Ugrás a tartalomhoz

Élelmiszer-kémia

Csapó János – Csapóné Kiss Zsuzsanna

Mezőgazda Kiadó

11.5. Néhány mérgező anyag kimutatása és meghatározása

11.5. Néhány mérgező anyag kimutatása és meghatározása

A mérgező anyagok olyan sokfélék és olyan változatos kémiai szerkezetűek, hogy analízisük nem köthető valamilyen vegyületek nagyobb csoportját átfogó analitikai módszerhez. A 11.5. fejezetben a ciántartalom és az olajos magvak kéntartalmú glikozinolát-tartalmának meghatározásáról, a szója tripszininhibitor-aktivitásának méréséről, a mikotoxinok és az F2-toxin analíziséről, a peszticidek kimutatásáról és meghatározásáról, valamint a mérgező fémnyomok elemzéséről közlünk rövid leírást.

11.5.1. A ciánhidrogén-tartalom meghatározása

Szeszesitalok ciánhidrogén-tartalmát a ciánhidrogén ammónium-hidroxiddal való felszabadítása után argentometriás titrálással határozzuk meg. A végpont meghatározására para-dimetilamino-benzilidén-rodanidot használunk. Színes italok esetén az alkoholtartalom meghatározásakor szokásos desztillációt végzünk, amelynek során a ciánhidrogén az alkoholos fázisba kerül. A vizsgálandó mintából vagy párlatból 50–50 cm3-t pipettázunk egy-egy 200 cm3-es jódszám lombikba, etil-alkoholos ammónium-hidroxidot és indikátoroldatot adunk hozzá, majd 10 percig állni hagyjuk. Ezt követően a lombikok tartalmát a világossárga színtől a hagymaszín eléréséig ezüst-nitrát-oldattal titráljuk. A ciánhidrogén-tartalmat a titrálásra, illetve a vakpróbára fogyott ezüst-nitrát-oldat térfogatából számítjuk.

11.5.2. Olajos magvak kéntartalmú glükozinolát-tartalmának meghatározása

Az olajos magvak tioglikozidjainak enzimes hidrolízisét követően vízgőz-desztillációval eltávolítjuk az izotiocianátokat (ITC), majd ammóniás közegben tiokarbamid-származékká alakítjuk azokat. A keletkezett vegyületeket ezüst-nitráttal reagáltatjuk, az ezüst-nitrát feleslegét pedig ammónium-rodaniddal titráljuk vissza. Az izotiocianát-tartalmat az ezüst-nitrát-oldat fogyásából számítjuk.

Az 5-vinil-2-tio-oxazolidonok (VTO) mennyiségét a vízgőz-desztillációs maradék dietil-éteres extraktjának 220–270 nm hullámhosszon végzett ultraibolya abszorbciójából határozzuk meg. A vegyület 248 nm hullámhosszon adja abszorpciós maximumát.

A vizsgálat során kb. 20 g 1 mm-nél kisebb szemcsenagyságúra őrölt mintát n-hexánnal vagy petroléterrel extrahálunk, ezután az oldószergőzöktől mentesített és 0,4 mm-es lyukátmérőjű szitán átszitált őrleményből 2,5 g-t 103±2 °C-on, szárítószekrényben megszárítunk, majd 2 g-ot egy 500 cm3-es Erlenmeyer-lombikba mérünk. Citrátpuffer és speciális enzimoldat segítségével elvégezzük az izotiocianát hidrolízisét, majd desztillációt követően a feleslegben adott ezüst-nitrátot ammónium-rodanid-oldattal tartós rózsaszín színig titráljuk. Mivel a repcében az ITC-vegyületek közül a 3-butenil-izotiocianát a fő alkotó, ezért az eredményeket ebben fejezzük ki.

Az ITC-tartalmat gázkromatográfiásan is meghatározhatjuk, amelynek során az enzimes feltárással szabaddá vált izotiocianátokat diklór-metánnal extrahájuk, majd ezt követően ebből a fázisból fecskendezünk az optimális koncentráció elérése miatt 10–100 µl-t a gázkromatográf töltetes oszlopára. A rutinszerűen alkalmazott meghatározásnál az izotiocianát csúcsok az alábbi sorrendben jelennek meg: allil-, butil-, 3-butenil-, 4-pentenil-izotiocianát.

