Prev
Next 
8.6. Molekuláris hibridizáción alapuló módszerek
Tanulási célok
A molekuláris hibridizáción alapuló módszerek áttekintése és jellemzése. Hordozóhoz kötött és oldatban történő hibridizációs eljárások, valamint a FISH technika megismerése

8.6. Molekuláris hibridizáción alapuló módszerek

A 8.1. részben bemutatott DNS-DNS, DNS-RNS vagy RNS-RNS hibridizálási lehetőségek adják az alapját ezeknek a módszereknek. A teljes genomra kiterjedő vagy nagy, komplex molekulák hibridizálása mellett gyorsan kifejlődtek azok az egyszerűbb hibridizálási technikák, amelyek lényege, hogy rövid (15-30 nukleotid hosszúságú) egyszálú DNS-ből álló, ún. próbát hibridizálnak a vizsgálandó denaturált DNS-hez vagy RNS-hez, amelynek kötődése jelzi a keresett DNS szakasz (gén) jelenlétét. A próba olyan, a kimutatni kívánt célgénnel homológ DNS szekvencia, amely a vizsgált mikroba genomja esetében nagy valószínűséggel csak a célgénnel hibridizál. A hibridizáció lejátszódásához a próbát jelölni kell, amelyre különböző lehetőségek állnak rendelkezésre. A legrégebbi és kutatási célra ma is kiterjedten alkalmazott eljárás a DNS vagy RNS radioaktív (^32P-es) jelölése, amelyet egyre inkább felváltanak a nem radioaktív (ún. hideg) jelölési módok, mivel ezeknél nincs szükség költséges laboratóriumra és speciálisan képzett szakemberekre, valamint a környezetterhelés is lényegesen kisebb. A legelterjedtebb hideg jelölési módok a biotin-avidines, a digoxigenines jelölések, az enzimmel konjugált ellenanyagon alapuló (indirekt) immunológiai jelölések, valamint a fluoreszcenciás és kemilumineszcenciás jelölések.

Az in vitro hibridizációs eljárások technikai szempontból két típusba sorolhatók. A korábbi és ma is szélesebb körben alkalmazott módszer során a vizsgálandó nukleinsavat valamilyen hordozóhoz kötik és ehhez hibridizálják a jelölt próbát, majd később kifejlesztették az oldatban történő hibridizációs eljárást is.

8.6.1. Hordozón történő hibridizációs eljárások

A Southern-féle lenyomat készítés (blotting) lényege, hogy a sejtekből kivont DNS-t restrikciós endonukleázzal feldarabolják, majd agaróz gélen elválasztják. A lúggal denaturált DNS szálakat ezután átviszik nitrocellulóz vagy nylon membránra, amelyhez hőkezeléssel rögzítik. Ezt követően hozzáadják a (radioaktívan) jelölt próbát, majd röntgenfilm ráhelyezésével kimutatják a pozitív (pl. a keresett gént tartalmazó) DNS sávot (8.15. ábra).
A Southern lenyomathoz hasonlóan RNS-t is lehet rögzíteni gélelektroforézist követően a membránon, amelyet ezután hasonlóan kezelnek, mint előzőleg bemutattuk; ezt a hibridizációs eljárást Northern blotnak hívják (8.16. ábra).
Nemcsak az izolált DNS-t lehet közvetlenül nitrocellulóz membránhoz rögzíteni, hanem a membránon lizált sejtekből kiszabadult DNS-t is. Ezek a sejtek származhatnak tápagar lemezen kifejlődött telepekből, amikor a membránt egyszerűen rányomják a kinőtt telepekre. Az így átvitt sejtekből kiszabaduló DNS elegendő a hibridizációs reakció kimutatásához. Ezt a módszert telephibridizációnak hívják.

A molekuláris hibridizáció speciális változata, amikor az rRNS-t kódoló rDNS-re specifikus génpróbákat hibridizálnak a sejtekből kivont és restrikciós endonukleázzal megemésztett DNS-hez. Ez a módszer főként a faj szintű identifikálásra alkalmas, mivel az rDNS gének az erősen konzervatív gének közé tartoznak. Megfelelő (többszörös) génpróbák segítségével nemzetség, faj szintű vagy faj alatti azonosítást tesz lehetővé ez a módszer.

