Ugrás a tartalomhoz

Erdészeti - természetvédelmi genetika

Mátyás Csaba

Mezőgazda Kiadó

Markerek felhasználása a genetikai változatosság elemzésére

Markerek felhasználása a genetikai változatosság elemzésére

Szűkebb értelemben véve csak azokat a fenotípusos tulajdonságokat tekinthetjük genetikailag meghatározott tulajdonságnak (vagy genetikai tulajdonságnak), amelyek döntő mértékben genetikai kontroll alatt vannak.

A morfológiai, fiziológiai, anatómiai tulajdonságok legnagyobb részéről ez nem mondható el, mert egyrészt genetikai szabályozottságuk módja általában még ismeretlen, és emellett jelentős mértékben a környezet hatása alatt állnak. Így a fenotípusos változatosság és az alapjául szolgáló genetikai változatosság kapcsolata nehezen deríthető ki.

Számos lehetőség van arra, hogy genetikai elemzések segítségével egy-egy gén működését a fenotípusosan megjelenő tulajdonság alapján vizsgáljuk. Ehhez az szükséges, hogy a gén jelenléte és expressziója (a tulajdonság fenotípusos megjelenése) között kapcsolat legyen.

Anélkül, hogy mai értelemben vett genetikai ismeretekkel rendelkezett volna, Gregor Mendel keresztezési kísérleteivel pontosan ilyen természetű kapcsolatokat tárt fel a borsóvirág és -mag morfológiáját, színét meghatározó gének és a tulajdonságok megjelenési törvényszerűségei között. Elemzéseiben pl. a borsóvirág színe (piros, fehér, ill. rózsaszín) a színt meghatározó gén jelzője volt. (Természetesen erről Mendelnek nem lehetett tudomása.) Az előbb említett definíció szerint a virágszínt szoros értelemben is genetikailag meghatározott tulajdonságnak tekinthetjük. Ugyancsak genetikailag meghatározottak egyes, a növényi anyagcsere során létrejövő szerves molekulák, amelyek megfelelő módszerekkel elemezhetők (pl. fehérjék, terpének). E tekintetben a vizsgált fehérje vagy asszimilátum a struktúrgén markere, vagyis közvetlen kapcsolatot tételezünk fel a lokusz és a szintetizált szerves anyag között.

Genetikai markernek tekintünk általában minden olyan tulajdonságot, amely felhasználható egy fajra, populációra, egyedre (sőt esetleg szövetre, sejtre, kromoszómára) jellemző allél vagy bázissorrend azonosítására, nyomon követésére (mark = megjelöl). Ez a tulajdonság lehet morfológiai bélyeg vagy köztes anyagcseretermék, az allél közvetlen terméke (fehérje), vagy közvetlenül a DNS bizonyos szakaszai. Ehhez a markernek a következő feltételeket kívánatos teljesítenie:

  • ne befolyásolják számottevően a környezeti hatások;

  • legyen független az egyedfejlődési fázistól, fiziológiai állapottól;

  • egyszerű, kodomináns öröklődést mutasson (azaz az egyed mindkét alléljának hatása legyen azonosítható);

  • mutasson kellő változatosságot a jó elkülöníthetőség érdekében;

  • lehetőleg minél fiatalabb életkorban alkalmazható legyen;

  • kimutatása legyen gyors és egyértelmű, és lehetőség szerint olcsó;

  • az eredmény legyen könnyen reprodukálható.

Ezen kívül még célszerű, ha az alábbiaknak is megfelel:

  • mutassa ki azokat az eltéréseket is, amelyek nem járnak fenotípusos változással; valamint

  • a genom kódoló és nem kódoló szakaszain jelentkező eltéréseket egyaránt jelezze.

A fenti követelmények közül a legfontosabb a környezeti–fiziológiai hatásoktól, és az expresszálódástól való függetlenség, hiszen a markert lehetőség szerint bármikor, bármilyen feltételek között ki kell tudni mutatni. Minél kevesebb áttételen keresztül nyilvánul meg az allél hatása, annál inkább teljesíthető ez a követelmény. Ezért genetikai markerként előszeretettel használnak fehérjéket (ún. biokémiai markerek, mint pl. az enzimek), illetve közvetlenül a DNS szakaszait (ún. molekuláris markerek).[6]

