Prev
Next 
8.8.10. Listeria monocytogenes törzsek és tejsavbaktériumok tipizálása RAPD-PCR és rep-PCR analízissel
Tanulási célok
Molekuláris tipizálási módszerek megismerése és gyakorlati alkalmazása: A rep-PCR és RAPD módszerek alkalmazhatóságának vizsgálata Listeria monocytogenes izolátumok és különböző eredetű tejsavbaktériumok esetén

8.8.10. Listeria monocytogenes törzsek és tejsavbaktériumok tipizálása RAPD-PCR és rep-PCR analízissel

Elméleti háttér
A RAPD-PCR eljárás a teljes genom polimeráz láncreakcióval történő vizsgálatát jelenti a véletlenszerűen felszaporított amplikonok gélelektroforézises mintázatának analízisével. A sejtekből kivont genomiális DNS-t egyetlen rövid primer (indító) szekvenciával szaporítják fel, amely nem teljes homológia esetén is képes az egyszálú DNS-hez kapcsolódni a PCR reakció során alkalmazott, a szoros PCR körülménynél kisebb (36-42 °C-os) primer kötődési hőmérséklet következtében. PCR termékek akkor keletkeznek, amikor a primer kötődési helyei az amplifikációs távolságon belül (kevesebb, mint 5000 bázispár távolságban) helyezkednek el a megfelelő irányban. A termékek hossza, a primer kötődésének hatékonysága, és így a felszaporítás is változik a kapcsolódási helyek függvényében. Ennek következtében erősebb és gyengébb amplikonok is létrejönnek, ami megnehezíti az eredmények értelmezését. A reakciósorozat végére az indítószekvenciától és a PCR reakció körülményeitől függően több különböző méretű amplikon keletkezik, amelyek elválasztása agaróz gélelektroforézissel történik. A kapott mintázat a vizsgált mikrobatörzs ujjlenyomata, így a módszer alkalmas az azonos fajhoz tartozó törzsek elkülönítésére (tipizálására). A módszer hátránya azonban, hogy nehezen reprodukálható, ami ellentétben áll az eljárás gyorsaságával és költség-hatékonyságával. Abban az esetben azonban, ha a módszer standardizálásra kerül, különösen jól alkalmazható izolátumok egyidejű összehasonlítására, tipizálására.

A miniszatellit szekvenciák (variable number of tandem repeat – VNTR sequences - eltérő számú tandem ismétlődő szekvenciák) általában 9-60 nukleotid hosszúságú, több kópiás ismétlődések (rep szekvenciák), amelyek száma a genomban igen változékony. Az M13 bakteriofág köpeny fehérjéjét kódoló gén tandem ismétlődő szekvenciáját hibridizációs próbaként alkalmazták E. coli törzsek vizsgálatára, amelynek során megfigyelték, hogy ezen miniszatellit szekvencia alkalmazásával jelentős variabilitás volt kimutatható mind környezeti, mind pedig klinikai E. coli izolátumok esetében. Mivel a szekvencia számos eukariótában, prokariótában és vírusban megtalálható, gyakran alkalmazzák rep-PCR reakcióban primerként, például tejsavbaktérium izolátumok tipizálására.

A RAPD-PCR és a rep-PCR elméleti háttere részletesen megtalálható a 8.7. fejezetben.

A gyakorlat célja
A rep-PCR és RAPD módszerek alkalmazhatóságának vizsgálata Listeria monocytogenes izolátumok és különböző eredetű tejsavbaktériumok esetén és a különböző izolátumok tipizálása.

