Ugrás a tartalomhoz

Népegészségügyi genomika

Ádány Róza (2011)

Debreceni Egyetem

2. fejezet - Genomikai vizsgálatok

2. fejezet - Genomikai vizsgálatok

Genomikai vizsgálómódszerek

Általános bemutatás

Az informatikának a molekuláris biológiába történő integrálódása, a bioinformatika létrejötte lehetővé tette, hogy a hagyományos genetikai vizsgáló módszerek mellett olyan technikák jöjjenek létre, melyek eredményeként a genetikai kutatások, továbbá a genetikai vizsgáló módszerek forradalmi átalakuláson mehettek keresztül. Az élő szervezeteket felépítő különböző molekuláris rendszerek működésének megismerése, az megismerést lehetővé tevő kísérletes biológiai vizsgálatok legfontosabb mozgatójává vált a genomika oldaláról történő megközelítés. Az összes génre kiterjedő génszintű megközelítések (szerkezeti) kiszélesedtek a génexpressziós változások és/vagy fehérjeszintű (funkcionális) eltérések analízisével. Létrejött a genomikai megközelítés, mely szinte a biológia minden területén a gének szerkezeti megismerése mellett jelentősen hozzájárult azok funkciójának megismeréséhez.  A genomika területén megszületett eredmények forradalmasították a biomedicinát, nemcsak az alapkutatás, de diagnosztika és terápia területén forradalmi értékű eredmények születtek.

 A biomedicina igen jelentős gyakorlati eredménye az ember genetikai állományának, a DNS bázissorendjének meghatározása, a genom kódoló szekvenciáinak megismerése, új betegség specifikus gének megismerése. Az új módszertani fejlesztések, melyek közül kiemelkedő jelentőségűek a polimeráz láncreakció (PCR), rekombináns DNS technológiák, szekvenálás, in situ hibridizációs technikák és különböző nukleinsav mikrocsip alapú módszerek kidolgozása és alkalmazása, lehetővé tették, hogy ma már nemcsak egyedi gének eltéréseit tudjuk tanulmányozni, hanem a genom egészében létrejött változások sorozatát is képesek vagyunk vizsgálni.

A biomedicinában a genomikai vizsgáló módszerek közül azoknak az eljárásoknak van kiemelkedő jelentősége, melyek szignifikánsan hozzájárulnak a betegségek iránti fogékonyság korai felismeréséhez, a betegségek progressziójában szerepet játszó genom eltérések kimutatásához, a betegségekre jellemző molekuláris eltérések diagnoszkiai értékű detektálásához és akár ezen eltérések alapján a terápia kiválasztásához, hatékonyságának monitorozásához. Ezek közé a módszertani megközelítések közé tartoznak.

- a genom eltéréseit kutató azon módszerek, melyek alkalmazásával új, betegség specifikus génpolimorfizmusok/génvariánsok (kromoszóma kópiaszám variciók) ismerhetők meg. Forradalmi lépésként említjük meg az in situ hibiridizációs módszereket (interfázisos citogenetika, array/mikrocsip alapú módszerek) PCR alapú technikák,

- gének funkcionális vizsgálatai, melyekkel különböző környezeti karcinogének okozta expozíciók mértékét jellemző funkcionális eltérések ismerhetők fel, olyan molekuláris útvonalak azonosíthatók, melyekben résztvevő funkcionális szereppel bíró molekulák terápiás célpontként a betegség hatékonyabb gyógyítását eredményezhetik.

A hagyományosan már évtizedek óta alkalmazott módszerek alkalmazásának kiterjesztéséhez, más módszerekbe történő integrálásához és új módszertani megközelítések létrejöttéhez jelentősen hozzájárultak azok az igények, melyek a genomprogramok eredményes megvalósításához szükségesek voltak. A genom vizsgálatok eredményeit a genom adatbázisok foglalják össze, melyek rendezett adatbázisok a gének tulajdonságait nemcsak szerkezeti, de összehasonlítható funkcionális szempontból csoportosítottan foglalja össze, melyek mindenki számára ingyen hozzáférhetők, és meghatározott feltételek mellett bővíthetők, aktualizálhatók.

Sanger-féle DNS szekvenálás

A nukleinsavak bázissorrendjének meghatározásához történt hozzájárulásukért két tudós, Walter Gilbert és Frederick Sanger 1980-ban kémiai Nobel-díjat kapott. Gilbert kémiai eljáráson alapuló módszere kevésbé terjedt el ugyanakkor a Sanger-féle szekvenálás széleskörű alkalmazást nyert.

A Sanger szekvenálás alapját a minden osztódó sejtben végbemenő DNS replikáció folyamata képezi. A módszer a templátfüggő DNS polimeráz enzimek azon tulajdonságát használja ki, hogy ha a szekvenálandó DNS szálhoz (templát DNS) nagy specifitással egy ismert szekvenciájú, rövid DNS szakasz (primer) kapcsolódik, majd a reakcióelegyben jelenlévő DNS polimeráz enzimek a dNTP-k felhasználásával felépítik a templát DNS szekvenciájával komplementer DNS szálat.

