Ugrás a tartalomhoz

Sejtbiológia

Balázs Margit (2011)

Debreceni Egyetem

1. fejezet - A sejtműködés alapvető molekuláris mechanizmusai

1. fejezet - A sejtműködés alapvető molekuláris mechanizmusai

A sejt legfontosabb anyagi összetevői és alapvető molekuláris mechanizmusai

A fehérjék

A sejtek életműködéseiben a legalapvetőbb szerepet a fehérjék töltik be, mint strukturális feladatokat ellátó molekulák (struktúrfehérjék) vagy mint folyamatok katalizálását végző enzimek. Térszerkezetük kialakulása elsősorban az aminosavszekvencia által meghatározott (elsődleges szerkezet). Az egydimenziós aminosavlánc, szekvenciájának megfelelően kialakuló hidrogénhidak révén vagy helikális (ún. alfa-helikális), vagy ún. redőzött (merev, lemezszerű elemekből hajtogatott, „pleated sheat”) másodlagos szerkezeti szintet alkot. Az alfa helikális vagy redőzött másodlagos konformációt felvett elemek együtt hozzák létre a fehérje ún. harmadlagos struktúráját.

1.1. ábra - A DNS-t adott szekvenciánál hasító enzim harmadlagos szerkezete

A DNS-t adott szekvenciánál hasító enzim harmadlagos szerkezete

Több ilyen alegység (független polipeptidlánc) kapcsolódása révén negyedleges szerkezet jöhet létre, melynek egy példája az idegen anyagokat (antigéneket) felismerő antitest (immunglobulin). Az utóbbi könnyű és nehéz lánca végei által képzett felismerő hely rendkívül sokféle lehet, az antitest képződését kiváltó testidegen molekuláknak („antigéneknek”) megfelelően.

1.2. ábra - Antitest (ellenanyag) negyedleges szerkezete

Antitest (ellenanyag) negyedleges szerkezete

Az enzimatikus működésű fehérjék az általuk átalakítandó anyagcseretermékeket (szubsztrátokat) aktív centrumukban megkötik, és a reakciót azáltal katalizálják, hogy azt új útra terelve annak végbemeneteléhez szükséges aktivációs energiahegyet lecsökkentik. Ezáltal már a környezet termikus energiája is elég ahhoz, hogy a – reaktánsok számára energetikailag kedvező, mélyebb energiaszintet eredményező – reakció végbe is menjen. Egy enzimnek egy másik fehérje is lehet szubsztrátja, pl. foszforilálhat egy másik fehérjét (mint szubsztrátját). Az enzimműködést befolyásolhatják kisebb szabályozó anyagok is, melyek a fehérje egy másik részén, az ún. allosztérikus kötőhelyen megkötődve modulálják az enzim konformációs állapotát. Az enzimek összjátéka határozza meg, hogy a sejtekben milyen egyéb molekulák (lipidek, szénhidrátok, nukleinsavak (DNS, RNS-ek) szintetizálódnak. Hogyan rendeződnek a molekulák magasabb rendű struktúrákká (pl. membránok: intracelluláris membrán rendszerek, ill. plazmamembrán; a sejtváz, citoszkeleton hálózatos aktin, stb. struktúrái) és az ezek által alkotott félig zárt (szemipermeábilis) térrészek, kompartmentek milyen koncentráció különbségeket tartanak fenn a különböző (pl. kis-) molekulákra, ionokra, vízre nézve.

1.3. ábra - A sejt molekuláris összetétele: szénhidrátok, lipidek, kismolekulák

A sejt molekuláris összetétele: szénhidrátok, lipidek, kismolekulák

A membránokat alkotó lipid kettősrétegek a sejtorganellumok (sejtmag, mitokondrium, endoplazmás retikulum, lizoszómák, Golgi apparátus, stb.) felépítésében is döntő szerepet játszanak.

1.4. ábra - Sejtorganellumok

Sejtorganellumok

A sejteket felépítő szerkezeti (strukturális) fehérjék és a kémiai (szintetikus, lebontó (degradációs) és különböző átalakító, módosító (pl. foszforilációs) változásokat katalizáló enzimek határozzák meg a fenotípust, azt, hogy egy adott genetikai állomány (DNS szekvencia) mely része kerül kifejeződésre és ezáltal milyen sejtek keletkeznek.