Az 5-vinil-2-tio-oxazolidonok (VTO) mennyiségét a desztillálási maradékból határozzuk meg, amelynek során a VTO-tartalmat dietil-éterrel négyszer extraháljuk, majd az összegyűjtött dietil-éteres fázisoknak 248 nm hullámhossznál meghatározzuk az abszorbcióját a vak értékkel szemben. A mennyiségi meghatározáshoz elkészítjük a VTO-kalibrációs görbét, és a VTO mennyiségét µg/g-ban adjuk meg.

11.5.3. A szója és a szójatermékek tripszininhibitor-aktivitásának meghatározása

A módszer alkalmas a szója és a szójatermékek tripszininhibitor-aktivitásának meghatározására. A tripszin enzim a N-α-benzoil-DL-arginin-p-nitroanilid-hidroklorid (DL-BAPA) mesterséges szubsztrátból sárga színű p-nitro-anilin terméket hasít le. Tripszininhibitor jelenlétében kevesebb sárga színű vegyület keletkezik, így az enzimgátlás mértéke fotometriásan nyomon követhető. A tripszininhibitor az antinutritív növekedésgátló vagy lassító, a táplálék értékesülését rontó anyagok közé tartozik. A proteázgátlás és ezen belül a tripszingátlás a növényvilágban igen elterjedt. A mintegy tízféle ismert proteázgátlás közül a tripszingátlás a leglényegesebb. Ennek lényege, hogy a tripszin nem tudja a bázikus aminosavaknál a fehérjét támadni, mivel az inhibitor a tripszinhez sztöchiometrikusan kötődik. Hatására a hasnyálmirigy hiperszekréciója indul meg, reverzíbilis pankreász-hipertrófia alakul ki a kéntartalmú aminosavak hozzáférhetőségének romlása miatt, fokozódik az endogénnitrogén-veszteség, latens metionin- és cisztinhiány lép fel. Fentiek miatt rendkívül fontos ismerni a szója és szójatermékek tripszininhibitor-aktivitását.

A vizsgálati eljárás során a zsíros mintát hideg eljárással zsírtalanítjuk, miközben zsírtartalmát is meghatározzuk. A liszt finomságúra őrölt, zsírtalanított mintából 2 g-ot analitikai mérlegen főzőpohárba mérünk, majd 70–80 cm3 desztillált vízben szuszpendálunk. A szuszpenzió pH-ját 1 mólos nátrium-hidroxiddal 9,5–9,8 közé állítjuk be, ezután 100 cm3-re kiegészítjük desztillált vízzel, majd az így kapott oldatot három órán keresztül mágneses keverőn kevertetjük. Az előkészített szuszpenzióból, attól függően, hogy kezeletlen vagy kezelt szójáról van-e szó, különböző térfogatú bemérésekkel hígítási sorozatot készítünk. A hígítási sorozat tagjaiból azt az oldatot választjuk a tripszininhibitor aktivitásának meghatározására, amelynek abszorbanciaértéke a szójamintát nem tartalmazó oldat abszorbanciaértékének 40–60%-át adja. Az optimális hígítású oldatból száraz kémcsövekbe hígítási sorozatot készítünk 0,6; 1,0; 1,4 és 1,8 cm3-es bemérésekkel, majd a sorozat minden tagját desztillált vízzel 2 cm3-re egészítjük ki. Mindegyikhez hozzáadunk 2-2 cm3 tripszinoldatot, és öt percig 37 °C-on termosztáljuk. Ezt követően 5 cm3 DL-BAPA oldatot adunk hozzá, összerázzuk, 10 percig 37 °C-on termosztáljuk, majd 1 cm3 30%-os ecetsavat hozzáadva a reakciókat leállítjuk. A mintákat ezután száraz kémcsövekbe szűrjük, majd 30 perc múlva 410 nm-en mérjük az abszorbancia értékeket a reagens vakoldattal szemben. A vizsgálathoz szükséges reagens vakoldat csak a felhasznált vegyszereket tartalmazza minta nélkül, amelyre a spektrofotométert nullázzuk, szójaminta vakpróba, amely csak a szójamintát és a DL-BAPA reagenst tartalmazza, amelyre kapott abszorbanciaértékre a korrekciókat el kell végezni.

