb. a kétszerese a szervetlen módosulatoknak. Ez egyúttal azt is jelenti, hogy az olykor félrevezetően „szerves szelénként” megnevezett /és az EU-ban több márkanév alatt is engedélyezett/ szelénnel dúsított élesztőből összes szeléntartalomra számítva kevesebbre van szükség, mint a korábban leginkább elterjedt Na-szelenitből.
A szelénes élesztők mellett a közelmúltban megjelent a teljesen növényi eredetű szelénforrásokra való igény is a piacon, amelynek közismert alapanyagai a dél-amerikai területekről származó, emberi fogyasztásra közvetlenül is alkalmas brazil dió /Bertholletia excelsa/ ill. az óriási szeléntartalma miatt emberi fogyasztásra csak feldolgozást követően alkalmas majomcsészedió /Lecythis minor/. E két dióféle legfőbb szelénmódosulatai a szelén-deponálási célból szintetizált szelenometionin és szelenocisztationin, két, biológiailag jól felvehető szelénvegyület. A feladat ennek a két aminosavnak ill. aminosav-származéknak a mennyiségi meghatározása.

Analitikai háttér

Analitikai háttér

Aminosav-oldalról tekintve az élelmiszerek és takarmányok aminosav-összetételének meghatározása nem újdonság: közel 30 éves az az eljárás, ahol savas hidrolízissel /legtöbbször 6 M HCl/ a fehérjéket aminosavakra bontva, kationcserés kromatográfiával, elválasztást követő származékképzéssel és UV/VIS fotometriai módszerrel lehet meghatározni mind a természetes, mind pedig a módosított aminosavakat. A már célműszerként /”aminosav-analizátor”/ is elérhető technika azonban a savas feltárási igény miatt nem használható szeléntartalmú aminosavak esetén, mivel ez utóbbiak bomláson esnek keresztül savas hidrolízis esetén. A szelén-módosulatanalitikában használt enzimes feltárásos módszer pedig egyrészt jóval drágább a rutin eljárásokhoz képest, másrészt feltárási hatásfokban bonyolult mintamátrixoknál messze elmarad tőle. Ráadásul a szeléntartalmú aminosavak koncentrációja a szélsőségesen nagy szeléntartalmú (> 50 mg Se kg^-1 sz.a.) szerves minták kivételével nem éri el a leggyakrabban használt aminosav-analizátorok mennyiségi meghatározási határát, az abszolút értékben kb. 20 pmol értéket /~ 4 ng, szelenometionin esetében/. Nehezíti a meghatározást az is, hogy a kén és szelén analógok kationcserés kromatográfiával egymástól ugyan elválaszthatók, azonban a szükséges kromatográfiai optimálás általában a többi aminosav felbontását rontja, mivel nem a megszokott „rutin” aminosavakat kell meghatározni.
Az előbbiekben felsorolt problémák közül nagy szelénkoncentráció esetén a legutolsó, koelúciós hibalehetőség jelenti a legnagyobb kihívást, mivel szeléntartalmú aminosavakra specifikus származékképzést nem ismerünk: mind a származékképzés nélküli, 254 nm hullámhosszon mutatott, mind pedig az adott származékképzőre jellemző abszorbancia minden aminosavra jelet ad. Más módon kifejezve, a mérési módszer szelektivitásának javítása jelentheti az egyik megoldási lehetőséget a feladat megoldására.
Ebben a konkrét esetben egyértelmű, hogy a szeléntartalmon keresztül nyílik mód leginkább a szelektivitás növelésére, mivel szelénspecifikus detektor alkalmazása esetén az UV-VIS oldaláról interferáló komponensek száma nagyságrendekkel csökken. Ez egyúttal azt is jelenti, hogy a kromatográfiás felbontóképesség tekintetében csak arra van szükség, hogy a két célkomponens egymástól és a holttérfogattól elváljon. Mindez nagyban egyszerűsíti az optimálási feladatot, hiszen a két komponensre visszatartást és elválasztást mutató kromatográfiás /HPLC/ rendszer kiválasztása után „csupán” arra kell ügyelni, hogy elkerüljük mind az oszloptúlterhelést, mind pedig mennyiségi meghatározási határ alá jutást.
HPLC-vel kompatibilis szelénspecifikus detektorként elvileg HG-UV-AFS, ICP-OES és ICP-MS jöhet szóba, amelyek közül a HPLC-ICP-OES csatolást szoftverillesztési gondok miatt csak körülményesen lehet kivitelezni. A fennmaradó két rendszer ismert szelénkomponensek meghatározása esetén gyakorlatilag egyenrangú a mérési teljesítményjellemzők tekintetében, és mindkét rendszer esetén ugyanazt a hibalehetőséget, az egyéb szeléntartalmú komponenssel történő koelúciót kell elsősorban kiküszöbölni, általában egy ortogonális HPLC rendszeren végzett ellenőrző vizsgálat segítségével. A szelektivitás tekintetében ugyanis ez az egyetlen számottevő interferencia, amely valódi minták esetében előfordulhat, amit a szelénmódosulatok HPLC elválasztása esetén tapasztalható, a viszonylag kismértékű mintaelőkészítési clean-up lépésekből fakadó, nem elég robusztus kromatográfiás eljárások és holttérfogathoz közeli elválasztások tovább fokoznak.
Jelen leírásban az ICP-MS rendszerre épített módszert ismertetjük. Fontos megemlíteni, hogy bár erre a feladatra szerves tömegspektrometriai detektálás (például kisfelbontású ESI-QQQ-MS) is alkalmazható, az ICP-MS rendszer teljesítményjellemzői – ütközési cellával felszerelt készülék esetében akár nagyságrendekkel – jobbak.