A marker segítségével felismerhető gént markergénnek nevezik. A markerek alkalmazása, elemzése nemcsak az öröklődés alaposabb vizsgálatát teszi lehetővé, hanem közvetlen gyakorlati jelentősége is van, elsősorban a populációban zajló genetikai folyamatok feltárásában (pl. az állomány egyedei közötti párosodási kapcsolatok ellenőrzésében), de nélkülözhetetlen kiválasztott egyedek egyértelmű azonosításához is, amely pusztán morfológiai alapokon nem valósítható meg. Genetikai markerek – pontosabban izoenzim-markerek – segítségével lehetett pl. fényt deríteni arra, hogy a hazánkban szelektált és egyklónúnak tartott akácfajták valójában több, egymáshoz genetikailag közel álló egyed keverékei. Hasonlóképpen genetikai markerekre volt szükség annak bizonyításához, hogy a légszennyezés által károsított bükkösökben bekövetkező mortalitás genetikai következményekkel is jár (Müller-Starck, 1995).

A genetikai markerek alkalmazásáról, az analitikai módszerekről nemrégiben hézagpótló könyv jelent meg (Hajósné – Novák, 1999), ezért az általánosan alkalmazott módszerek technikai részleteivel itt nem foglalkozunk.

Kissé részletesebben tárgyaljuk azonban az ott nem tárgyalt terpénanalízist, mert ez a módszer volt az első, széles körben alkalmazott markertechnika az erdészetben, amely már a hetvenes évektől áttörést hozott az erdei fák genetikai változatosságának feltárásában. Emellett a többlépcsős bioszintézis genetikai kontrolljának bemutatására is felhasználjuk.

A továbbiakban a markereket – az erdészeti genetika sajátosságainak megfelelően – az alábbi csoportokra osztva tárgyaljuk:

  • külső morfológiai bélyegek;

  • alacsony molekulasúlyú anyagcseretermékek: terpének;

  • katalitikusan aktív összetett fehérjék: izoenzimek;

  • DNS-markerek.

Külső morfológiai bélyegek

A növényi szervek, magok egyes morfológiai bélyegei közvetlenül alkalmazhatók genetikai markernek. A biokémiai és molekuláris markerek megjelenése előtt a génáramlás és párosodási viszonyok vizsgálatára csak morfológiai markerek álltak rendelkezésre, kivételesen radioaktív izotóppal jelölt virágpor alkalmazására is sor került.

Számos faj esetében megfigyelhető, hogy a csírázó magvak között elvétve albínó példányok fordulnak elő, amelyek természetesen az endospermiumban tárolt tartalék tápanyag felhasználása után elpusztulnak. Az albínókról feltételezhető, hogy egy vagy több klorofill-szintézist blokkoló recesszív allél homozigóta hordozói. A Cupressaceae és Pinaceae családban előforduló sárga (aurea) tűszín öröklődése szintén aránylag egyszerű. A kérdést Langner (1953) vizsgálta lucfenyőn. A mendelező öröklést bizonyító keresztezési kísérletei a genetikai markerek alkalmazásának valószínű első esete az erdészeti kutatásban (l. szövegdobozt).

Fontos

Egy úttörő marker-alkalmazás

Langner (1953) aurea (sárgatűs) lombozató lucfenyők környezetében gyűjtött tobozt és a kapott utódnemzedékben vizsgálta a sárga színű egyedek megjelenését. Az aurea szülőkhöz közeli fákról szedett magból aránylag sok sárga magoncot nevelt, a markergént hordozó aureáktól 100 m-re azonban már hiányoztak a sárga alléit hordozó egyedek. Ez az úttörő markergén-alkalmazás megerősíti Wright (1962) megfigyelését a horizontális pollen terjedési távolságról (1. a 18. táblázatban).

A lombfák levelében felhalmozódó antocián nagyszámú faj esetében eredményez vöröses-lilás levélszínt (vérmogyoró, vérbükk, vérjuhar stb). Hattemer és mtsai (1993) a bibircses nyír vöröslevelű változatát vizsgálták meg, és megállapították, hogy a levélszínt egyetlen domináns gén határozza meg. Ugyanakkor a vérmogyoró levélszínét számos domináns gén egyidejű hatására vezetik vissza. Ebben az értelemben a vöröslevelűség a nyír esetében markerként szolgálhat, míg a mogyorónál nem.