1.5. ábra - A Golgi apparátus membránlemezekből felépülő szerkezete

A Golgi apparátus membránlemezekből felépülő szerkezete

1.6. ábra - Különböző sejtfajták

Különböző sejtfajták

A sejtek energiaforgalmának kulcsszereplője: az ATP

Az állati (heterotróf) sejtek életműködéseik energiaigényét táplálkozásuk során felvett szerves anyagok, elsősorban glükóz elégetéséből nyerik. Ez a folyamat sok, enzimek katalizálta lépésben a mitokondriumok belsejében megy végbe, mely lépések során adenozin-trifoszfát (ATP) keletkezik. Az ATP végállású foszfátcsoportjának lehasadása az anyagcsere-folyamatok energiaigényével összemérhető energiát mobilizál, ezért az ATP-t a sejt univerzális energiahordozóként használja. A cukor elégetése növényi sejtekben is hasonló módon és céllal megy végbe, a növényeknek azonban nincs szükségük glukóz felvételére a külvilágból, hiszen fotoszintézis révén maguk szintetizálják a nap fényenergiáját felhasználva, CO2-ból és vízből (autotrófok).

DNS - mRNS (transzkripció), mRNS - fehérje (transzláció)

A DNS-ben rejlő információ kifejeződése, expressziója úgy történik, hogy először a kifejeződő szakasz (pl. egy fehérjét kódoló gén) bázissorrendjével komplementer RNS-molekula szintetizálódik RNS-polimeráz enzim(ek) által – ezt a folyamatot nevezzük átírásnak, transzkripciónak.

1.7. ábra - A génkifejeződés első lépése: transzkripció

A génkifejeződés első lépése: transzkripció

Ez az elsődleges (naszcens) RNS molekula bizonyos, a fenti ábrán vázlatosan demonstrált átalakítás (érés, processzálás) után már mint messenger RNS (mRNS, küldönc RNS) a magból a citoplazmába transzportálódik, ahol a riboszómákhoz kapcsolódik. A riboszómák, hatalmas, fehérjékből és rRNS- (a riboszómák struktúrájához tartozó, riboszomális RNS) molekulákból álló enzim komplexek, melyek a mRNS-molekulák bázissorrendje alapján fehérjét szintetizálnak.

1.8. ábra - A génkifejeződés fő lépései

A génkifejeződés fő lépései

Ez úgy történik, hogy minden egymást követő bázishármasnak (kodon) egy-egy aminosav felel meg. Pl. az UCG (az RNS-ben uridin helyettesíti a DNS timinbázisát) a szerin nevű aminosavnak felel meg. A megfeleltetést az egyes aminosavak és bázishármasok között az biztosítja, hogy ugyanazon enzim hordozza a megfelelő aminosavat és azt a transzfer-RNS-t (tRNS), mely megfelelő bázishármassal komplementer bázisokat (antikodon) tartalmaz. Így a tRNS a megfelelő mRNS-bázishármashoz vezeti ezt az enzimet. Ezáltal minden mRNS-bázishármashoz, az enzim közbeiktatásával, egy adott aminosav kapcsolódik. Az aminosavakból, peptidkötések révén, polipeptidlánc keletkezik. Az utóbbi aminosavszekvenciája tükrözi tehát az mRNS, ill. a DNS bázissorrendjét. Az egész élővilágra kiterjedő, univerzális, bázishármas – aminosav megfeleltetés a „genetikai kód” .

1.9. ábra - Transzláció

Transzláció

A naszcens RNS mRNS-sé érése, a fehérjék posztranszlációs módosításai és célba juttatása

A szintetizálódott RNS további átalakulásokon megy keresztül. Elsőnek felépült 5’ végét biokémiai folyamatok módosítják (5’ cap), 3’ végéhez sok azonos A-ból poli-A farok szintetizálódik. Mivel a gének kódoló (exon) és ezeket elválasztó nem kódoló (intron) szakaszokból épülnek fel, a nem kódoló (de átírt) RNS szekvenciák utólag kivágódnak, enzimatikusan kicsípődnek (splicing) az átírt „naszcens” RNS-molekulákból. Ezt a funkciót proteinkomplexek („splicesomes”) látják el, melyek alegységei kis, a nukleoplazmában szétszórtan kimutatható RNS–protein komplexek („snRNP”-k) formájába mutathatók ki. Lehetőség van egy gén különböző exonjainak alternatív felhasználására is (alternatív splicing). Ennek révén egy gén többféle fehérjét is kódolhat. A jelenlévő mRNS koncentráció részben a termelődéséhez vezető lépések sebesség meghatározó mozzanatától, részben lebomlása szabályozott ütemétől függ.