A DuPont Qualicon (USA) által kifejlesztett „RiboPrinter” Mikroba Karakterizáló Rendszer rDNS hibridizáción alapuló mikroba identifikációs készülék, amelynek adatbázisa jelenleg 180 nemzetség 1400 fajára kiterjedő 7000 mintázatot tartalmaz, és élelmiszer eredetű patogén baktériumok azonosítására is jól alkalmazható. További részletes információ a http://www2.dupont.com/Qualicon/en_US/products/RiboPrinter_System/ honlapon található.
A microchip, másnéven microarray hordozóhoz rögzített, megfelelően elrendezett egyszálú DNS darabokat (PCR termékeket vagy cDNS oligonukleotidokat) tartalmaz, amelyek hibridizációval megkötik a jelölt DNS-t, vagy pedig a gének átíródásával kapott, ugyancsak jelölt mRNS-t. A jelölés általában fluoreszcenciával történik, és a kapott eredmények kiértékelése teljesen automatizált.

Általában kétféle mikrochipet használnak. Az egyik esetben a kimutatandó géneket reprezentáló cDNS próbákat megfelelő elrendezésben robot segítségével üveg hordozóhoz rögzítik, majd ezt követően a vizsgálandó jelölt egyszálú DNS-t vagy DNS keveréket hozzáadják a mikrochiphez és a fluoreszcenciát mutató kamra helyzetéből következtetnek a célgén(ek) azonosságára.

A másik típusú mikrochip egy-egy organizmus teljes genomját reprezentálja cDNS molekulák formájában és ehhez hibridizáljak a különböző körülmények között átírt mRNS-ekről készített jelölt cDNS-t (8.17. ábra). Ez utóbbi változat lehetőséget ad a génműködés kvantitatív jellemzésre is, amelynek segítségével például vizsgálni lehet a patogén baktériumok virulencia (pl. toxin termelésért felelős) génjeinek megnyilvánulását befolyásoló környezeti hatásokat, szabályozásukat, valamint a biofilm képzést befolyásoló körülményeket is. A mikrochipek alkalmazásának előnye, hogy képesek egyidejűleg több gén kimutatására, vagy pedig a gének különböző körülmények közötti expressziójának tanulmányozására is.

8.6.2. Oldatban történő hibridizációs eljárások

A hibridizáción alapuló technikák másik változata az oldatban történő hibridizálás, amelynek során a vizsgálandó mintában lévő sejteket oldatban feltárják, majd a kiszabaduló DNS-hez, vagy az mRNS-ről készített cDNS-hez jelölt próbát hibridizálnak. A meg nem kötött próbát degradálják, a hibridizációt pedig a jelölésnek megfelelően detektálják. Ez az eljárás lényegesen egyszerűbb, mint a hordozóhoz kötött cél DNS-en alapuló módszer, azonban érzékenysége kisebb, mivel mind a cél DNS-nek, mind pedig a próbának nagy koncentrációban kell jelen lennie az oldatban ahhoz, hogy a reakció lejátszódjon.

Egy sokkal érzékenyebb változat az ún. szendvics hibridizáció, amelynek során a cél DNS-hez kétféle specifikus próbát kötnek: az egyik a jelölt (ún. riporter) próba, a másik pedig a csapda próba. A csapda próbát egy hordozóhoz rögzítik, amellyel a cél DNS-t „kihalásszák” az oldatból. A cél DNS megkötése után hozzáadják a riporter próbát, amely ugyanannak a DNS-nek egy másik részéhez kötődik és a reakció lejátszódását a jelölésnek megfelelően detektálják.

