Ugrás a tartalomhoz

Népegészségügyi genomika

Ádány Róza (2011)

Debreceni Egyetem

Fluoreszcencia in situ hibridizáció

Fluoreszcencia in situ hibridizáció

Az in situ hibridizáció módszertani fejlődése több mint negyedszázada kezdődött el. Pardue és Gall (1969) voltak az elsők, akiknek sikerült radioaktív izotóppal jelzett DNS próba hibridizációját kimutatni citológiai preparátumokon. A radioaktív izotópokkal történő DNS-hibridizáció érzékenysége elég nagy, akár egyetlen kópiában előforduló gén(ek) kimutatására is alkalmas, azonban ennek az eljárásnak érzékenysége mellett számos hátránya van. Az izotópos módszer kivitelezése nemcsak veszélyes, hanem komplikált és lassú (a hibridizációs szignál megjelenítéséhez szükséges autoradiográfia expozíciós ideje több hetet is igénybe vehet), továbbá a radioaktív detektálási módszer térbeli feloldóképessége gyenge, egyidejűleg csak 1 szekvencia eltéréseit figyelhetjük meg. Az említett hátrányok ösztönözték a kutatókat a nem izópos jelzési eljáráson alapuló detektálási módszerek kifejlesztésére. Dan Pinkel és Joe Gray 1988-ban vezette be a fluoreszcens jelzésen alapuló eljárást, amire jellemző, hogy kevésbé komplikált, nem veszélyes, gyors és ma már akár mind a 24 kromoszóma számbeli és strukturális eltérése kimutatható egyetlen kísérlet során. Kezdetben a DNS- próbákat (DNS-szondákat) biotinnal jelzett nukleotidokkal konjugálták és a hibridizált DNS-próbákat fluoreszcens festékkel (fluoreszcein-izotiocianát: zöld fluoreszcencia, rhodamin-izotiocianát: piros fluoreszcencia) jelzett avidinnal vizualizálták. Ezt követően a fluoreszcens detektálási eljárások számos újabb lehetőséggel bővültek és szinte naponta jelennek meg a FISH érzékenységét növelő újabb és újabb jelzési metodikák. A FISH-sel a diagnosztikus és prognosztikus jelentőséggel bíró genetikai rendellenességek rövid idő alatt (1-24 óra) kimutathatók, függetlenül a tumorsejtek proliferációs hajlamától, mivel az eljárás interfázisban lévő sejteken is megvalósítható. A géntechnológia kialakulása és rohamos fejlődése a FISH alkalmazásának robbanásszerű elterjedését eredményezte. Napjainkban ez a molekuláris genetikai módszer az alapkutatás mellett egyes klinikai laboratóriumokban, már Magyarországon is a rutindiagnosztika részévé vált. Kariotípus analízis során a kromoszómák számbeli és strukturális eltéréseinek kimutatására, a genetikai betegségek terápiát követő monitorozására, sugárkárosodás által indukált kromoszómális eltérések gyors kimutatására, génamplifikációk és géndeléciók detektálására egyaránt alkalmazzák. Jelentős szerepe van a géntérképezésben, a géntranszkripció és expresszió, valamint a kromatin organizációjának és struktúrájának tanulmányozásában is.

A daganatok citogenetikai diagnosztikájában a fluoreszcencia in situ hibridizáció (FISH) alkalmazása kimutatása egyre nagyobb jelentőségre tesz szert. A FISH módszerrel minden olyan sejt vagy szövet tanulmányozható, melyben a DNS degradáció nem indult el. Jelenleg a legegyszerűbb és leggyorsabb molekuláris detektálási eljárás a nagy méretű genetikai eltérések kimutatására.

Az in situ hibridizáció módszertani fejlődése több mint negyedszázada kezdődött el. Pardueés Gall (1969) voltak az elsők, akiknek sikerült radioaktív izotóppal jelzett DNS próba hibridizációját kimutatni citológiai preparátumokon. Dan Pinkel és Joe Gray 1988-ban vezette be a fluoreszcens jelzésen alapuló eljárást, amire jellemző, hogy kevésbé komplikált, nem veszélyes, gyors és ma már akár mind a 24kromoszóma számbeli és strukturális eltérése kimutatható egyetlen kísérlet során. Kezdetben a DNS- próbákat (DNS-szondákat) biotinnal jelzett nukleotidokkal konjugálták és a hibridizált DNS-próbákat fluoreszcens festékkel (fluoreszcein-izotiocianát: zöld fluoreszcencia, rhodamin-izotiocianát: pirosfluoreszcencia) jelzett avidinnal vizualizálták. Ezt követően a fluoreszcens detektálási eljárások számos újabb lehetőséggel bővültek és szinte naponta jelennek meg a FISH érzékenységét növelő újabb és újabb jelzési metodikák. A FISH-sel a diagnosztikus és prognosztikus jelentőséggel bíró genetikai rendellenességek rövid idő alatt (1-24 óra) kimutathatók, függetlenül a tumorsejtek proliferációs hajlamától, mivel az eljárás interfázisban lévő sejteken is megvalósítható.

A géntechnológia kialakulása és rohamos fejlődése a FISH alkalmazásának robbanásszerű elterjedését eredményezte. Napjainkban ez a molekuláris genetikai módszer az alapkutatás mellett egyes klinikai laboratóriumokban, már Magyarországon is a rutindiagnosztika részévé vált. Kariotípus analízis során a kromoszómák számbeli és strukturális eltéréseinek kimutatására, a genetikai betegségek terápiát követő monitorozására, sugárkárosodás által indukált kromoszómális eltérések gyors kimutatására, génamplifikációk és géndeléciók detektálására egyaránt alkalmazzák. Jelentős szerepe van a géntérképezésben, a géntranszkripció és expresszió, valamint a kromatin organizációjának és struktúrájának tanulmányozásában is.