A fehérjék poszttranszlációs módosításai és célba juttatása

Az újonnan szintetizált fehérjék a szekvenciájukat képező – később enzimatikusan kivágott vagy a célba juttatott fehérje által is hordozott – elemek és az ezekkel kapcsolatba lépő célzó mechanizmusok kölcsönhatása révén kerülnek felhasználásuk helyére („targeting”). Jelenlévő mennyiségüket termelődésük és szabályozott lebomlásuk egyensúlya állítja be, enzimatikus működésüket posztszintetikus modifikációk és más fehérjékkel való változatos kölcsönhatások, oligomerizációs viszonylatok (ld. aktin polimerizáció) befolyásolják. A posztszintetikus modifikációk között igen jelentős a foszforiláció: az ún. kináz enzimek negatív töltésű foszfátcsoport kovalens felkötődését katalizálják egy másik fehérjére, mely abban jelentős konformáció változást idéz elő. Ez a változás azonban reverzibilis, mert egy megfelelő foszfatáz enzim a foszfátcsoport lehasadásának kedvező reakcióutat nyithat. Egy másik jelentős posztszintetikus reakció az ubikvitináció, melynek során egy proteinbontó enzimek (proteázok) általi degradációra szánt fehérje egy kis méretű fehérjével, az ubikvitinnal konjugálódik bonyolult enzimapparátus által. Az így módosított fehérjék (szintén fehérjékből felépülő) nagyméretű, hordószerű struktúrákban, a proteaszómákban bomlanak le, a citoplazmában és a magban.

A génexpresszió szabályozása, a DNS szerkezete

A génexpresszió elsősorban az átírás szintjén szabályozódik, és egyrészt az aktuális anyagcsere státusznak és külső körülményeknek megfelelő pillanatnyi alkalmazkodást, másrészt komplex sejtállapot-módosulásokat tesz lehetővé. Az utóbbira akkor van szükség, amikor a sejt szöveti sajátosságai változnak, egy adott szövetféleségre jellemző génexpressziós mintázat alakul ki. Ez megtörténhet in vitro („üvegben”, vagyis kísérleti körülmények között) és in vivo (az élőben); általában ezeket a komplex folyamatokat differenciációnak nevezzük. A sejt in vivo differenciálódik az egyedfejlődés (a kifejlett élőlény sokféle szövetének egyetlen megtermékenyített petesejtből való kialakulása; ontogenezis) során vagy a kifejlett élőlényben zajló regenerációs és szöveti differenciációs működések kapcsán. A kialakult komplex funkciók sejtgenerációról-generációra való megőrzését a génexpressziós mintázat propagálódása (a bázissorend „fölött” lévő ún. epigenetikus mintázat öröklődése) biztosítja.

1.10. ábra - DNS és epigenetikus szabályozás

DNS és epigenetikus szabályozás

Az epigenetikus mintázat DNS-hez kötött fehérjéket, azok poszttranszlációs modifikációit ill. magának a DNS-nek kovalens módosítását (metiláció) foglalja magába. Az eukarióta gének RNS-be való átírása ti. a génnel összefüggő DNS-területen elhelyezkedő szekvencia-elemektől, ill. ezekhez kapcsolódó fehérjéktől, valamint a kizárólag az érintett génszakaszhoz kapcsolódó fehérjefaktoroktól függ. (Kisméretű, duplaszálú RNS-ek génexpresszió-szabályozásban betöltött szerepéről is egyre több adat lát napvilágot. Ezen újfajta szabályozás mechanizmusáról azonban még nincsenek kikristályosodott ismereteink.) A DNS szabályozó jelentőségő szekvencia elemei közé tartozik a promóter, amely a gén mRNS-t kódoló szakaszától 5’ irányban helyezkedik el, kb. 100-200 bp hosszú, és DNS-kötő fehérjék számára biztosít kötőhelyet. A promóter vezérli a transzkripciót (az mRNS átírását) az mRNS-t szintetizáló RNS-polimeráz enzim kötődése és elindulása feltételeinek biztosításával. A legtöbb promóterben előforduló promóterelem az ún. TATA box. Ez egy T-A-T-A nukleotidsorrendu szakasz, ami 35 bp-nyira (–35) helyezkedik el a transzkripció starthelyétől (+1). Ehhez kötődik a TATA-kötő fehérje (TBP), amelyhez további általános transzkripciós faktorok [pl. a TFIID komplex = TBP + TAF-ok (TBP Associated Factors)] kapcsolódnak. Ezek együttesen biztosítják az RNS-polimeráz működését és a transzkripció elindulását (6. ábra). (Az általános transzkripciós faktorok az RNS-polimerázzal együtt (ami maga is több fehérjéből áll) alkotják az ún. alaptranszkripciós apparátust.) A génexprésszió szabályozásának további fontos elemei az ún. enhanszerek. Ezek a gén kódoló szakaszától akár 5’, akár 3’ irányban elhelyezkedhetnek és transzkripciós faktorok kötőhelyeiből, az ún. válaszadó elemekből állnak. Az enhanszerek általában 10-50 bp hosszúságúak és mindkét orientációban működőképesek. Igen távol, akár több ezer bázispárnyira is lehetnek a befolyásolt géntől. Az enhanszerekhez kapcsolódó transzkripciós faktorok többnyire pozitív irányban befolyásolják a promóter működését. A specifikus transzkripciós faktorok DNS-kötő doménjükön kívül rendelkeznek egy aktiváló és/vagy gátló doménnel is. Mivel ezek a fehérjék általában nem lépnek direkt kapcsolatba a promóterhez kapcsolódó fehérjékkel, közvetítő fehérjékre van szükség a működésükhöz. Ezeket kofaktoroknak nevezzük: koaktivatoroknak vagy korepresszoroknak, attól függően, hogy aktiváló vagy gátló szerepet töltenek be. Ezeknek a komplexeknek többféle enzimatikus aktivitásuk is van, így pl. hiszton-acetiláz, deacetiláz, metiláz, demetiláz, stb.

