Ugrás a tartalomhoz

Az orvosi élettan tankönyve

Attila, Fonyó (2011)

Medicina Könyvkiadó Zrt.

3. fejezet - Celluláris elektrofiziológia; a nyugalmi membránpotenciál

3. fejezet - Celluláris elektrofiziológia; a nyugalmi membránpotenciál

Az ioncsatornák elektrofiziológiája

A 2. fejezetben röviden ismertettük az ioncsatornák szerkezetének és legfontosabb molekuláris tulajdonságainak alapjait. Az alábbiakban a csatornák elektromos jellemzőit foglaljuk össze; az egyes csatornák szerepére a különböző sejtműködésekben a további fejezetekben térünk vissza.

Az ioncsatornák elektrofiziológiai vizsgálata („patch-clamp regisztrálás”)

Az ioncsatornák elektrofiziológiai vizsgálati módszere a patch-clamp regisztrálás. Maga a kifejezés angol eredetiben vonult be a terminológiába: a „patch” (folt) a membránnak a regisztráló elektróddal érintkező kis felületrészlete, a „clamp” (feszültségrögzítés) utal az áramintenzitás mérése alatt a feszültség elektronikusan beállított értékére. A kapcsolási vázlat a 3-1. ábrán látható.

A patch-clamp regisztrálás során a megfelelően előkészített üvegkapilláris mikroelektród („patch pipetta”, 1 µm átmérőjű nyílással) a membrán felszínéhez tapad (3-2. ábra). Enyhe szívás hatására az érintkezés helyén egy igen nagy [GΩ (gigaohm, 109 Ω)] ellenállású szigetelés („gigaseal”) keletkezik; áram csak a mikroelektród nyílásával érintkező membránrészen keresztül folyhat. A csatorna megnyílása, ill. zárása négyszöghullámú árampulzusok formájában jelentkezik (3-3. ábra). Az áramintenzitás pA (10–12 A), a csatornák nyitott állapotának tartama általában milliszekundumos nagyságrendű.

3-1. ábra . „Patch-clamp” regisztrálás elve . Az ábra méretarányai torzítottak

3-2. ábra. A “patch-clamp” regisztrálás különböző konfigurációi

3-3. ábra . K+-áram egyetlen K+-csatorna spontán nyílásai alatt. A csatorna spontán nyílik-zárul.

Regisztrálási konfigurációk

A technikának több változatát dolgozták ki. A legegyszerűbb esetben az elektród az intakt sejttel érintkezve létesít „gigaseal”-t (egész sejt regisztrálás, l. a 3-2. ábrát). Szívással azonban a pipetta nyílása alatt lévő membrán leszakítható; az ún. „kifordult membrán” esetében („inside-out patch”) a pipettában lévő folyadékkal a membrán eredetileg extracelluláris, a fürdőben lévő folyadékkal a cytoplasmaticus felszíne érintkezik. Az „outside-out patch” esetében a cytoplasmaticus membránfelszín érintkezik a pipettában lévő folyadékkal, az extracelluláris pedig a fürdővel.

Feszültség-intenzitás karakterisztika

Amennyiben a csatornának mindkét nyílása azonos koncentrációjú elektrolitoldattal érintkezik, és a membrán két oldala között nincs feszültségkülönbség, a csatornán keresztül akkor sem folyik áram, ha a csatorna éppen nyitva van. Ha azonban a membrán két oldala között feszültségkülönbséget hozunk létre, akkor az éppen nyitott csatornán keresztül a polaritásnak megfelelően nettó ionáramlás és ennek következtében áram folyik. Amennyiben a polaritás megfordul, a nettó ionáramlás iránya is megváltozik. Az áram intenzitása (I) a feszültségkülönbséggel (V) arányos, az arányossági tényező (γ) a csatornakonduktancia, a csatornára jellemző érték. A legegyszerűbb esetben az I = γ × V összefüggés lineáris (3-4. ábra). Az elektrofiziológiában az I értékét pikoamperben (pA = 10–12 A), a V értékét millivoltban (mV = 10–3 V) adjuk meg, ebben az esetben a konduktancia dimenziója pikosiemens (pS = 10–12 S): I (pA) = γ (pS) × V (mV), (egyetlen csatorna esetén a konduktanciát γ, membránfelület esetén pedig gion szimbólummal jelezzük). A nyitott csatorna konduktanciája (a csatorna ionpermeabilitása) a csatorna szerkezetétől függő intrinsic tulajdonság.

