Prev
Next 
7.2. Az immundiagnosztikai módszerek jellemzői
Tanulási célok
A diagnosztikai célra kidolgozott egyszerű és automatizált immunológiai eljárások megismerése

7.2. Az immundiagnosztikai módszerek jellemzői

Az immunkémia fiatal tudományterület, amely az utóbbi évtizedekben nagymértékű fejlődésen esett át. Az immunológiai módszerek széles körben alkalmazott analitikai eljárásokká váltak. Az immunfolyamatok mélyebb, molekuláris szintű megismerése elengedhetetlen volt a diagnosztikai eljárások kifejlesztéséhez, ezért az immunológiai ismeretek mellett a molekuláris biológia fejlődése is nagyban hozzájárult az immunológiai gyorsmódszerek gyakorlatban történő elterjedéséhez és alkalmazásához. Az eljárásokat eredendően orvos diagnosztikai céllal fejlesztették ki, napjainkban azonban a klinikai gyakorlat kereteit átlépve mind a kutató-, mind pedig a különböző diagnosztikai laboratóriumok széleskörűen alkalmazzák specifikus azonosítási módszerekként. A mikrobiológia területén belül az immundiagnosztikai módszerek sikeresen alkalmazhatók kórokozók és toxinjaik gyors és megbízható kimutatására. Az élelmiszer vizsgálatok esetében ezen kívül az allergének, szennyező anyagok (pl. peszticidek, mikotoxinok) kimutatásának is nagy jelentősége van. Számos validált, az élelmiszerek vizsgálatára alkalmas immunológiai diagnosztikum kapható kereskedelmi forgalomban.

A laboratóriumban végzett szerológiai reakciók célja az antigén-antitest specifikus összekapcsolódás detektálása. Az antigéneknek rendszerint több epitópjuk van, amelyek mindegyikéhez képes ellenanyag kötődni, míg az antitestek bivalensek. Nagyszámú ellenanyag és antigén találkozásakor a kialakuló keresztkötéseknek köszönhetően antigén-antitest komplexek, hálózatok keletkeznek (7.4. ábra), amelyek szabad szemmel is látható aggregátumok vagy finom kolloidális pelyhek formájában kicsapódnak. Az előbbi folyamatot agglutinációnak, míg az utóbbit precipitációnak nevezzük. A keresztkötések kialakulása függ az ellenanyag-antigén arányától; mind az antitest, mind pedig az antigén feleslege csökkenti a szerológiai reakció mértékét, míg a legerősebb reakció az úgynevezett ekvivalencia tartományban következik be (7.5. ábra).
Az immunkomplexek szemmel látható kicsapódásával járó szerológiai reakciók igen érzékenyek és specifikusak, ennek köszönhetően jól alkalmazhatók mikroorganizmusok, mindenekelőtt baktériumok kimutatására és szerotipizálására (7.3.1. és 7.3.2. gyakorlatok).
Az antitest-antigén kapcsolódása kimutatható jelölt antitestek alkalmazásával is. A jelölésre többféle lehetőség kínálkozik. Az ellenanyag jelölhető radioaktív izotóppal, de úgy is, hogy az immunglobulinhoz fluoreszcens festéket, vagy enzimet kötnek kovalensen (konjugátum). A radioaktív jelölésen alapuló technikákat (RIA - radioactive immunoassay) egészségügyi és környezetvédelmi megfontolások miatt ma már kevéssé alkalmazzák. Helyüket a biztonságos és kényelmes hideg jelölési eljárások vették át, amelyek alapján számos immundiagnosztikai eljárást dolgoztak ki. Az alábbiakban a legfontosabb technikákat ismertetjük röviden. Fluoreszcens antitest reakció esetén a fluoreszcens festékkel jelölt ellenanyag az antigénnel való kötődés hatására gerjeszthetővé válik, tehát pozitív reakció esetén UV fénnyel megvilágítva a mintát fluoreszcencia tapasztalható. A módszer egyszerűen alkalmazható mikroorganizmusok közvetlen kimutatására tiszta vagy kevert tenyészetekből (tápközegek, dúsítók), valamint lehetőséget ad a mikrobák in situ, pl. biofilmekben történő vizsgálatára és azonosítására is. A fluoreszcens festékhez kötött ellenanyagot gyakran használják fel DNS jelölésére is, amelynek segítségével a DNS próbának a célgénhez való kötődését is ki lehet mutatni (pl. FISH - fluoreszcens in situ hibridizációs technika, 5.3.1. és 8.6.3. fejezetek).
Az EIA technika (enzyme immuno assay) során az immunkomplex kialakulásának jelzésére enzimmel jelölt konjugátumot alkalmaznak. A konjugátum kialakítására többféle enzim is használható, leggyakrabban a torma peroxidázt kötik az antitesthez. Az enzimes reakció lejátszódását színreakció jelzi.