DNS-replikáció

A sejt osztódása során a DNS úgy replikálódik (10. ábra), hogy a széttekeredő láncokhoz azokkal komplementer új DNS-szál szintetizálódik. Ezt a mechanizmust szemikonzervatív replikációnak nevezzük, mert az új dupla-hélix egyik szála korábbi DNS-molekulából származik (öregebb, mint a másik szál). A DNS két szála részben eltérő biokémiai mechanizmussal szintetizálódik. Az ún. vezető lánc (leading-strand) folyamatosan szintetizálódik, ahogy tekeredik szét az anya-DNS. A másik láncon folyó szintézis szakaszos, ti. ellenkező irányban zajlik (ún. lagging-strand, késlekedő szál), és rövid RNS-láncok (primerek) beépítése előzi meg magát a DNS-szintézist. Utólag az RNS-láncok lebomlanak, DNS-szakaszok (Okasaki-fragmentumok) összekötődésével (enzimatikus ligációjával) helyreáll a DNS folytonossága.

1.11. ábra - DNS replikáció

DNS replikáció

DNS-repair

A Darwin által sokrétűen és maradandó hitelességgel bizonyított evolúciós alaptörvény, a változékonyság pozitív szelekció elve sejtpopulációk viselkedését is vezérli, in vitro és in vivo egyaránt. A sejt genetikai stabilitása pontosan szabályozott, egyrészt a DNS-szintetizáló enzimapparátusok hibaszázaléka szintjén, másrészt a statisztikailag előforduló beépülési hibákat és a környezeti hatások (sugárzás, reaktív oxigéngyökök) által előidézett bázissorrend-változásokat, mutációkat kijavító mechanizmusok révén. A sejt hatékony mechanizmusokkal rendelkezik mindenféle DNS- szerkezet-módosulás kijavítására (repair). Folytonossághiányok, egy vagy mindkét szálon bekövetkezők, perceken belül a reparációban részt vevő fehérjék helyszínre vándorlását, odakötődését váltják ki. E fehérjék egy része in vitro is szabadvég-kötő tulajdonságú, másoknak, pl. a nukleázoknak enzimatikus (DNS-hasító) aktivitásuk van, egyes fehérjék más résztvevőket foszforilálni képesek. A soklépéses folyamatot fehérje–fehérje kapcsolatok integrálják.

Általános szabályozási alapelvek

Az anyagcsere-folyamatok, ill. a differenciáció szabályozásának egyik fontos alapelve a visszacsatolás (feed-back). Ennek főleg negatív visszacsatolásként ismert változata gyakori, pl. amikor egy keletkezett termék gátolja az őt létrehozó folyamatot. A pozitív visszacsatolás öngerjesztő mechanizmusként fogható fel, mely a rendszert kétféle (nyugvó és stimulált) állapotban rögzítheti.  Az enzimatikus reakciók sorbakapcsolásuk révén kaszkádfolyamatokká rendeződhetnek, melyek során egy-egy enzim továbbiak sokaságát aktiválva robbanásszerű változásokat hozhat létre a végső szubsztrát szintjén. Gyakori szabályozási megoldás a trigger-elv: egy folyamatsor mintegy ugrásra készen várja azt a stimulust, mely, mint a ravasz meghúzása a golyó kirepülését (melynek gyorsasága nem függ a ravasz meghúzásának erejétől), idézi elő a reakciólánc beindulását.