3-4. ábra . K + -csatorna feszültség-áramintenzitás karakterisztikái . A) a patch-pipettán belül és a fürdőben lévő oldat K+-koncentrációi azonosak. B) a patch-pipettán belüli K+-koncentráció megfelel az intracelluláris, a fürdő K+-koncentrációja az extracelluláris K+-koncentrációnak. Az áramintenzitás a K+-ok egyensúlyi potenciálja mellett válik zérussá

Egyensúlyi potenciál és a Nernst-egyenlet

Egyensúlyi potenciál (Eion)

A következőkben a csatornán keresztüli ionmozgást úgy vizsgáljuk, hogy a membrán által elválasztott két folyadék ionkoncentrációja különbözik (3-5. ábra). Példánkban legyen a membrán anionokra impermeabilis, a csatorna pedig K+-okra átjárható; az A oldalon a K+-ok koncentrációja 100 mM, a B oldalon 4 mM. Kezdetben a két oldal között nincs potenciálkülönbség. A nyitott csatornán keresztül K+-ok áramlanak az A oldalról a B oldal felé. Minthogy a membrán csak K+-okra permeábilis, a csatornán keresztül áramló K+-ok negatív töltéseket hagynak a membrán A oldal felöli felszínén, és a B oldalon pozitív töltéseket halmoznak fel. Ezzel egyre növekvő potenciálkülönbség keletkezik a két oldal között, az A oldal a B oldalhoz képest negatív lesz (membránpotenciál). Az A oldal negativitása egyre nagyobb mértékben tartja vissza a K+-ok áramlását, és egy adott potenciálkülönbség mellett már nem lesz mérhető nettó áram: a koncentrációkülönbség okozta hajtóerő egyensúlyban van a potenciálkülönbség okozta ellentétes irányú hajtóerővel (3-6. ábra). Azt a potenciálkülönbséget, amelynél az egyensúly beáll, egyensúlyi potenciálnak (Eion, az adott példában EK) nevezzük.

3-5. ábra . Az egyensúlyi potenciál kialakulásának szemléltetése . A pipettában lévő folyadék 100 mM, a fürdőben lévő 4 mM káliumiont tartalmaz, a membránban csak K+-csatornák vannak. A K+-ok nettó áramlása a pipettából a fürdőbe akkor szűnik meg, amikor a pipettában a potenciálérték –81 mV-ra áll be (58 × log 4/100 = –81, l. a szöveget); ekkor a kémiai gradiens egyensúlyt tart az elektromos gradienssel

3-6. ábra . Membránpotenciál mérése a tintahal óriásaxonjá ban. Az ábrán a tintahal (Sepia officinalis) óriásaxonját, feszültségregisztráló elektródpárt és millivoltmérő műszert tüntettünk fel. A) Mindkét elektród az axon külső felületén foglal helyet, közöttük nincs potenciálkülönbség. B) Az egyik elektród (az intracelluláris regisztráló elektród) behatolt az axon belsejébe

A Nernst-egyenlet

Az egyensúlyi potenciál az A és a B oldal közötti koncentrációktól függ. A pontos összefüggést a NERNST által leírt egyenlet határozza meg:

E K = k K B K A

Átrendezve, és a k konstanst kifejtve:

E K = R × T z × F × K + B K + A

ahol R a gázállandó, T az abszolút hőmérséklet (Kelvin-fokban), z az ion valenciája (esetünkben + 1) és F a Faraday-féle szám. Megfelelő mértékegységek választása esetén 20 °C-on az (R × T)/z × F) számértéke 25, a potenciálkülönbség pedig millivoltban jelenik meg:

E K = 25 × K + B K + A mV = 58 × K + B K + A mV

A megadott példában szereplő koncentrációviszonyok mellett (kerekítésekkel):

K + B K + A = 4 100 / = 0,04,   0,04 = 1,40

E K = 58 × 1,40 = 81   mV

Az ionokra ható mozgatóerő

Az ionok áramlásának irányát a membrán két oldala közötti potenciálkülönbség (Em) és a koncentrációkülönbségből számítható egyensúlyi potenciál (Eion) különbsége (Em mínusz Eion) szabja meg. (A membránpotenciál keletkezését a sejtekben a fejezet további részében írjuk le.) Pozitív ionok esetében, ha a membránpotenciál pozitívabb, mint az ion egyensúlyi potenciálja, az Em – Eion értéke pozitív. A pozitív töltésű ion – nyitott ioncsatorna esetén – elhagyja a sejtet. Ha viszont a membránpotenciál negatívabb, mint az ion egyensúlyi potenciálja, a pozitív ionok – nyitott ioncsatorna esetén – befelé vándorolnak. Negatív ionok (pl. Cl) esetében, ha a membránpotenciál pozitívabb, mint az ion egyensúlyi potenciálja, az anion a sejt belsejébe vándorol, ellenkező esetben pedig elhagyja azt. Ionáram a csatornákon keresztül csak addig folyhat, amíg a membránpotenciál el nem éri az illető ion egyensúlyi potenciál értékét: amennyiben Em = Eion (azaz Em – Eion = 0), az ionáram megszűnik.

