Ugrás a tartalomhoz

Molekuláris biológia I-II.

Bálint Miklós (2010)

Educatio Társadalmi Szolgáltató Nonprofit Kft.

5.4. A topoizomerázok szerepe az E. coli DNS-replikációjában

5.4. A topoizomerázok szerepe az E. coli DNS-replikációjában

A jelenlegi kutatások szerint az E. coli négy különböző topoizomeráz enzimet tartalmaz. De a terminológia megtévesztő. mert a topoizomeráz I és III-nak nevezett típus mind topoizomeráz I-es típusú, míg a topoizomeráz II (ez utóbbit DNS-giráznak is hívják) és IV. is II-es típusú topoizomeráz.

Az I-es típusú topoizomeráz a DNS kettős szál egyikét hasítja időlegesen majd kapcsolja újra össze. A II-es típusú topoizomeráz viszont a DNS mindkét szálát hasítja, majd idővel újból összekapcsolja.

A topoizomerázok működése a DNS-replikáció és a DNS-transzkripció során válik fontossá, hiszen ezen folyamatok során szükségeltetik a két polinukleotid DNS-szál lokális szétválása.

A topoizomerázok neve onnan ered, hogy ezen enzimek a DNS topológiai állapotát befolyásolják, vagyis a kapcsolási számot, a ,,linking number”-t csökkentik, viszont nincsenek hatással a DNS-kovalens struktúrájára.

A rögzített végű, mert cirkuláris és negatív (jobb menetes) szuperhélix-meneteket tartalmazó prokarióta DNS (lásd az 1.37., 1.38., 1.39. ábrákat) replikációjához elengedhetetlen a topoizomeráz I és II működése. Ugyanis egy 10,5 bpár hosszú kettős hélix felnyílása egy pozitív bal menetes szuperhélix kialakulását eredményezné, ami viszont megnehezítené a DNS kettős szálak szétválását (5.5. ábra), vagyis a replikációt.

 

5.5. ábra. Ha a DNS egyes vagy kettős szál rotációja gátolt, pl. a DNS cirkuláris volta miatt, akkor szuperhélix alakul ki a DNS-ben a hélix felnyílása során. Ez a feszültség növelheti a DNS kettős hélix fordulatainak számát (L = linking number 10,511,5-re). Azonban ennek a deformációnak a DNS kettős hélix ellenáll, és inkább a szuperhélix kialakulását teszi lehetővé. Kb. 1 szuperhélix keletkezik minden 10,5 bázispár felnyílása után. Az így keletkező szuperhélix pozitív (+) bal menetes, ami gátolja a DNS kettős láncok szétválását mind a replikációnál, mind a transzkripciónál.

 

   

Az E. coli kromoszóma replikációja 60 000 bpár/perc sebességgel folyik két irányban, egy pontból kiindulva. Ennek következtében igen sok (+) bal menetes szuperhélix alakulna ki, ami meggátolná a kettős láncok szétválását. Ezt a DNS-polimeráz I úgy szünteti meg, hogy a DNS-láncok egyikét elhasítja, a feszültséget letekeredés révén megszünteti, majd újból összekapcsolja a láncvégeket (5.6. ábra).

 

5.6. ábra. A topoizomeráz I részletesebb hatásmódja.

 

   

A topoizomeráz I működésének lényege tehát az, hogy csökkenti a DNS-supercoiled állapotát (letekeri), ami energetikailag kedvező, tehát nem igényel extra energiát. Ugyanakkor a szuperhelikális állapot kialakulása energiát igényel. Egyetlen szuperhélix bevitele viszont 9 kcal/mol energiát kíván. Vagyis a természetes DNS-formákban jelentős mennyiségű energia akkumulálódik.

Az E. coli DNS szuperhelikalizálódását viszont a topoizomeráz II (más néven DNS-giráz) katalizálja. Ez az enzim két 105 kDa-os két 95 kDa-os alegységéből áll (AA, BB). Lényegében egy energiaátvivő szerkezet, amennyiben az ATP energiáját a szuperhélix torziós feszültségébe viszi át.

A folyamat azzal kezdődik, hogy a DNS mintegy 200 bpár hosszú szakasza az enzim köré tekeredik. Az enzim a DNS lépésenkénti szuperhelikalizációját vonja maga után ATP hidrolízise közben. Tehát jobbmenetes [negatív (–)] θ szuperhélixeket ,,pumpál” be a DNS-be, ami azután elősegíti a replikációt (5.7. ábra).

 

5.7. ábra. A topoizomeráz II a DNS mindkét szálát elhasítja, majd a kettős szál ezen a részén fűződik át. Végül a két elhasított lánc újból összekapcsolódik. Az eredetileg egy pozitív szuperhélixet tartalmazó DNS kettős lánc most egy negatív szuperhélixet fog tartalmazni. Mindkét DNS-szál 5 vége az A alegységek specifikus tirozil oldalláncaihoz kötődik, vagyis itt sem történik hidrolízis, mint a topoizomeráz I esetén. Az 5 végek ilyen lekötése meggátolja a szabad rotációt, ami a szuperhélix állapot megszűnését eredményezné. Kb. két negatív szuperhélix pumpálódik be ily módon a DNS kettős láncba másodpercenként. A topoizomeráz I és II mennyisége szabja meg azt, hogy a megfelelő mértékű legyen a DNS szuperhelikalizáltsága.

 

   

Ha nincs jelen ATP, akkor az E. coliban a giráz (topoizomeráz II) relaxálja a negatívan szuperhelikalizált DNS-t. Az eukarióta topoizomeráz II viszont csak relaxálja a szuperhélixeket, sohasem generálja ezeket ATP hasítása közben.

A prokarióták topoizomeráz II-je kétféle antibiotikummal (novobiocin, oxolinsav) gátolható specifikusan (5.8. ábra).

 

5.8. ábra. A topoizomeráz II-t gátló kétféle vegyület, a novobiocin és az oxolinsav. Ezt a két girázgátlót széles körben alkalmazzák húgyúti fertőzések esetén.

 

   

Mindkét vegyület erősen gátolja a bakteriális DNS eplikációját és transzkripcióját. Ez alapvetően mutatja annak a fontosságát, hogy megfelelően szuperhelikalizált DNS szükséges ahhoz, hogy a fenti két folyamat végbemehessen.

A bakteriális DNS szuperhelikalizálódását tehát két enzim ellentétes működése szabja meg. Negatív szuperhélixet visz bele a DNS-giráz (ill. topoizomeráz II), és elősegíti a DNS kettős szál szétválását a replikáció és transzkripció számára. A túlzott negatív szuperhelikalizálódást viszont a topoizomeráz I szünteti meg.

A prokarióta cirkuláris DNS-ek replikációja mivel egy pontban kezdődik és két ellentétes irányban halad (lásd 5.4. ábrát), a végén mindenképp katenátot képez (5.9. ábra). Ennek megszüntetését is a topoizomeráz II (giráz) végzi.

 

5.9. ábra. Amint a replikációs villák, ellentett irányban haladnak a cirkuláris genomon, elérik egymást, és akkor katenátot képeznek. Ekkor a replikáció nem tud továbbfolyni. A topoizomer II szétválasztja a katenátot, és így a replikáció befejeződhet (baloldalt). Vagy a replikáció teljes befejeződése után válik szét a két kettős DNS-lánc a giráz hatására (jobb oldalt).