A sejtbiológia molekuláris biológiai eszköztára

A molekuláris biológia és módszereinek gyors fejlődése nagy hatással volt és van a sejtbiológiára. Az alábbiakban röviden ismertetünk néhány molekuláris biológiai módszert, mely döntően járult hozzá a sejtek működésének megismeréséhez.

A nukleinsavak kémiai természetéből adódó tulajdonsága, hogy a komplementaritás elve alapján párosíthatóak: hibridizálnak (az ábrákon jól látható a DNS ezen ún. reasszociációs viselkedése). Ezt jó néhány technika kihasználja. A Southern hibridizáció esetén agarózgélen méretük szerint elválasztott DNS-molekulákat szilárd hordozóra transzferálják (lényegében átitatják), azon rögzítik, és radioaktívan jelölt szondával (angolul: probe, magyarul sokszor próbának fordítják) hibridizáltatják (DNS-DNS hibridizáció). A Northern hibridizáció a Southernhez hasonló, de RNS-molekulák szétválasztásán és DNS-szondával való jelölésén alapszik. Segítségével meghatározható például egy adott gén mRNS-szintje különböző sejtekben és szövetekben. Ma már rutin eljárásoknak tekinthetők a szintén hibridizáción alapuló miniatürizált ún. chip-technikák. Ilyen a DNS-mikroarray, melynek során rengeteg, különböző gént jellemző DNS-molekula kerül felvitelre egy kicsiny tárgylemezre, és ehhez hibridizálják egy adott sejt teljes RNS-készletének megfelelően jelölt DNS másolatát (komplementer DNS, cDNS). Ezáltal egyetlen kísérletben sokezer gén expressziós szintje határozható meg.

A fehérjék esetében a primer szekvencián alapuló hibridizációra nincs lehetőség. Ezzel szemben jól kihasználhatók a specifikus antigén–antitest kölcsönhatások fehérjék kimutatására és jelölésére. Fehérjék kimutatására alkalmas az ún. Western blot technika: ennek során sejtekből, szövetekből nyert fehérjéket választunk el méret szerint gélelektroforézissel. Szilárd hordozó membránra transzferáljuk (itatjuk át, blottoljuk) a szétválasztott fehérjéket és egy adott fehérje ellen termeltetett specifikus antitesttel kimutatjuk. Ez általában úgy történik, hogy az antitesthez egy enzimet rögzítenek és az enzim által katalizált színreakció jeleníti meg a fehérjét. Ezzel a módszerrel adott fehérje jelenléte és szintje határozható meg sejt- vagy szövetkivonatokban. A sejtbiológusok számára azonban ennél általában fontosabb egy fehérje sejten belüli (intracelluláris) elhelyezkedésének meghatározása. Erre is jól használható az immunhisztokémia. Ekkor szintén egy adott fehérjére specifikus antitestet használunk, de ebben az esetben izolált sejteken vagy szöveti metszeteken vizsgáljuk az adott fehérje elhelyezkedését. Az antitesteket gyakran fluoreszcens anyagokkal jelölik és megjelenítésükhöz fluoreszcens mikroszkópiát használnak. Ez a módszer kiválóan alkalmas fehérjék sejten, illetve szöveten belüli elhelyezkedésének vizsgálatára. Fehérjemolekulák kölcsönhatásait, adott fehérjékhez kapcsolódó fehérjéket lehet kimutatni a szintén antitestek használatán alapuló immunprecipitációs technikával. Ebben az esetben általában sejtkivonatokból csapjuk ki és gyűjtjük össze az antitestekkel kapcsolódni képes fehérjéket. Ezek minősége és mennyisége további vizsgálatokkal (pl. Western blottal) meghatározható. A módszer kiválóan alkalmas fehérjék partnereinek tisztítására, illetve fehérjekomplexek tanulmányozására.

Legtöbb esetben arra is kíváncsiak vagyunk, hogy élő sejtekben egy adott fehérje hol található és hogyan mozog, transzportálódik vagy asszociálódik más fehérjékkel, molekulákkal; ilyen kérdések vizsgálatára a sejtbe génbevitel (transzfekció) révén bejuttatott, mesterségesen előállított olyan DNS szekvenciát alkalmazunk, mely a vizsgálni kívánt fehérjét egy magától fluoreszkáló fehérjéhez fuzionálva, kiméra fehérjeként fejezi ki. A transzfekciós eljárások arra is alkalmasak, hogy egyes géneket (megfelelő, kisméretű RNS darabok alkalmazásával) elhallgattassunk és így megvizsgáljuk, hogy kifejeződésük hiányának milyen következményei vannak.