A csatornákon átfolyó ionáram, Iion az előző egyenlet kifejtésével írható le:

I ion = g ion × E m E ion

Az ionáram arányos az ionokra ható mozgatóerővel (Em – Eion) és a csatornák ionkonduktanciájával (gion).

Rektifikáló csatornák. Egyes ioncsatorna típusok mindkét irányban egyaránt jól vezetnek (a konduktancia szimmetrikus), a rajtuk keresztül folyó ionáram intenzitását az ionokra ható mozgatóerő (Em – Eion) szabja meg. Bizonyos ioncsatornákban (pl. a rektifikáló K+-csatornák) a konduktancia aszimmetrikus. Ez a csatornatípus beengedi a sejtbe a K+-okat, ha az Em értéke negatívabb, mint az EK (ez a helyzet azonban csak kísérleti körülmények között áll elő). Ha viszont az Em pozitívabb, mint az EK, akkor a csatorna fokozatosan zár, így ezeken a K+-csatornákon keresztül csak az egyensúlyi potenciál közelében van érdemleges kifelé irányuló K+-áramlás. Ezeknek a csatornáknak jelölése Kir (az „inward rectifier” alapján), és jelentős szerepet játszanak többek között a szívizomsejtek működésében.

A sejtek nyugalmi (membrán-) potenciálja

A 19. században vált ismertté, hogy az izomrostok belseje a rostok külső felszínéhez képest elektronegatív. A kísérleti objektum szerencsés megválasztása, továbbá az elektronika fejlődése következtében a 20. század második negyedében lehetővé vált a transzmembrán elektromos potenciálkülönbség (membránpotenciál, Em) pontos mérése és értelmezése.

A nyugalmi potenciál mérése

Egyes puhatestű tengeri állatok, mint pl. a tintahal izmait óriásidegsejtek idegzik be. Az idegsejtek több cm hosszúságú, velőhüvely nélküli axonjai 0,2 – 1,0 mm átmérőjűek. Ilyen méretek mellett viszonylag könnyű volt vékony, néhány mikrométer átmérőjű elektródot vezetni az idegrost belsejébe, és mérhetővé vált az axon belseje és külseje közötti potenciálkülönbség, a nyugalmi membránpotenciál (szokásos egyszerűsítéssel nyugalmi potenciál, 3-6. ábra). Nyugalmi (azaz nem ingerelt) állapotban az óriásaxon belseje kb. 60 mV-tal negatívabb, mint a külső felszín. Megegyezés szerint a potenciál értékét a belső elektródra vonatkoztatjuk: így a tintahal óriásaxonjának nyugalmi potenciálja kb. –60 mV.

A mikroelektród-készítési technika és az elektronika további fejlődése később lehetővé tette, hogy a membránpotenciált más sejtekben is mérni lehessen. A nyugalmi membránpotenciál értéke a különböző sejttípusokban –30 és –90 mV között változik (3-1. táblázat).

4.7. táblázat - 3-1. táblázat. Közelítő nyugalmi membránpotenciál értékek

Sejt

Nyugalmi membránpotenciál

(mV)

Simaizomsejt (emlős)

–35-től –55-ig

Szív nodalis szövet (emlős)

–55-től –65-ig

Óriásidegrost (tintahal)

–60

Idegsejt (emlős gerincvelői motoneuron)

kb. –70

Kamraizomrost (emlős)

–80

Vázizomrost (emlős)

–80

Vázizomrost (béka)

–90


A nyugalmi potenciál kialakulásának ionális mechanizmusa

A továbbiakban az óriásaxont mint modellt választjuk a nyugalmi membránpotenciál kialakulásának leírására. A modell választása azért előnyös, mert az óriásaxon esetében ismertek a számításokhoz szükséges fizikai paraméterek, a membrán ionpermeabilitása (PK, PNa és PCl), a membrán konduktanciája (gK, gNa és gCl), továbbá az axonon belüli és kívüli ionkoncentrációk (3-2. táblázat), ez utóbbiból kiszámíthatók az egyes ionok egyensúlyi potenciálértékei (EK, ENa és ECl).