Az adott térfogatú szójaszuszpenziókat tartalmazó elegyek tripszininhibitor (a továbbiakban: TIU) értékeit az inhibitort nem tartalmazó, ún. nullás oldat és az inhibitort tartalmazó szójaszuszpenzió elegyek értékeinek a különbségéből számítjuk ki. Az adott térfogathoz kiszámított TIU-értékeket 1 cm3 szuszpenziónak megfelelő értékre számítjuk át, az így kapott értékeket (TIU/cm3) az eredetileg bemért szuszpenzió cm3-einek függvényében ábrázoljuk (0,6; 1,0; 1,4; 1,8). A TIU-értékeket összekötő egyenes és az Y tengely metszéspontja adja az 1 cm3 szójaszuszpenzió által előidézett gátló hatást TIU-egységben kifejezve. Az eredmény pontosabban számítható a lineáris regresszióval kapott egyenes egyenletéből (y = a + b · x), amelyből x = 0 esetén az „a” érték adja az 1 cm3 szójaszuszpenzió által előidézett gátló hatást. Az eredetileg bemért szójaminta mennyisége, a szójaszuszpenzió hígításának, valamint a vizsgált anyag olaj- és víztartalmának ismeretében a vizsgált anyag TIU-értékét 1 mg zsíros, légszáraz anyagra vonatkoztatva adjuk meg. A párhuzamos meghatározások eredményei között megengedett legnagyobb eltérés az eredmény 10%-a.

11.5.4. A mikotoxinok meghatározása

11.5.4.1. A mikotoxinok meghatározása kémiai módszerekkel

A mikotoxikológiai vizsgálat magában foglalja egyrészt a mikológiai és a mikrobiológiai vizsgálatokat, másrészt a kémiai analíziseket, továbbá a biológiai és immunkémiai teszteket is. A vizsgálatok közül e fejezetben csak a kémiai analízisekre szorítkozunk.

A mintavételi szabványok előírásai szerint vett átlagmintát szükség szerint maximum 50 °C-on, kíméletesen szárítjuk, majd szilárd minták esetén őrléssel, szerv- és szövetminták esetén kvarchomokkal vagy vízmentes nátrium-szulfáttal való eldörzsöléssel biztosítjuk a kellő homogenitást, míg a folyékony mintákat általában közvetlenül használjuk fel az analízisekhez. Ezt követően a vizsgálandó mikotoxinokat szerves oldószerek (etil-acetát, acetonitril, metanol, aceton) vagy szerves oldószer-víz elegyek használatával kivonjuk, amely kivonás történhet Soxhlet-extrakcióval, rázatással, gyors fordulatú homogenizátorral és ultrahangfürdővel. A nyers toxintartalmú extraktumot szerves folyadék-folyadék extrakcióval, speciális szerves oldószer-lúgoldat extrakcióval, oszlop- és rétegkromatográfiával, illetve ezen eljárások kombinációjával tisztítani kell. A kimutatások és meghatározások standard mikotoxinok felhasználásával, rétegkromatográfiával vizuálisan (a mikotoxinok fluoreszcenciája, valamint vegyszerekkel láthatóvá tétele után), illetve denzitometriás értékelés alkalmazásával, gáz- és folyadékkromatográfiás módszerekkel, továbbá ultraibolya- és infravörös spektrofotometriás, magmágneses rezonanciaspektroszkópiás és tömegspektrometriás technikákkal, valamint ezek kombinációjával végezhetők.