8.6.3. Fluoreszcens in situ hibridizáció

A sejten belüli humán kromoszómán lévő célgének közvetlen kimutatására fejlesztették ki a FISH módszert, amely a Fluoreszcens In Situ Hibridizálás rövidítésből ered. Ennek során fluoreszcens festékkel konjugált ellenanyagot használnak a próba kötődésének kimutatására, ami fluoreszcens mikroszkóppal közvetlenül megfigyelhető. A FISH módszer nagy előnye a korábban bemutatott hibridizálási módszerekkel szemben, hogy nem igényel sejtfeltárást és a hibridizáció megtörténtét fluoreszcens mikroszkóppal azonnal vizsgálni lehet. Az eljárás során a vizsgálati mintát egy vagy több FISH próbával hibridizálják, majd fáziskontraszt objektívvel és UV megvilágítással, különböző szűrők alkalmazásával vizsgálják a célmikrobák jelenlétét. Erre látható példa a 8.18. ábrán.

A módszer továbbfejlesztett változata, amikor a citoplazma riboszómáiban nagy kópiaszámban jelenlévő rRNS-sel hibridizáló fluoreszcensen jelölt próbát alkalmaznak. Mivel a sejtek elpusztulása után az RNS gyorsan lebomlik, ezért további előnyt jelent az a képessége, hogy csak az élő sejteket mutatja ki.

Újabban a DNS helyett PNS (peptid nukleinsav) próbákat használnak a hibridizációhoz. A PNS olyan DNS analóg vegyület, amelyben a cukor-foszfát kötések helyett poliamid kötések vannak. A PNS előnye a DNS-sel szemben, hogy nagyobb az affinitása, erősebben hidrofób, ezért a baktériumok sejtfalán és a membránokon jobban áthatol, mint a DNS.

A FISH technika kevert fajokból álló mikroba populációk közvetlen vizsgálatára is kiválóan alkalmas, így klinikai eredetű, valamint környezeti minták is közvetlenül vizsgálhatók vele. Élelmiszerek esetén azonban csak bizonyos feltételek mellett alkalmazható, mivel az élelmiszerek egyes részecskéi zavarhatják a baktérium sejtek kimutatását az epifluoreszcens mikroszkópos vizsgálatnál. Abban az esetben, ha a vizsgálat során a mikroba sejtszámot is meg kell határozni, az eljárás időigénye megnövekszik. Ennek kiküszöbölésére fejlesztették ki az úgynevezett FISH-FC módszert (FISH after filter cultivation), amely a FISH eljárást egy membránszűrőn történő tenyésztéssel kombinálja.
A hibridizációs módszerek specifikusságát alapvetően meghatározza a szelektált célgén specifikussága. Amennyiben nemzetség vagy faj szintű identifikálás a cél, olyan gént vagy géneket kell keresni, amelyek a nemzetség vagy faj evolúciója során nem, vagy keveset változtak. Ilyenek például az rRNS gének. Amennyiben patogén baktériumok kimutatása vagy azonosítása a cél, abban az esetben ajánlatos közvetlenül a virulencia génekkel hibridizáló próbákat alkalmazni.

A hibridizációs módszerek érzékenységét több tényező is befolyásolja, amelyek közül kiemelendő az adott genomban található célgének kópiaszáma. Minél nagyobb a kópiaszám, annál jobb érzékenység érhető el. Ebből a szempontból is legjobbak az rRNS gének, amelyek kópiaszáma a legtöbb élőlény genomjában 100 feletti, bár kivétel is akad. Az alkalmazott jelölési módszer szintén fontos érzékenységi tényező, ebből a szempontból legjobb a radioaktív jelölés, bár a legújabb enzimes és kemilumineszcens technikák már megközelítik ennek érzékenységét.

A kimutatási határ általában 10^410^6 kópia/célgén tartományban van, amelyet mikroba koncentrációra is vonatkoztatni lehet, ha a célgén kópiaszáma a mintában állandó. Mivel a vizsgált mintákban a patogén baktériumok általában ennél kisebb koncentrációban vannak jelen, ezért elődúsítás vagy dúsítás is szükséges. Ebből következik, hogy hibridizációs módszerekkel csak minőségi vizsgálatot lehet végezni, azaz a cél baktérium jelenlétét vagy hiányát lehet kimutatni a vizsgált mintamennyiségben.
 Prev
Next