Mintaelőkészítés

Mintaelőkészítés
  1. A diókat pucolás követően le kell reszelni, majd Soxhlet-berendezésben ciklohexánnal zsírtalanítani szükséges, mivel a kb. 70%-os zsírtartalom lehetetlenné tenné az enzimes mintaelőkészítést.
  2. A zsírtalanított dióból meg kell határozni az összes szeléntartalmat. A szelenometionin mérése 2 mg összes Se kg^-1 zsírtalanított minta koncentrációtól lehetséges, míg a szelenocisztationin legalább 200 mg összes Se kg^-1 zsírtalanított minta koncentrációt igényel.
  3. A kiválasztott zsírtalanított diómintát dörzsmozsárban lisztfinomságúra kell porítani, majd ebből a mintából 200 mg-ot mérjünk be egy 15 ml Falcon típusú centrifugacsőbe. Adjunk hozzá 8 ml 0,1 M ammónium-acetát puffert /pH=7,2/, vortexszel keverjük fel, majd pronáz /Merck/ vagy proteáz XIV /Sigma-Aldrich/ enzimből 50 mg-ot oldjunk fel 1,0 ml pufferben és adagoljuk a mintához.
  4. A mintát folytonos rázatás mellett 37 °C hőmérsékleten 16-24 órán keresztül inkubáljuk.
  5. A kezelést követően a mintát 4000 g terheléssel, szobahőmérsékleten 20 percig centrifugáljuk, a felülúszót 0,45 μm PTFE vagy nejlon fecskendőszűrőn tisztítjuk, majd a szűrletet 10,0 ml mérőlombikban jelre töltjük ioncserélt vízzel. Ezt az oldatot az analízisig hátralévő időtől függően + 4°C vagy - 18 °C hőmérsékleten tároljuk.