4.8. táblázat - 3-2. táblázat. A tintahal óriásaxon extra- és intracelluláris ionkoncentrációi(a koncentrációk mmol/l értékben*)

Ion

Kívül

Belül

Na+

460

50

K+

20

400

Cl

540

(40–100)

Egyéb anionok

350


EK ≈ – 76 mV

Em (mért) ≈ – 60 mV

ENa ≈ + 56 mV

* A tintahal szövetei a tengervízzel izozmotikusak

A K+-gradiens és K+-permeabilitás szerepe

A nyugalmi potenciál kialakulásának első megközelítésben három alapja van: 1. a plazmamembrán jelentős K+-permeabilitása és alacsony Na+-permeabilitása, 2. a K+-ok koncentrációkülönbsége az axoplasma és az extracelluláris környezet között, továbbá 3. az a tény, hogy az axoplasma anionjainak nagy részére a membrán impermeábilis. A K+-ok koncentrációgradiensük irányában kifelé diffundálnak, és minthogy az intracelluláris anionok többsége nem képes követni a kilépő K+-okat, a membrán belső felszíne negatív a külső felszínhez képest (3-7 ábra).

3-7. ábra . Az óriásaxon ionpermeabilitása és a nyugalmi membránpotenciál kialakulása

A membránpotenciál függése a külső K + -koncentrációtól. A membránpotenciál létrejöttében alapvető az extracelluláris közeg K+-koncentrációja (a 3-8. ábra kihúzott vonala): a K+-koncentráció növekedése (hyperkalaemia) a nyugalmi membránpotenciált pozitív irányba tolja el (depolarizáló hatású), a csökkenés (hypokalaemia) viszont negatív irányba mozdítja a membránpotenciált (hiperpolarizáló hatású).

3-8. ábra . A nyugalmi membránpotenciál összefüggése az extracelluláris K + -koncentrációval az óriásaxonban . A vízszintes tengely a külső K+-koncentráció logaritmikus léptékben, a függőleges tengely a membránpotenciál mV-ban. A kihúzott egyenes a Nernst-egyenlet alapján számított membránpotenciált, a szaggatott vonalon lévő körök a mért értéket mutatják. A két vonal különbsége a Na+-permeabilitás okozta eltérést mutatja

A Na+-gradiens és Na+-permeabilitás módosító szerepe

Ha csak az előbb felsorolt három tényező szerepelne a membránpotenciál kialakulásában, akkor az Em egyenlő lenne az EK-val. A 3-2. táblázatból azonban kiolvasható, hogy a K+-ok egyensúlyi potenciálja közel van ugyan a nyugalmi membránpotenciálhoz, attól azonban kis mértékben, de következetesen eltér, az EK negatívabb, mint az Em. Mi ezen eltérés oka? Az idegrostmembrán kismértékben permeábilis Na+-okra nézve is, a PK : PNa arány 1 : 0,04. A Na+-ok egyensúlyi potenciálja pozitív érték (+56 mV), így Na+-ok lépnek az idegrost belsejébe, és némileg pozitívabbá teszik a membránpotenciált, mint a K+-ok egyensúlyi potenciálja. A ténylegesen mérhető membránpotenciál (–60 mV) valahol az EK (–75,5 mV) és az ENa (+56 mV) között helyezkedik el. (Az óriásaxon esetében a kloridionok szerepét figyelmen kívül lehet hagyni, ez azonban már nem érvényes az ideg- és más sejtekre.)

A membránpotenciál számítása

A membránpotenciál – figyelmen kívül hagyva a Na+–K+-pumpa elektrogén jellegét – kiszámítható az ionok konduktanciájából és az egyes számba vett ionok egyensúlyi potenciáljából:

E m = g k × E K + g Na × E Na g K + g Na

Minthogy a membrán K+-konduktanciája lényegesen nagyobb, mint Na+-konduktanciája, a nyugalmi membránpotenciál közelebb van a K+-ok egyensúlyi potenciáljához, mint a Na+-okéhoz.

Egyes idegsejtek (pl. emlős gerincvelői motoneuronok) nyugalmi membránpotenciálja –70 mV körüli tartományban van. Más sejtekben, pl. a gerincesek vázizmaiban a nyugalmi membránpotenciál –90 mV vagy ennél is negatívabb: ennek oka a sejtek alacsony Na+-konduktanciája (a gNa : gK arány kisebb, mint az óriásaxonban). A simaizomsejtekben a nyugalmi membránpotenciál kevéssé negatív, a sejtek membránjának Na+-konduktanciája nagyobb mértékű.