Az ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) módszer különlegessége, hogy a szerológiai reakció nem oldatban, hanem egy szilárd fázis felületén jön létre. Az antitestet vagy az antigént szilárd fázisú hordozón (pl. mikrocsőben, membránon, pipettahegyben) rögzítik, így az immunkomplex a hordozó felületén jön létre. Nemcsak kvalitatív, hanem színes terméket képező szubsztrátumok alkalmazása révén mennyiségi meghatározásra is lehetőséget adó módszer.
A detektálás alapvetően az alábbi öt lépésből áll:
  1. Az antitest vagy antigén felülethez való kötése
  2. A megmaradó fedetlen helyek blokkolása nem specifikus fehérjével (pl. BSA=szarvasmarha szérum albumin, zselatin) a nem specifikus reakciók megakadályozására
  3. Immunológiai reakció lejátszódása (az antigént vagy konjugátumot tartalmazó mintával történő inkubálás)
  4. Mosás, a nem kötött molekulák eltávolítása
  5. Enzimreakció - a szubsztrátum hozzáadását követően a színreakció lejátszódása, spektrofotometriás mérés.
Az ELISA technikának több változata van. A direkt módszerek esetén az enzimmel jelölt konjugátum (antitest, ritkábban antigén) közvetlenül a kimutatandó molekulához kötődik, míg az indirekt kimutatásnál egy nem jelölt reagensen keresztül, közvetve kötődik a konjugátum a célmolekulához (pl. antigénhez). Mind a direkt, mind az indirekt módszernek van kompetitív változata is.

A módszerek közül a szendvics ELISA módszer a legelterjedtebb, amelynek elve a következő: a szilárd fázisú hordozóhoz kötött ellenanyaghoz a mintában lévő antigén hozzákötődik, majd újabb, az antigénre specifikus, enzimmel jelölt antitestet adnak a mintához, így egy ellenanyag-antigén-ellenanyag szendvics komplex jön létre (7.6. ábra). Ehhez a komplexhez hozzámérik az enzim szubsztrátumát, amelyből az enzimreakció révén színes termék képződik (7.7. ábra). A keletkezett szín intenzitása spektrofotométerrel mérhető, és arányos az antigén mennyiségével, így kalibráció után a reakció kvantitatívvá tehető.
Indirekt ELISA esetén az immunkomplex kimutatása az antigénre specifikus antitesthez kötődő, enzimmel jelölt ellenanyaggal történik. Ennél az eljárásnál általában az antigéneket rögzítik a hordozóra. A módszer nem az antigének, hanem egy adott szérumban az antigénre specifikus antitestek kimutatására szolgál, így inkább a klinikai gyakorlatban van jelentősége a betegségek diagnosztizálásánál. A kompetitív ELISA módszert elsősorban kis molekulák, haptének kimutatására alkalmazzák. Az egyik lehetséges megoldás, hogy a felülethez kötötten található az antigén vagy haptén, majd ehhez adják hozzá a vizsgálandó mintát és a jelölt konjugátumot. A felülethez kötött és oldatban lévő, mintából származó molekulák versengenek a limitált számú antitest kötőhelyeiért. Minél nagyobb a mintában a célmolekula koncentrációja, annál kevesebb antitest tud a felülethez kötött antigénhez/hapténhez kapcsolódni. A kompetitív módszereknél a színreakció elmaradása, vagy intenzitásának csökkenése jelzi a kimutatandó antigén, illetve haptén jelenlétét.
Az immundiffúziós eljárásoknál agar- vagy agaróz gélt alkalmaznak. A gélbe vágott lyukakba egymással szemben bevitt komponensek (antigének és antitestek) molekulaméretüktől függően radiálisan bediffundálnak a gélbe. A találkozási zónákban az immunkomplex kialakulását precipitációs csík jelzi, amelyek számából meghatározható a homológ antigének-antitestek száma.

Az immunelektroforézist elsősorban poliklonális ellenanyagok esetén az antitest frakciók elválasztására alkalmazzák. A gélben a szérumfehérjék mobilitásuknak megfelelően elválasztódnak, frakciókra különülnek el.