HPLC-UV-ICP-MS vizsgálat

HPLC-UV-ICP-MS vizsgálat

A két célkomponens hagyományos C_18 RP oszlopokon ill. a jó visszatartást biztosító kationcserés elválasztás esetén egymástól nehezen választható el. Mivel a detektálás jelen esetben nem tömegspektrometriai alapon történik, az alapvonalig történő elválasztás elengedhetetlen követelmény mennyiségi meghatározás esetén. Ugyanakkor mivel a két komponens savas kémhatáson kationos karakterű, negatív töltésű ionpárképző vegyülettel kedvező kromatográfiás viselkedést érhetünk el RP oszlopokon is – ebből a célból leggyakrabban heptafluoro-vajsavat /HFBA/ alkalmazunk. Fontos megemlíteni, hogy tapasztalatok szerint ez az ionpárképző nem járul hozzá a szelénizotópok poliatomos zavarásához és számottevő UV abszorbanciával sem rendelkezik, lehetővé téve a szimultán UV detektálást is. Ugyanakkor az ionpárképző savas kémhatása elősegíti a szelénmódosulatok oxidációját, így az injektálás előtt a minta aliquot mennyiségét az ionpárképző mellett redukálószerrel /ditiotreitol, DTT/ is inkubálni kell.
Az ICP-MS oldaláról az ionpárképző kromatográfiával együtt járó szerves oldószer eluensek használata kötelezővé teszi a plazma argongázának oxigénnel történő kiegészítését, ami az esetek többségében a készülék felépítésének ideiglenes módosítását /torch, kónuszok, ionlencsék cseréje/ teszi szükségessé.
Az 1. és 2. Táblázat a HPLC-UV-ICP-MS csatolt rendszer paramétereit ismerteti.
1. Táblázat. HPLC-UV-ICP-MS csatolt rendszer kromatográfiai paraméterei.
HPLC oszlop
XTerra MS C_18 /Waters/, 4,6 mm x 250 mm x 5 μm
Eluens
metanol-víz, 0,1 v/v% HFBA; „A” eluens 5% metanol, „B” eluens 100% metanol
Elúciós program
grádiens, térfogatáram 0,8 ml/min
0-5 min 0% „B”; 5-15 min ↑ 50% „B”; 15-20 min 50% „B”; 20-21 min ↓ 0% B; 21-27 min 0% B
Injektált mintatérfogat
20-100 μl
Injektálási mintaösszetétel
500 μl összes mintatérfogatban 10/100 μl minta,
480/390 μl „A” eluens, 10 μl 0,1 m/m% DTT;
inkubációs idő: 5 perc
Kalibráció
Standard addíció mindkét komponensre, +0,5; +1,0; +2,0; +5,0 ng szeléntartalomban kifejezett, abszolút injektált anyagmennyiség lépésközzel
Az 1. Táblázatban az injektálási mintamennyiséget és összetételt a kiindulási minta összes szelénkoncentrációja alapján kell optimálni.
2. Táblázat. HPLC-UV-ICP-MS csatolt rendszer detektálási paraméterei
UV hullámhossz
254 nm
UV mintavételezési frekvencia
4 Hz
UV/ICP-MS csatolási késleltetés
18 s
ICP-MS
Agilent 7500cs, oxigénes üzemmód ütközési cella nélkül; porlasztás: Babington
Mért tömegszámok
m/z= 75, 77, 82, 88
A 2. Táblázat a sorba kapcsolt detektálási eljárások paramétereit sorolja fel. Származékképzés nélkül a fehérjebontást követően kialakuló aminosavak és peptidek csak kis érzékenységgel mutathatók ki – az UV kromatogram nem is arra szolgál, hogy minőségi vagy mennyiségi meghatározás alapja legyen. Ahogy a lenti kettős kromatogramot tartalmazó ábrán látható, nyilvánvaló különbség vehető észre a két detektálási rendszer szelektivitása között. Az UV kromatogramon számos „csúcs” látható, legtöbbjük közel a zajszinthez, alakjuk több esetben is koelúcióról árulkodik. Ne tévesszen meg minket a csúcsok kis száma: egy ilyen kromatogram több ezer komponenst tartalmaz.
Az ICP-MS kromatogramon két csúcsot látunk; standard addíciós azonosítás alapján az első a szelenocisztationinnal, a második a szelenometioninnal egyezik meg. Csúcsalakjuk asszimmetriája az ebben az időablakban futó izokratikus elúcióra utal, és közel áll az oszloptúlterheléshez, tehát a mintát hígítani érdemes. A két csúcs nem azt jelenti, hogy más szelénkomponens nem volt jelen mintában; csupán a többi komponens /pl. részleges fehérjebontás miatt kialakuló, szeléntartalmú peptidek/ koncentrációja túl kicsi volt ahhoz, hogy a ~ 0,1 ng szelénben kifejezett kimutatási határt elérje.
A két kromatogram között 18 másodperc különbség tapasztalható, ami a szoftveresen nem szinkronizált kapcsolt rendszerek esetén megszokott és kontroll alatt tartható. Bár a két ICP-MS csúcshoz rendelhető ennek ismeretében UV jel is, valószínűleg egyik sem a szeléntartalmú komponensekből fakad – ez is alátámasztja a standard addíciós kalibrációs eljárás szükségességét.

Gyakorló kérdések

Gyakorló kérdések
  • Hogyan állapítaná meg az ismertetett rendszer kromatográfiás holttérfogatát?
  • Magyarázza meg, miért alkalmas a szelenometionin elválasztására az ismertetett ionpárképzős eljárás.
  • Számíthat-e ^40Ar^37Cl zavarásra a két vizsgált komponens esetében?
  • Milyen különbségeket tapasztal az elméleti és a gyakorlati grádiens között? Mi ennek az oka?
  • Milyen okok állhatnak a szelenometionin tailing jelensége mögött? Válaszában vegye figyelembe a kapcsolási sorrendet is!
  • Hogyan biztosítaná a mérés analitikai minőségét?
  • Milyen módon tudná az ismertetett meghatározást gyorsítani, azonos minőségi paraméterek mellett?
  • Azonosítsa a meghatározás és a rendszer gyenge pontjait!
 Prev
Next