Más, egyszerűen öröklődő morfológiai bélyegeket is találtak (pl. szeldeltlevelűség), mindamellett a feltűnő, jól azonosítható külső morfológiai variánsok markerként való felhasználását szinte lehetetlenné teszi az a körülmény, hogy előfordulásuk a természetben igen ritka, hatásuk többnyire kedvezőtlen vagy egyenesen letális, így a gyakorlat számára fontos, felnőttkorú populációkban aligha találkozunk velük.

Anyagcseretermék-markerek: terpének

A bioszintézis során képződő másodlagos anyagcseretermékek (pl. proteinek, gyanták) markerként való alkalmazása a morfológiai-anatómiai tulajdonságokkal szemben előnyösebb, mert minden, fajhoz tartozó egyedben megtalálhatók, a környezet hatásától aránylag függetlenek és a szintézist a vizsgált termék szintjén egy, illetve néhány gén határozza meg. Meg kell jegyezni, hogy az utóbbi évtizedben az anyagcseretermék analízist az újabb, megbízhatóbb eredményt szolgáltató biokémiai és molekuláris módszerek visszaszorították.

A terpének bioszintézise

A terpenoid-típusú vegyületek a növény- és állatvilágban egyaránt előfordulnak, telítetlen szénhidrogének (alkének) vagy oxidált vegyületek formájában, amilyenek a terpénalkoholos aldehidek, ketonok, gyantasavak vagy észterek. Valamennyi terpenoid építőköve az öt szénatomot tartalmazó izoprén-molekula. A terpenoidok ennek polimerizálódásából jönnek létre: a mono-terpenoidok 10, a szeszkviterpenoidok 15, a diterpenoidok 20 szénatomot tartalmaznak.

A terpének a fenyők szervezetében fordulnak elő különösen nagy mennyiségben, elsősorban a gyantajáratokban. A gyantaképző epitélsejtekben történik az előbbiekben leírt prekurzorok (előfutár-vegyületek) és szénhidrogén-vegyületek bioszintézise. A folyamat szoros genetikai kontroll alatt van, így a gyanták, illóolajok elemzése révén az egyedi genetikai változatosság, valamint a változatosság földrajzi mintázata is tanulmányozható. Terpéntípusú illóolajok a fenyőkön kívül néhány lombos nemzetségben is megtalálhatók, így pl. az Eucalyptus nemzetségben, ahol azokat iparilag is hasznosítják.

A terpén-bioszintézist irányító gének expressziója életkortól függ. Így a 3-karén már a csíracsemetékben is képződik, míg más terpének csak 5-10 éves kortól elemezhetők. A termőhely és a vizsgált egyed fizológiai állapota (pl. magonc vagy oltvány) az expresszióra alig gyakorol befolyást, természetesen a képződött terpén mennyisége változhat. Például erdeifenyő esetében a monogén öröklődésű terpéneknél Baradat és Yazdani (1987) általában 0,9 feletti h2 értékeket talált még igen nagymérvű környezeti változatosság mellett is.

A terpén-bioszintézist részben monogén, részben pleiotróp hatások irányítják. Pleiotróp hatás esetén egyetlen gén több szintézislépést határoz meg, pl. a Pinus maritima esetében a LO-lokusz a longifolén és az a-longipinén terpének képződését szabályozza (6. táblázat). Ugyanazon szabályozó lokuszokat különböző fajokban is megtalálták (pl. erdei- és tengerparti fenyőben, jegenyefenyőfajokban is).

A terpén-bioszintézist meghatározó gének adaptív jelentősége csekély. Semleges jellegüket alátámasztja, hogy az egyes fajok esetében feltárt mintázatok sokkal inkább a földrajzi távolságtól és az izoláció mértékétől függenek, mint a környezeti feltételektől. A tengerparti fenyő (Pinus maritima) genotípusok terpénallél-gyakorisága Baradat és mtsai (1991) elemzései szerint csak kivételes esetekben tért el a pánmiktikus (Hardy–Weinberg) egyensúlytól, ami szintén a természetes szelekció csekély hatékonyságára utal. A terpének elemzése tehát sok tekintetben az izoenzimekhez hasonló eredményeket szolgáltat. Az izoenzimekhez képest hátrány, hogy

  • csak diploid szövet elemzése lehetséges, a haploid tápszövet vizsgálatával járó előnyök emiatt elvesznek;

  • a vizsgálható allélváltozatosság korlátozott, így a módszer érzékenysége csekélyebb;

  • utódnemzedék-vizsgálatok esetében a terpénanalízissel várni kell addig, amíg az elemzendő terpénanyagok kiválasztása megindul, ami évekig tarthat (Baradat et al., 1991).