A gyakorlat számára jól alkalmazhatóak a diffúzió elvén működő kromatográfiás gyorstesztek. Rendszerint a jelölt antitestet gélbe zárják, majd a gélre felviszik az antigént tartalmazó mintát. Az antigén a gélbe diffundál, vándorlása során eléri a rögzített ellenanyagot, és kialakul az immunkomplex, amit színváltozás jelez. Számos kórokozó kimutatására, illetve azonosítására fejlesztettek ki immunkromatográfiás gyorstesztet (7.3.3. és 7.3.4. gyakorlat).

Az immunológiai eljárások alkalmasak lehetnek a szabványos mikrobiológiai munka lerövidítésére. Szelektív dúsítási lépés kihagyását eredményezheti a sejtek koncentrálásának egyik módja, az immunmágneses szeparálás (immunomagnetic separation, IMS), amelynek során mágneses részecskékhez vagy gyöngyökhöz olyan specifikus antitesteket rögzítenek, amelyek megkötik a mikroba célsejteket (7.8. ábra). Az immunkomplex kialakulását követően a gyöngyöket mágnessel összegyűjtik, ezáltal lehetővé válik a patogén mikroorganizmus elkülönítése az elődúsító tápközegből. Az IMS a szelektív dúsítással analóg módszer, de ebben az esetben az esetlegesen stressz-sérülést okozó antibiotikumok vagy durva reagensek helyett antitestet alkalmaznak a cél mikroorganizmus „elfogására”. Az immunmágnessel elfogott sejtek tovább tenyészhetők táptalaj felületén, vagy más (pl. molekuláris) vizsgálatokban használhatók fel. A Dynabeads immunmágnes készítményeknek számos, a mikrobiológia és a molekuláris biológia területén alkalmazható változata van (7.3.5. gyakorlat).
Mikrobák kimutatására egyelőre kevéssé alkalmazott technikák az immunoblott és az immuncsapdás-PCR módszerek, mivel igen költségesek és komoly felszereltséget, szaktudást igényelnek, így rutinszerű alkalmazásuk csak néhány vizsgáló laboratóriumban megoldott.

Az immunoblott elsősorban fehérje természetű antigének esetén alkalmazható. Tisztított antigén-preparátumra van szükség, amelynek komponenseit először gélelektroforézissel elválasztják, majd nitrocellulóz membránra rögzítik (blottolás). A nitrocellulóz membránon rögzített antigének kimutatása izotóppal, vagy festékkel jelölt antitestekkel történik. A módszer lehetőséget ad többféle antigén egymás melletti kimutatására.

Az immuncsapdás-PCR egyesíti az immunológia és molekuláris biológia által nyújtott lehetőségeket, megnövelve a szenzitivitást és a specifikusságot is, így a kis számban előforduló, illetve a nem, vagy nehezen tenyészthető mikroorganizmusok detektálására is kiválóan alkalmas. Összehasonlító vizsgálatok szerint egyes vírusok kimutatásánál a módszer érzékenysége az ELISA módszerhez képest mintegy tízszeres. Az eljárás első lépése, hogy a szilárd fázisra, pl. mágneses gyöngyök felszínére rögzített specifikus antitestek révén a célsejteket „csapdába ejtik”, majd a második lépésben a mikroorganizmusokból nukleinsav kivonása után faj-, törzs specifikus primereket alkalmazva az adott mikrobára jellemző DNS szakaszokat szaporítanak fel PCR-rel, és ezeket gélelektroforézissel elválasztják (8.7.3. fejezet). A módszer továbbfejlesztve a valós idejű (real-time) PCR technikával is kombinálható, ezáltal alkalmassá tehető az antigének, mikrobák mennyiségi meghatározására is (8.7.7. fejezet). Az immuncsapdás-valós idejű PCR vírusok és baktériumok (pl. E. coli O157:H7) vagy toxinok (pl. Staphylococcus aureus enterotoxin) kimutatására, mennyiségi meghatározására egyaránt alkalmazható.

Ígéretes, kísérleti fázisban lévő módszer az immun-folyadék-mikrochipek alkalmazása. Az antitestekkel borított mikrogyöngyökkel egy mikrokamrát töltenek fel, majd néhány mikroliternyi élelmiszermintát visznek a kamrába, ahol a mikrobasejtek a gyöngyökhöz kötött, adott mikroba fajra vagy szerotípusra specifikus antitestek révén „csapdába esnek”. A mikrobák detektálása biolumineszcencia alapján történik. A módszer nem igényel minta előkészítést, nagy érzékenységű és specifitású, valamint rendkívül gyorsan ad eredményt. Ebben a rendszerben lehetőség van a patogének valós idejű, mennyiségi detektálására. A fejlesztések a hordozható detektálórendszer kidolgozását célozzák.
 Prev
Next