11.5.4.2. Az F2-toxin-tartalom vizsgálata vékonyréteg-kromatográfiával

A vizsgálati mintát etil-acetáttal, Soxhlet-készülékben extraháljuk, a nyers kivonatot hexán-acetonitril, majd speciális kloroform-lúg folyadék-folyadék extrakcióval tisztítjuk. A tisztított kivonatot kétdimenziós rétegkromatográfiás kifejlesztés után UV, illetve látható fényben vizsgáljuk, az F2-toxin fluoreszcenciája, illetve színreakcióval láthatóvá tétele révén.

A mérés során a megfelelő szemcseméretűre megőrölt mintából 20 g-ot Soxhlet-készülékben etil-acetáttal nyolc órán át extrahálunk, majd az extraktumot rotációs gyorsbepárlóval bepároljuk. A maradékot 50 cm3 hexánban feloldjuk, majd 50 cm3 és azután még 25 cm3 acetonitrillel kirázzuk. Az acetonitriles fázisokat bepároljuk, majd a maradékot 25 cm3 kloroformmal vesszük fel. Ezt kétszer 10 cm3, 1 térfogatnyi 0,2 mol/dm3 sósavoldattal tompított 10 térfogat 1 mol/dm3 nátrium-hidroxid-oldattal óvatosan kirázzuk. Az egyesített lúgos fázisok pH-ját 0,67 mol/dm3 koncentrációjú foszforsavoldat és 0,1 mol/dm3 nátrium-hidroxid-oldat felhasználásával 9,5-re állítjuk be. Ezt követően 3 × 15 cm3 kloroformmal kirázzuk, majd az egyesített kloroformos fázisokat vízmentesítés után bepároljuk. A maradékot acetonnal kvantitative speciális fiolákba visszük át, a mintákat nitrogénáramban bepároljuk, és a maradékot 200 µl acetonban vesszük fel. Ezt megfelezve 100–100 µl-t használunk fel a réteg- és a gázkromatográfiás elemzésekhez.

A rétegkromatográfiás elválasztást Kieselgel G készrétegre minta, standardok (a felhasználandó standard koncentrációja 0,1 µg/µl) és minta + hozzáadott standard felvitele mellett, kétdimenziós kifejlesztéssel végezzük. Az első irányban toluol-etilacetát-hangyasav = 6:3:1, a második irányban kloroform-aceton = 9:1 arányú elegyekkel végezzük a futtatást. Az értékelés UV fényben 254 és 365 nm-en közvetlenül, majd az 1%-os 4-metoxi-benzol-diazonium-fluoroborát-oldattal, valamint 0,1 mol/dm3 nátrium-hidroxid-oldattal, továbbá 0,05 mol/dm3 kénsavval való bepermetezés után, látható fényben történik.

11.5.4.3. Az F2-toxin meghatározása gázkromatográfiával

Az előző fejezetben leírtak szerint kivont és tisztított F2-toxin-tartalmú acetonos oldatból 100 µl-t használunk a gázkromatográfiás analízishez. Ezt a mennyiséget nitrogénáramban ismételten bepároljuk, majd 30 percen keresztül 50 µl szililező reagenssel szililezzük. Az így kapott mintából 1–3 µl-t injektálunk a gázkromatográfba. Az analízishez 0,25–0,50 µg/ml koncentrációjú standard oldatot használunk fel, szintén szililezett formában. A gázkromatográfiás elemzés körülményei az alábbiak:

  • kolonna: 2 mm belső átmérő, 1 m hosszú üveg, 3% OV-17 töltettel,

  • hőmérséklet TI = 275 °C, TD = 305 °C, TK = hőmérséklet program 150 °C/perc, 8 °C/perc emeléssel 260 °C-ig, 3 perc hőmérséklettartás,

  • nitrogénáramlási sebesség: 17,5 cm3/perc, hidrogénáramlási sebesség: 30,5 cm3/perc, levegőáramlási sebesség: 300 cm3/perc.

Ilyen kromatográfiás körülmények között a zearalenon szililezett származéka 16 perces retenciós idővel detektálható.