Elvégzendő feladat

Vizsgálandó mikroorganizmusok
  • Különböző élelmiszerekből (pl. tejből és sajtból) származó Listeria monocytogenes és más Listeria fajokhoz tartozó izolátumok genomiális DNS-e (a DNS izolálás menetét lásd a 8.8.8. fejezetben)
  • Erjesztett tejtermékekből izolált tejsavbaktériumok genomiális DNS-e (a DNS izolálás menetét lásd a 8.8.8. fejezetben)
Szükséges anyagok
  • 0,5x TBE puffer (44,5 mM Tris–HCl, 44,5 mM bórsav, 1,25 mM EDTA, pH 8,3)
  • 10 mg/ml etidium-bromid vizes törzsoldata
  • felvivő (loading) puffer (5 g szacharóz, 1 ml Na-EDTA [0,5 M], 10 mg brómfenolkék, 10 µl SDS [10 % (v/v)], 10 ml bidesztillált víz)
  • DNS molekula méret marker: DNA Molecular Weight Marker VI. (298 – 2176 bp mérettartományban) (Boehringer Mannheim, Németország)
Szükséges eszközök
  • automata pipetták és eldobható steril pipetta hegyek
  • 0,2 ml térfogatú PCR csövek és 1,5 ml térfogatú Eppendorf csövek
  • mikrocentrifuga
  • PCR készülék
  • elektroforézis készülék
  • géldokumentációs rendszer (pl. GelDoc 1000 Bio-Rad Laboratories, Richmond, USA)
A gyakorlat menete
  1. rep-PCR analízis
    A genomiális DNS-t valamennyi törzs esetén az M13 miniszatellit primerrel amplifikáljuk. Az alkalmazandó primer degenerált, mivel két nukleotid helyén is ’N’ szerepel, amely valamennyi nukleotidot (A, G, C, T) helyettesítheti.
    Az M13 primer szekvenciája:
    GAGGGTGGNGGNTCT
    A PCR reakcióelegy (25 µl) összetétele egy mintára a következő:
    10x PCR puffer
    2,5 µl
    MgCl_2 (25 mM)
    1,25 µl
    dNTP (10 mM)
    0,75 µl
    M13 (5 µM)
    2,5 µl
    Taq DNS polimeráz (2 U/µl)
    0,3 µl
    DNS (100 ng/µl)
    1 µl
    steril PCR víz
    16,7 µl
    A PCR-es amplifikálás paraméterei a következők:
    Kezdő denaturálás: 95 °C, 5 perc
    Ciklus (35-ször ismételve):
    denaturálás: 95 °C, 30 másodperc
    primer kötődés: 40 °C, 30 másodperc
    lánchosszabbítás: 72 °C, 1 perc 30 másodperc
    Végső lánchosszabbítás: 72 °C, 5 perc
    Hűtés, tárolás: 4 °C-on.
  2. Agaróz gélelektroforézis az amplikonok kimutatására
    Végezzük el az eltérő méretű amplikonok elválasztását agaróz gélelektroforézissel! Az etidium-bromiddal kiegészített 1,5 %-os agaróz gélre a minták felvitele a következők szerint történjen: keverjünk össze 8 μl amplifikált DNS-t és 3 μl futtató puffert, majd a teljes mennyiséget vigyük fel a gél kijelölt zsebébe! Az amplikonok méretének meghatározása céljából a gél első és utolsó zsebébe vigyük fel a VI. markert (3 μl marker 1 μl futtató pufferrel összekeverve)! Az elektroforézis 120 V feszültségen körülbelül 120 percig történjen!
  3. A mintázatok összehasonlítása és kiértékelése
    Az elektroforézist követően világítsuk meg a gélt UV-fénnyel és fényképezzük le a géldokumentációs rendszerrel! A rep-PCR vizsgálattal kapott eredmények kiértékeléséhez hasonlítsuk össze a különböző törzsek esetében kapott mintázatokat a GelCompareII szoftverrel és elemezzük ki! Az eredmények alapján készítsünk dendogramot Jaccard korrelációs koefficienssel 1,5 %-os maximális pozíciós tolerancia mellett a 8.8.11. fejezetben leírtak alapján. A klaszterek kialakításához az UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic averages) módszert alkalmazzuk!
A gyakorlat értékelése
  1. A Listeria izolátumokkal kapott dendogram alapján határozzuk meg az elkülöníthető hasonlósági csoportokat (klasztereket)! Milyen hasonlóságot mutatnak az azonos és a különböző fajhoz tartozó izolátumok?
  2. A tejsavbaktériumokkal kapott dendogram alapján állapítsuk meg a különböző tejtermékekből izolált tejsavbaktériumok közötti klonális kapcsolatok meglétét vagy hiányát! Milyen következtetések vonhatók le a kapott eredmények alapján?
 Prev
Next