Fontos

A terpének bioszintézise

7. ábra - A terpénbioszintézis főbb lépcsői Baradat ét ál. (1991) szerint. A kialakuló kondenzált szénláncok és gyűrűk építőköve az IPP és izomerje, a DMAP. Aprekurzor (előfutár) vegyületekből (GPP, FPP, GGPP) nagyszámú vegyület szintetizálódik, a lépéseket specifikus enzimek katalizálják, amelyeknek csak egy része ismert. Az ábrán az enzimeket, ill. enzimcsoportokat számjelek helyettesítik. A rövidítések, ill. jelek magyarázata: Prekurzorok: IPP = izopentenil-pirofoszfát, DMAP = dimetil-allil-pirofoszfát, GPP = geranil-pirofoszfát (C]0), FPP = farnezil-pirofoszfát (C]5), GGPP = geranil-geranil-pirofoszfát (C2o). Enzimek: l = IPP-izomeráz, 2,4,6 = prenil-tran-szferáz különböző változatai, 3,4,7 = cikláz-enzimek, 5,8,9 = egyéb, részben ismeretlen enzimek.

A terpénbioszintézis főbb lépcsői Baradat ét ál. (1991) szerint. A kialakuló kondenzált szénláncok és gyűrűk építőköve az IPP és izomerje, a DMAP. Aprekurzor (előfutár) vegyületekből (GPP, FPP, GGPP) nagyszámú vegyület szintetizálódik, a lépéseket specifikus enzimek katalizálják, amelyeknek csak egy része ismert. Az ábrán az enzimeket, ill. enzimcsoportokat számjelek helyettesítik. A rövidítések, ill. jelek magyarázata: Prekurzorok: IPP = izopentenil-pirofoszfát, DMAP = dimetil-allil-pirofoszfát, GPP = geranil-pirofoszfát (C]0), FPP = farnezil-pirofoszfát (C]5), GGPP = geranil-geranil-pirofoszfát (C2o). Enzimek: l = IPP-izomeráz, 2,4,6 = prenil-tran-szferáz különböző változatai, 3,4,7 = cikláz-enzimek, 5,8,9 = egyéb, részben ismeretlen enzimek.


A terpén-szénláncok bioszintézise jó példa a bonyolultabb szerves vegyületek lépésrőllépésre történő felépítésére, ahol minden egyes lépés megtételét enzimek katalizálják. A bioszintézis kiinduló anyagai az 5 szénatomos izopentenil-pirofoszfát (IPP) és izomerje, a dimetil-aUil-pirofoszfát (DMAPP). A két molekula összekapcsolódásából a monoterpének előfutár-vegyülete képződik, illetve további IPP-molekulák beépülése szeszkviterpének, di-, tri-, tetra- és politerpének szintéziséhez vezet. Ennek során részben gyűrűs szénhidrogének, gyantasavak és komplex, gumitípusú polimerek jönnek létre. A folyamatot a prenil-transzferáz, cikláz és egyéb enzimek változatai katalizálják.

A terpénanalízis alkalmazási lehetőségei

Terpének a fenyők minden föld feletti szervében megtalálhatók. A másodlagos kambiális tevékenység során létrehozott faanyagban, ill. tracheidákban aránylag csekély a terpénanyagok változatossága, ezért elemzésre nem alkalmas. A tűlevelekben igen nagyszámú szénhidrogén, gyantasav és egyéb vegyület van, viszont ezek összetétele a vegetációs idő során változik. A másodlagos vastagodás során keletkező háncsszövet (cortex) terpéntartalma kevésbé változatos, de a hajtás fásodásával állandósul és elemzésre használható. 5 fő monoterpén és 2-3 fő szeszkviterpén öröklésmenete már tisztázott (l. a 6. táblázatot), a többi esetében még további kutatásokra van szükség.

A terpének a fenyőgyantából könnyen kinyerhetők és gázkromatográfban aránylag egyszerűen elemezhetők, ezért az erdészeti genetikában már évtizedekkel ezelőtt alkalmazták őket, amikor más markerek még nem álltak rendelkezésre (Squillace – Fisher, 1966).

