Ugrás a tartalomhoz

Molekuláris biológia I-II.

Bálint Miklós (2010)

Educatio Társadalmi Szolgáltató Nonprofit Kft.

2.21. Az L19 RNS-molekula nukleáz- és polimerázaktivitása

2.21. Az L19 RNS-molekula nukleáz- és polimerázaktivitása

Az L19 RNS darab még mindig rendelkezik a G kötőhelyével és a puringazdag irányító szekvenciával. Feltételezték, hogy ezek révén más szubsztrátokra is hatással lehet. Kiderült, hogy ez valóban így van, mert az L19 RNS például katalizálja egy öttagú oligoribonukleotid, a pentacitidilát (C5) hosszabbítását és lebontását is (2.40. ábra).

 

2.40. ábra. Az oligoribonukleotid-pentacitidilát (C5) L19 révén történő hosszabbítása és rövidítése. Molárisan hatszor annyi szubsztrát volt jelen, mint enzim. A C55 vége 32P-vel jelölt volt, így a detektálást autoradiográfiával végezték.

 

   

Az ábrán jól látható, hogy az L19-cel való inkubációs időtől függően a pentacitidilátból hosszabb és rövidebb oligoribonukleotidok képződnek. A C5 egyrészt megrövidül C4-re, ill. C3-ra, de egyidejűleg C6, C7, C8 is keletkezik a C5 fogyása mellett. Vagyis az L19 ribonukleáznak és RNS-polimeráznak is tekinthető. Az L19 egyaránt hat a C5 és U5 szubsztrátokra, viszont nem hat az A5 és G5 ribonukleotidokra. Az enzim követi a Michaelis–Menten-kinetikát (KM  (látszólagos)=42μM, kkat=0,033sec1 a C5 esetén). A ribóz 2 OH jelenléte szükséges a katalízishez. Ezt bizonyítja, hogy a dezoxi- C5 kompetitív gátlószerként (inhibitorként) viselkedik.

Az L19 tehát az enzimatikus katalízis számos jellegzetességét hordozza: szubsztrátspecificitás, Michaelis–Menten-jellegű telítési kinetika, kompetitív gátolhatóság. Az L19 a C5 hidrolízisét 1010-szeresre fokozza a nem katalizált reakcióhoz képest, ez is az RNS-nek a valódi enzimekhez hasonló, ,,enzimszerű” voltára utal.

Hogyan működik az L19 mint enzim? Az L19 feltételezett katalitikus hatásmechanizmusát mutatja be a 2.41. ábra. Az ábrán feltüntetett hidrolitikus útvonalat a magas pH, a szintetikus útvonalat a magas C5-koncentráció segíti elő. A G–p–C foszfodiészterkötés szokatlanul reaktív, mivel a foszforatom pentakovalens (öt vegyértékű) átmeneti állapotot (transition state) alakít ki.

 

2.41. ábra. Az L19 feltételezett katalitikus mechanizmusa.

 

 

a) az enzim önmagában (ribozim).

 

 

b) a C5 hidrogén hídkötésekkel az enzim puringazdag vezetőrégiójához kötődik, és az enzim 3 végi OH-ja támadja a C-k közötti foszfodiészterkötést, és elhasítja azt. A maradék C4 disszociál.

 

 

c) lehasított pC a G-hez kötődik, majd hidrolizál, és így visszaáll az enzim eredeti állapota.

 

 

d) az újból megkötött C5 a körülményektől függően a G-hez kötött pC-t magához kapcsolja, és így a C6 hidrolízise révén áll helyre az eredeti állapot.

 

   

Ezt a folyamatot szemlélteti, amikor egy 13 tagú RNS-szubsztrátot hasít az L19 (2.42. ábra).

 

2.42. ábra. a) Egy 13 tagú RNS-szubsztrát hasítása az L19 enzim és guanozinkofaktor által. A hasítás mechanizmusa b). Az átmeneti állapot (transition state) pentakovalens (öt vegyértékű) foszforatomot tartalmaz. A Mg2+ szerepe az, hogy stabilizálja a távozó csoport 3 oxigénatomján a negatív töltést.