11.5.5. A peszticid- és herbicidmaradványok meghatározása

Az élelmiszer-egészségügyi szempontból még megengedhető peszticid- és herbicidmaradvány-szinteket szigorú előírások szabályozzák, ezért az ilyen típusú anyagok kimutatása és mennyiségi meghatározása az élelmiszer-vizsgálatok fontos része. Mivel mg/kg, esetleg csak µg/kg koncentrációjú anyagokat kell meghatározni, az analitikai eljárás legtöbbször rendkívül bonyolult, a meghatározást mindig tisztítás és esetenként koncentrálás előzi meg. Ilyen kis koncentrációk mérésére szinte csak olyan, nagyhatékonyságú eljárások jöhetnek számításba, mint a vékonyréteg-kromatográfia, a gázkromatográfia vagy az utóbbi időben a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia. Jó, ha a nagyműszerekhez tömegspektrométer is csatlakoztatható, mert így a vegyületek azonosításának biztonsága növelhető.

A minta előkészítése során a kivonás az egyik legfontosabb művelet, amelynek segítségével olyan oldatot kapunk, amely a vizsgálni kívánt szermaradványt tartalmazza. A kivonás után az extraktumot lehetőleg kíméletesen, minél kisebb koncentrációra kell bepárolni, majd a kivonat tisztítása következik. Erre legalkalmasabbak a különféle oszlopkromatográfiás módszerek, melynek során az oszloptöltet alumínium-oxid vagy szilikagél, az eluáló szerek pedig szerves oldószerek, illetve azok elegyei. A minőségi és mennyiségi meghatározás során a vékonyréteg kromatográfiás módszerek az uralkodók, amelyeknél a foltok előhívását a következőképen végezhetjük:

  • Kén-, illetve klórtartalmú szerek esetében a kromatogramot ezüst-nitrát-2-fenoxi-etanollal bepermetezzük, majd 10 percre UV-lámpa alá helyezzük, ezt követően a kén- illetve klórtartalmú szerek sötétbarna foltként jelennek meg a világos háttérben.

  • Tiofoszfátok esetében a kromatogramot ezüst-nitrát–brómfenolkék reagenssel kezeljük, negyedóráig 80 °C-on tartjuk, a lehűlést követően pedig 5%-os citromsavoldattal permetezzük be. A tiofoszfátok sárga háttérben, kék foltként jelennek meg.

  • A foszfátészterek meghatározásakor a kromatogramot 80%-os etanolban oldott 0,1%-os vas(III)-klorid-oldattal kezeljük, majd szárítás után a kromatogramot 80%-os etanolban oldott 1%-os szulfoszalicilsav-oldattal permetezzük be. A foszfátészterek fehér foltként jelentkeznek, ibolyás háttérben.

Az előzőekben nem említett peszticidek és herbicidek esetében is megtalálhatók azok a speciális reagensek, amellyel a szermaradvány kimutatható, mennyisége a vékonyréteg-kromatográfia adta pontossággal becsülhető. Ha pontosabb meghatározásra van szükségünk, akkor alkalmazhatjuk a gázkromatográfiás eljárást, ahol a csúcsok azonosítása a retenciós idők, illetve a tömegspektrométer jelei alapján elvégezhető.

11.5.6. A különböző fémnyomok kimutatása

Szinte minden fémnek megvan az a speciális reagense, amellyel csak rá jellemző színreakciót ad, és amelynek segítségével az illető fém nyomnyi mennyisége is kimutatható. Az élelmiszerekben jelen lévő szennyező fémnyomok kimutatásához először a szerves anyagokat roncsolással el kell távolítani, hogy a fémtartalom zavartalanul meghatározható legyen. A roncsolás során a vizsgált élelmiszert salétromsav-, kénsav- vagy perklórsavoldattal mindaddig hevítjük, amíg az összes szerves anyagot el nem roncsoltuk. A roncsolást akkor tekinthetjük befejezettnek, ha víztiszta, gyengén fehér vagy sárga színű oldatot kapunk, amelyből közvetlenül vagy megfelelő hígítás után végezhetjük el a különböző fémek kimutatását.