A terpének felhasználása a kemotaxonómiában, és az infraspecifikus genetikai mintázat elemzésében aránylag széleskörű. Az eddigiekben elsősorban a Pinus és Abies nemzetségek fajainál kerültek alkalmazásra. A kortikális (háncsból kivont) terpénekkel eredményesen azonosíthatók a közeli rokonságban álló fajok és hibridjeik (pl. Pinus halepensis és P. brutia; Gallis – Panetsos 1997), illetve a fajon belüli nagyobb taxonómiai egységek, így pl. a rendszertanilag nehezen kezelhető feketefenyő (Pinus nigra) fajkomplex (Baradat et al. 1991, részletesebben l. a faj ismertetésénél).

A módszerrel ismeretlen eredetű mesterséges állományok azonosítása is elvégezhető. A Pinus taeda esetében Squillace (1976) klasszikus munkája révén először sikerült klín típusú változatosságot biokémiai módszerekkel kimutatni (Mátyás Cs., 1986).

Fontos

A terpénanalízis elve

Mivel a terpének másodlagos anyagcseretermékek, ügyelni kell arra, hogy a mintavétel lehetőség szerint egyidőben, azonos korú egyedek azonos testtájáról történjék. Általában háncsszövetet használnak. Macerálás után a terpéneket pentánnal extrahálják, majd tisztítják. A gyanta illékony monoterpén-komponenseit gázkromatográfban választják szét 60—230 °C hőmérsékleten.

A terpénanalízis genotípusok azonosítására csak indirekt módon alkalmas. Felhasználását az életkor és a mintavételezési hely módosító hatása mellett ugyanis korlátozza az a körülmény, hogy a terpénanalízis során az egyes frakciók arányait, koncentrációját határozzák meg. Ezek az értékek egymással összefüggnek, azaz autokorreláció léphet fel. Ha pl. mindössze két terpénvegyület alkotja a vizsgált illóolajminta fő elemeit, koncentrációjuk nyilván szorosan össze fog függeni egymással. A genetikai elemzések csak frakcióarányokra, koncentrációkra támaszkodhatnak, mert a mennyiségi meghatározás az erős környezeti hatások miatt nem megbízható.

8. ábra - A 3-karén relatív koncentrációja (az összes monoterpén százalékában) a háncsszövetből kinyert gyantában, 732 Pinus maritima egyed adatai alapján (Baradat ét ál., 1995). A gyakorisági eloszlás bal sarkában jól elkülönülnek a C-/C- genotípusok. Az eloszlás többi része a C-/C+ és C+/C+ genotípusokat elegyesen tartalmazza

A 3-karén relatív koncentrációja (az összes monoterpén százalékában) a háncsszövetből kinyert gyantában, 732 Pinus maritima egyed adatai alapján (Baradat ét ál., 1995). A gyakorisági eloszlás bal sarkában jól elkülönülnek a C-/C- genotípusok. Az eloszlás többi része a C-/C+ és C+/C+ genotípusokat elegyesen tartalmazza


Az elemzés lényege, hogy a vizsgált egyedek adataiból képzett eloszlási görbén kell azonosítani azokat a koncentrációs határértékeket, amelyek - monogén átörökítést és két alléi hatását feltételezve - az egyes genotípusokat jellemzik. Az esetek többségében a +/+ vagy a -/- allélkombinációk elkülönülő értékeikkel felismerhetők (8. ábra). A módszer nehézsége a megfelelő határértékek kijelölésében van. Emellett kettőnél több alléi nem elemezhető. Amonoterpének egygénes öröklődését ellenőrzött keresztezésekkel (elsősorban Pinus fajok esetében) sikerült bizonyítani, ezt a géntérképezés eredményei is megerősítik (Baradat ét ál., 1995).

A terpének elemzése elsőként tette lehetővé erdei fákon az öröklésmenet ellenőrzését, monogén és pleiotróp öröklés kimutatását, ill. kapcsoltsági (linkage) kapcsolatok azonosítását (6. táblázat).

6. táblázat - Ellenőrzött keresztezésből kapott családok hasadási arányaiból meghatározott öröklésmenetek terpenoidokra Pinus maritima esetében(Baradat ét ál., 1991, módosítva)

Lokusz megnevezése

Kódolt terpéntípus

Monogén öröklődés

M

mircén

L

limonén

Pleiotróp öröklődés

C

3-karén

terpinolén

longifolén

a-longipinén

Ca

kariofillén

a-humulén

Kapcsolt öröklődés:

Független öröklődés:

C-M-L

r = 0,10 r=0,12

C-Lo, C-Ca, L-Lo


(r = rekombinációs ráta)

Izoenzimek

Ha abból indulunk ki, hogy – durva egyszerűsítéssel – a struktúrgének bázissorrendje meghatározza a létrejövő fehérjét, akkor a fehérjetermék, genetikai markerként, allélok azonosítására felhasználható. A fehérjék (proteinek) egy vagy több polipeptidláncból állnak, amelyeket aminosavak építenek fel.