2.1. ábra - Sanger-féle DNS szekvenálás

Sanger-féle DNS szekvenálás

A szekvenálási rekció pontosan szabályozott körülmények között zajlik.

Lépései

1. a templát DNS denaturálása (a kettősszálú DNS szálak elválnak egymástól),

2. a mintához DNS-polimerázt, primert, valamint a DNS négy dezoxi-nukleotid-trifoszfát-alkotórészét (dGTP, dTTP, dATP, dCTP: dNTP) adják,

3. ezt a primer/templát keverékének négy reakcióelegyre történő szétosztása követi,

4. az egyes részmintákhoz valamelyik nukleotid módosított formáját, a didezoxi-nukleotid-trifoszfátot (ddGTP, ddTTP, ddATP, ddCTP: ddNTP) keverik,

A módosított nukleotidok (ddNTP) abban különböznek a DNS-t felépítő nukleotidoktól, hogy nem tartalmaznak hidroxil-csoportot a dezoxiribóz 3-as szénatomján. A módosított nukleotidok közül az egyik izotóppal jelölik.

5. a szekvenálás következő lépésében a DNS polimeráz enzim jelzetlen és jelzett nukleotidokat épít be a szintetizálódó DNS szálba.

Amikor azonban egy izotóppal jelzett nukleotid (pl. [32P]ddGTP) kapcsolódik a lánchoz, a DNS szál további szintézise leáll a reakció elegyekben, mert hiányzik a DNS lánc kiegészítéséhez szükséges szabad 3'-OH végződés. A ddNTP-k mennyiségét úgy választják meg, hogy beépülésük véletlenszerű legyen és gyakoriságuk ritkán következzen be, ugyanakkor az egyfajta ddNTP-t tartalmazó reakcióelegy különböző hosszúságban, az adott dNTP minden előfordulásánál tartalmazzon a szintézist leállító jelzett ddNTP-t. A szintézissel előállított DNS fragmenteket hosszúságuk alapján denaturáló poliakrilamid gél-elektroforézisssel választják szét. A nukleotidok beépülési sorrendjét autoradiográfiával detektálják. A szintetizálódott DNS szekvenciájának leolvasása, figyelembe véve a nukleotidok felvitelének sorrendjét, az 5’ --- 3’ irányban alulról felfelé haladva történik.

A Sanger által kifejlesztett szekvenálást, mint jól bevált és viszonylag olcsó módszert hosszú éveken keresztül alkalmazták világszerte. Hátránya, hogy rendkívül munkaigényes volt, csak 400-500 bázispárnyi szekvencia egyidejű leolvasását tette lehetővé egy reakció során. A reakció detektálásához használt röntgenfilmek előhívása és a szekvencia leolvasása is hosszú ideig tartott. Ezért egyre nagyobb lett az igény a gyorsabb, hatékonyabb, radioaktív izotópokat nélkülöző automatizált módszer kifejlesztése iránt.

Automatizált DNS szekvenálás

A DNS szekvenálás automatizálásában úttörő szerepet vállalt egy kaliforniai munkacsoport (California Institute of Technology), melynek vezetője Lee Hood volt. Alap ötlet az izotóppal jelzett módosított nukleotidokat négy különböző fluoreszcens festékkel jelölték. A szekvenáláshoz így elegendő volt egyetlen reakció elegy, így a Sanger-féle szekvenálás gyorsasága már négyszeresére emelkedett. Ilyen körülmények között a fluoreszcensen jelzett ddNTP-k a szintézis leállítása mellett detektálási feladatokat is elláttak.

A szekvenálás fluoreszcensen jelzett nukleotidokkal gélben vándorló, különböző fluorofórokkal jelzett DNS fragmenteket, folyamatosan gerjesztő lézerfényforrással világítják meg. A négyféle fluoreszcens festék a rá jellemző színt bocsátja ki. Az emittált fényintenzitásokat fénydetektorokkal rögzítik, így minden DNS fragmentről pontosan megállapítható, hogy melyik fluoreszcensen jelzett ddNTP-vel végződik. A számítógéppel rögzített adatok alapján a DNS szekvenciáját a program leolvassa. Az automata DNS szekvenátorokban a DNS fragmentek molekulatömeg szerinti elválasztása poliakrilamid gélen végezték, egy DNS szekvencia leolvasásához elegendő egy gélzsebbe felvinni a szekvencia leolvasásához a mintát. A fluoreszcensen jelzett ddNTP-kről összegyűjtött adatok feldolgozása, a szekvencia betűsorrendjének lefordítása számítógépes programok segítségével történik. Az automatizálás nélkül még a legegyszerűbb genom szekvenálása is hosszú ideig tartott volna. Ennek fő oka, hogy nagy pontossággal csak rövid DNS szakaszok szekvenálhatók a módszerrel (~ 800-1000 bp), ez a méret nagyon távol esik akár egyetlen kromoszóma méretétől is, melyek hossza 50-250 millió bázis között változik. További nehézséget jelentett, hogy a szekvenálást csak az indító szekvencia (primer szekvencia) ismeretében tudták elkezdeni, ami gyakran nem állt rendelkezésre.