A törzsoldatból az óntartalmat a fenil-fluoronnal végzett reakcióval mutatjuk ki, amelynek során az ón(IV)ionok a reagenssel narancsszínű komplexet képeznek. Az alumínium a 8-hidroxi-kinolinnal sárga színű komplex vegyületet képez, amelynek színintenzitása az alumíniumtartalommal arányos. A vastartalom kimutatása során az oldathoz hidroxilamin-hidrogénkloridot adunk, amely a háromértékű vasat kétértékűvé redukálja. A vas(II)ion az α,α’-dipiridillel 6-os pH-nál vörös színeződést ad, amelynek színintenzitása a vas koncentrációjával arányos. A réztartalom kimutatására a roncsolás után kapott oldathoz lúgosítás után Na-dietil-ditiokarbonátot adunk, amely sárga színű rézkomplexet eredményez. A színes vegyületet szén-tetrakloriddal kirázva a módszert mennyiségi meghatározássá is lehet fejleszteni, hisz a színintenzitás a réz koncentrációjával arányos. Az ólomtartalom kimutatása során ditizonoldatot adunk a mintához, aminek hatására vörös színű fémkomplex keletkezik, amelynek színintenzitása az ólom mennyiségével arányos.

Az arzén kimutatására a Marsh-féle próba és a Gutzeit-próba alkalmas. A Marsh-próba során az oldható arzénvegyületeket a naszcensz hidrogén AsH3 gázzá redukálja, amely hevítés során összetevőire disszociál.

H3AsO3 + 6 H → 3 H2O + AsH3,

2 AsH3 3 H2 + 2 As.

Az elemi arzén kiválásából az arzéntartalomra tudunk következtetni.

A Gutzeit-próba során az arzénvegyületből naszcensz hidrogénnel előállított AsH3 gáz a tömény ezüst-nitráttal átitatott szűrőpapíron sárga foltot idéz elő, ami vízzel megcseppentve megfeketedik. A lejátszódó reakció a következő:

AsH3 + 6 AgNO3 → Ag3As · 3 AgNO3+ 3 HNO3

Ag3As · 3 AgNO3+ 3 H2O → 6 Ag + H3AsO3 + 3 HNO3

A kivált fekete ezüstből az arzén jelenlétére lehet következtetni. A próbát úgy végezzük, hogy a kémcsőbe néhány darabka tiszta, granulált cinket teszünk, hozzáadjuk a vizsgálandó oldat néhány cseppjét, majd kénsavat és réz-szulfátot adunk hozzá. A kémcső száját a savcseppek visszatartására vattadugóval bedugjuk, majd tiszta, fehér szűrőpapírt helyezünk rá, amit gumigyűrűvel rögzítünk. A kifeszített szűrőpapír közepére egy csepp 50 tömeg%-os ezüst-nitrát-oldatot cseppentünk, amelyen arzén jelenlétében barna vagy fekete gyűrűvel szegélyezett, citromsárga színű folt keletkezik. A sárga folt vízzel való megnedvesítésekor megfeketedik. Hasonló összeállítással vakpróbát is készítünk, amely az arzéntartalmú (vizsgálandó) oldat kivételével minden más egyéb vegyületet tartalmaz. A szűrőpapírok színét rövid időközönként összehasonlítjuk.

A többi fémre is kidolgoztak hasonló módszereket, sőt ezen módszerek közül többet mennyiségi analízisre alkalmas eljárássá fejlesztettek, amelyeket a különböző fotometriás nyomelemzési módszerek tárgyalnak.

Napjainkban már nem elég az összmennyiség mérése, ezért az említett módszereken és eljárásokon kívül egyre nagyobb jelentősége van a különböző vegyületformák, illetve eltérő oxidációs állapotok kimutatásának, hisz ezek biológiai hatása különböző. A fémnyomok kimutatására használt legújabb módszerek között meg lehet említeni még a röntgenfluoreszcenciát, az ICP-t, az ICP-MS-t, a HPLC-ICP-MS-t, és egyre nagyobb jelentősége lesz a szubmikro méréstartományokban is alkalmazható módszereknek.