Ugrás a tartalomhoz

Népegészségügyi genomika

Ádány Róza (2011)

Debreceni Egyetem

Nukleinsav alapú mikrochipek, mikro-array módszerek

Nukleinsav alapú mikrochipek, mikro-array módszerek

A módszerekről általában

Az 1990-es évek közepéig a gének funkciójának és eltéréseinek tanulmányozása egyedi gének vizsgálatán alapult, mely igen munkaigényes, kis hatékonysággal jellemzhető megközelítés volt. Fontos, nyugodtan mondhatjuk mérföldkőnek tekinthető változás akkor következett be, amikor bevezették a DNSchip (mikrochip, génchip, génlapka) technológiát. A módszerrel lehetővé vált számos, akár több ezer vagy tízezer génfunkciójának szisztematikus analízise, méretük ugyanakkor igen kicsi, valamennyi emberi gén reprezentása elfér egy négyzetcentiméren.

A mikroarray alapú vizsgálatok felhasználási területe igen széles, alkalmazhatók:

- génkifejeződés mértékének meghatározására (mRNS expresszió),

- a génfunkciók szisztematikus analízisére,

- a DNS-ben található kis, akár egyetlen nukleotidot érintő mutációk kimutatására (egyedi nukelotid polimorfizmusok; single nucleotid polymorphism: SNP),

- nagyobb szekvenciákat magába foglaló kópiaszám variációk (copy number variation: CNV) kimutatására

- a normál genomtól eltérő változások (deléciók, amplifikációk, kromoszómák számbeli eltéréseinek, DNS hipermetiláció) felismerésére.

Hogyan készülnek DNS mikrochipek?

A mikrochipek pontosan ismert, számítógéppel rögzitett rendezett elemeket (kis DNA szekvenciák, oligok, cDNS, fehérje stb.) tartalmaznak műanyag, szilikon vagy üveghordozókra rögzítva. Az elemek száma 1000-től több százezerig terjedhet. A mikrochipek elemeinek pontos paraméterei adatbázisokkal vannak összekötve, melyek számos új lehetőséget (pl. a detektált eltérések pontos genom poziciójának meghatározása, a génekről, eltérésekről rendelkezésre allá eddigi ismeretek listája) bíztosítanak az analíziseket követően.

Röviden a DNS mikroarray előállításáról: A DNS kisebb méretű (25-60 bázispár hosszúságú oligo) vagy lényegesen nagyobb hosszúságú (cDNS, BAC klónok) szekvenciáinak mikrochipekre történő felviteléhez számos módszert alkalmaznak. A legelterjedtebb eljárások közé tartozik a fotolitográfia, a mechanikus felcseppentés robot segítségével (ink-jet módszer). A fotolitográfia eljárás, melyet korábban a mikroelektronikában alkalmaztak, bevezetése a mikroarray technológiában Steven Fodor magyar származású kaliforniai kutató nevéhez fűződik (http://www.dnalc.org/view/15919-GeneChip-.html).

A mikrochipek alkalmasak arra, hogy külső környezeti behatások következtében megváltozott gének expressziós profilját, különböző génvariánsokat, gének szerkezeti változásait, ismerjük meg valamint lehetőséget szolgáltatnak összehasonlító génexpressziós vizsgálatokra is.

A génexpressziós vizsgálatok mikrochippel

A DNSchipek segítségével végezhető génexpressziós vizsgálatok sematikus ábrázolását a 3.2. ábra szemlélteti. Első lépésben a mintákból (sejtek vagy szövetek) RNS-t preparálnak. Majd reverz transzkriptáz enzim segítségével cDNS-sé írják át (reverz transzkripció), ezt követően jelzett nuleotidok (dCTP vagy dTTP) jelenlétében a duplaszálú cDNS-t templátul véve in vitro transzkripcióval jelzett-cRNS próbákat készítenek.

ábra

A jelzett cRNS-t hibridizálják a génexpressziós mikrochipre. A hibridizáció hőmérsékletét és idejét pontosan szabályozzák a nem specifikus kötődések elkerülése miatt. A hibiridizáció során a komplementer szekvenciák nagy affinitással kapcsolódnak. A kötődés specifikusságát a hibridizációs hőmérséklet és az alkalmazott kísérleti körülmények határozzák meg. A gyengén vagy a nem kötődött fluoreszcensen jelzett molekulákat egy mosási lépésben eltávolítják. A hibridizáció eredményének leolvasása nagyfelbontású lézer-szkenner alkalmazásával történik, a detektorokkal az egyes pontok fluoreszcencia intenzitásának mértékét határozzák meg, amit speciális szoftverek segítségével értékelnek ki. A fluoreszcencia intenzitás mértéke arányos, a fluoreszcensen jelzett molekulák számával, a génexpresszió mértékével.

A microarray technológia érzékeny és igen nagyhatékonyságú megközelítést jelent, gének és géntermékek ezreinek egyidejű elemzését teszi lehetővé. A módszer alkalmazásával lehetővé válik többek között teljes genomok expressziós mintázatának összehasonlítása, a genetikai betegségek kialakulásában szerepet játszó mutációk meghatározása, komplex betegségek hajlamosító géncsoportjainak azonosítása, daganatos betegségek molekuláris szintű klasszifikációja, sejtek különböző génkifejeződési állapotainak összehasonlítása, egyes mikrobiális fertőzések fertőző ágenseinek kimutatása. A génkifejeződési profilok elemzése elősegítheti a betegségek korai diagnózisát, segítséget nyújthat a progresszió megjóslásában és hozzájárulhat a terápia pontosabb kiválasztásához.

Néhány alkalmazási lehetőség

1. népegészségügyi alkalmazás

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2448433/pdf/CFG-03-362.pdf

2. daganatok genetikai diagnózisa

http://www.nature.com/scitable/topicpage/genetic-diagnosis-dna-microarrays-and-cancer-1017