A Goldman−Hodgkin−Katz-egyenlet. A membránpotenciál összefüggése az ionpermeabilitásokkal és ionkoncentrációkkal az alábbi formalizmussal is leírható:

E m = 58 P K × K + külső + P Na × Na + külső P K × K + belső + P Na × Na + belső

Az egyenletet Goldman, és tőle függetlenül Hodgkin és Katz fogalmazta meg, és szokásos GHK-egyenletként említeni. A Na+-ok membránpotenciált módosító hatása megfigyelhető a 3-8. ábra szaggatott vonalán. Magas K+-koncentráció esetén ez a módosító hatás kicsiny, ill. elhanyagolható {a (PK × [K+]külső) tag meghatározóan nagyobb, mint a (PNa × [Na+]külső) tag, alacsony K+-koncentráció mellett azonban a (PK × [K+]külső) tag kevésbé jelentős, mint a (PNa × [Na+]külső) tag}.

A Na + –K + -pumpa hozzájárulása a nyugalmi potenciálhoz. A 2. fejezetben leírtuk, hogy a Na+–K+-pumpa minden egyes ciklusa során 3 nátriumiont 2 káliumionra cserél ki, a pumpa elektrogén. Ez az egyenlőtlenség a nyugalmi membránpotenciált néhány millivolttal negatívabbá teszi, mint amit a permeabilitások és ionkoncentrációk alapján ki lehet számítani (pumpapotenciál).

Az ioncsatornák szerepe a membránpotenciál változtatásában

A fiziológiásan fontos ionok közül a Na+- és Ca2+-ok egyensúlyi potenciálja nagyon jelentősen, a K+- és Cl-ok egyensúlyi potenciálja kisebb mértékben tér el a nyugalmi membránpotenciáltól. Ez annyit jelent, hogy ezek az ionok nincsenek egyensúlyban a membrán két oldalán, és amennyiben szabad út nyílik részükre, akkor az Em mínusz Eion különbség irányában elmozdulnak, ezzel megváltoztatják az aktuális membránpotenciál értékét. A szabad utat az ioncsatornák megnyílása jelenti.

A Na+- és a Ca2+-csatornák megnyílása a membránpotenciált pozitív irányban viszi el (depolarizál, esetleg átpolarizál, l. a 6. fejezetet). A K+-csatornák megnyílása többnyire negatívabbá teszi a membránpotenciált (hiperpolarizál vagy repolarizál). Minthogy a Cl-ok egyensúlyi potenciálja igen közel esik a nyugalmi membránpotenciálhoz, a Cl-csatornák megnyílása a körülményektől függően növeli, csökkenti vagy nem befolyásolja a membránpotenciál kiindulási értékét. A csatornaműködések ezzel alapjaiban határozzák meg az egyes ingerlékeny sejtek (ideg- és különböző izomsejtek) működését; szerepükre a megfelelő fejezetekben térünk vissza.

Mérföldkövek

A kezdet

1791: L. Galvani megfigyeli és leírja az „állati elektromosság”-ot. Valamivel később A. Volta újraértelmezi a Galvani által felfedezett tényeket, a szövetek elektromos ingerlékenységét. Galvani és Volta felfedezései nemcsak az elektromosságtan, hanem az elektrofiziológia alapjait is képezik.

Az ionteória kialakulása

1888-1895: W. Nernst kidolgozza az ionokra ható mozgatóerők elméletét (Nernst-egyenlet 1888).

1902–1912: Julius Bernstein feltételezi, hogy a sejtek belseje és külseje közötti potenciálkülönbséget (amelyet sokkal később “nyugalmi potenciál”-nak neveztek el) a káliumionok kifelé irányuló diffúziója okozza. (A nyugalmi potenciált hosszú időn keresztül “sértési potenciál”-ként említették, mivel feltételezték, hogy az izomrostok sértésének következménye.)

Az elektrofiziológia kialakulása

1936: J. Z. Young bevezeti a neurobiológiai kutatásokba a puhatestűek óriásaxonját. Ezt követően A. L. Hodgkin (Anglia) és K. S. Cole (Egyesült Államok) intracelluláris elektródokkal méréseket végez az óriásidegroston, a vizsgálatokat 1939-ben félbeszakítja a II. világháború.

1949: A. L. Hodgkin, A. F. Huxley, B. Katz és R. D. Keynes a háborút követően folytatják vizsgálataikat az óriásaxonon. Elsőként tételezik fel ioncsatornák létét, és ezeket a csatornákat “feszültségfüggő Na+- és K+- csatornák”-nak nevezik el.

1976: E. Neher és B. Sakmann kidolgozzák az ioncsatornák ionáramainak mérésére alkalmas “patch-clamp” módszert.