Ennek a problémának a kiküszöbölésére a DNS-t általában kisebb, jól kezelhető fragmentekre darabolták, majd ezt követően cirkuláris plazmidokba (hordozó bacteriális cirkuláris DNS) vagy vektorokba klónozták. A vektorok szekvenciájának ismeretében a klónozást követően bármilyen szekvenciájú DNS szakasz szekvenciáját meg lehetett határozni.

A DNS szekvenálás hatékonyságát a polimeráz láncreakció bevonásával (PCR) tovább emelték. Ennek a technikai újításnak különböző formáit fejlesztették ki. A viszonylag lassú gélről történő szekvencia leolvasást felváltották a kapilláris gélelektoforézis módszerével.

A kapilláris gélelektroforézis előnye a hagyományos eljárásokhoz képest, hogy lehetőséget nyújt a gél mátrixok összetételének széles tartományban történő változtatására, nagyszámú minta gyors és pontos analízisére, ami elengedhetetlenül szükséges volt ahhoz, hogy a Humán Genom Projekt belátható időn belül befejeződjön.

Hasznos link:

http://www.genome.gov/19519278

Genom adatbázisok, gének azonosítása

A humán genom projekt óriási adathalmazából egyértelművé vált, hogy a gének száma a korábban becsült 100 000-hez képest alacsonyabb. Jelenlegi becslések alapján mindössze 20 000 - 25 000, ez a szám sem végleges még tovább csökkenhet a jövőben. A funkcionális szereppel bíró, fehérjét kódoló gének azonosítása nem könnyű feladat a humán genomban, még a teljes DNS szekvencia ismeretében sem. A genomnak ugyanis kevesebb, mint 2%-a kódol valamilyen fehérjét, a maradék 98% szabályozó régiókat, géneket elválasztó szakaszokat, ill. a genom több mint felét kitevő ismétlődő szekvenciákat tartalmaz, melyek funkciója még ma nem tisztázott.

Az első kromoszóma (22-es kromoszóma) teljes szekvenciáját 1999-ben közölték, mely 33,4 millió bázispárból épül fel, ez a genom 1,1 százalékát jelenti. Nagyon izgalmas kérdés volt a kromoszómán található gének számának megállapítása. Amennyiben a kezdetben feltételezett 100 000 génszám igaz lenne és a gének egyenletes eloszlását feltételezik a 22-es kromoszómán legalább 1100 génnek kellett volna lenni. Ugyanakkor kiderült, hogy a gének száma ennél lényegesen alacsonyabbnak, mindössze 545-nek adódott. Hasonlóan kisebb a génsűrűség a vártnál a 22-es kromoszómával összemérhető 21-es kromoszómán, meylen mindössze 236 gént azonosítottak. Az az igen nagyszámú variáció, ami az emberi populáció tagjait jellemzi, meglepően kevés gén ellenőrzése alatt áll. Ennek elsődleges oka a gének közti kölcsönhatás, továbbá gén és környezet közötti kölcsönhatásokra vezethető vissza.

A gének azonosításának több módja ismert. Az egyik megközelítés a más fajokban is előforduló, konzervált szekvenciájú gének szekvencia-homológiájának keresésén alapul. A módszer hátránya, hogy fontos humán specifikus gének azonosítatlanul maradhatnak. Egy másik lehetőség a cDNS könyvtárakban történő génkeresés. Ezekhez az adatbázisokhoz a szekvencia adatokat úgy nyerték, hogy a sejtekből vagy szövetekből izolált RNS-t cDNS-re átírták, majd klónozást követően a DNS egy kis, kb. 500 bázispár hosszúságú szakaszát megszekvenálták, ezek a génkifeződési-markerek „expressed sequence tag” (EST) alkalmasak a cDNS azonosítására, de nem feltétlenül tartalmazzák a cDNS-t leíró lokusz genom pozícióját vagy a gén által kódolt fehérje funkcióját. A cDNS könyvtárak segítséget nyújtanak az exon szakaszok pozíciójának meghatározásában, az átírt genom szakaszok (transzkriptumok) szisztematikus megismerésében, potenciálisan új fehérje molekulák kódoló régióinak azonosításában, és mint szekvencia-címkék hozzájárulnak ismeretlen gének felfedezéséhez is. Az EST-k száma idővel olyan méreteket öltött, hogy önálló adatbázisokat kellett létrehozni a kezelésükre és a keresés megkönnyítésére. Ezek általában a nagy adatbázis gyűjtemények részét képezik, mint pl. a GenBank: National Center for Biotechnology USA (NCBI), European Molecular Biology Laboratory (EMBL) által gondozott adatbázisok valamint a Japánban a DNA Data Bank of Japan (DDBJ). Az adatbankok között rendkívül szoros a kapcsolat. Az összegyűjtött szekvenciákat és a hozzájuk tartozó információkat 24 óránként egyeztetik és kicserélik egymás között, így az adatbázis felhasználók ugyanazt az eredményt kapják függetlenül, hogy a három közül melyik adatbázist használták.