A gabonafélék esetében a magban található tartalékfehérjék markercélú felhasználása széles körben alkalmazott módszer, pl. búzánál a glutenin, a kukoricánál a zein változatossága révén (részletes leírását l. Hajósné-Novák, 1999). Az erdészetben alkalmazásuk nem jelentős. Ugyanakkor széles körben használják a katalitikusan aktív fehérjéket, azaz az enzimeket. Az enzimek biokatalizátorként a szervezetben lejátszódó biokémiai folyamatokat segítik elő az aktiváláshoz szükséges energia csökkentésével.

A nukleotidsorrend változása a polipeptid aminosav-sorrendjének változását, ezzel magának az enzimnek a változását idézi elő. Amennyiben ezek a változások az enzim töltésének, molekulasúlyának vagy alakjának megváltozását eredményezik, úgy ezeket a különbségeket elektroforézissel ki lehet mutatni, mert az elektromos térben eltérő sebességgel vándorló molekulák elkülönülnek. Az elektroforétikus mobilitás („lassú”, „gyors” frakciók) különbségei így a kódoló DNS-szakasz különbségeit mutatják ki, és ezzel megvalósul a genetikus azon szándéka, hogy az összefüggéseket a DNS-lánchoz minél nagyobb közelségben tárja fel. Az izoenzimek ezáltal lehetővé teszik az allélok változatosságának közvetlen elemzését adott lokuszon, ami sokféle, korábban megoldhatatlan genetikai elemzésre ad módot.

Az elektroforézissel kimutatható enzimváltozatosságot emlősökben Hunter és Markert 1957-ben fedezte fel. A következő években kiderült, hogy az eljárás populációk genetikai vizsgálatára alkalmas, mivel az enzimizomérek markerként alkalmazhatók. Erdészeti alkalmazására már a hetvenes évek elején sor került, azóta igen nagy számú publikáció jelent meg; gyakorlatilag nincs olyan fontosabb fafaj, amely ne lenne tárgya széles körű vizsgálatoknak. Az erdészetben alkalmazott eljárásokkal és eredményekkel számos összefoglaló könyv foglalkozik (Paule, 1990; Hattemer et al., 1993).

Az enzimek öröklődése biparentális (azaz a két allél a két szülőtől származik), általában a sejtmagban található gének expresszálódásának termékei. A genom más régióihoz képest az enzimeket kódoló régiók változatossága nem nagy, ez a módszer használhatóságát korlátozza. Hátrány az is, hogy aránylag kevés enzim vizsgálható (az erdészetben általában 20-nál kevesebbel foglalkoznak). Másrészt viszont előny, hogy a vizsgált genetikai változatosság funkciója és adaptív jelentősége jobban értelmezhető, mint a nem kódoló szakaszok DNS-változatossága; a párosodási rendszer, a génáramlás, és a drift vizsgálatára, ill. kimutatására nagyon jól beváltak. Fel kell azonban hívni a figyelmet, hogy az elektroforetikus változatosság értelmezése csak akkor megbízható, ha az öröklésmenetet előzőleg ellenőrzött keresztezésekkel tisztázták.

Az enzimek elnevezése vagy a katalizált folyamat nevéhez (pl. észteráz: EST, peroxidáz – PRX), vagy pedig a kérdéses szubsztrátumhoz (pl. malát-dehidrogenáz: MDH) kapcsolódik, azaz ahhoz az anyaghoz, amelyre hat. A nagyszámú azonosított enzim szabványos rövid jelölése betűkombinációval, illetőleg a Nemzetközi Enzim Bizottság számkódjával történik (pl. MDH esetében 1.1.1.37).

Izoenzimnek (vagy izozimnek) nevezzük azokat az azonos funkciójú enzim-variánsokat, amelyek elektroforézissel elkülöníthetők. Az izoenzimek létrejötte egyetlen génben történt mutáció, vagy pedig génduplikáció révén létrejött, hasonló funkciójú gének aktivitásának köszönhető (utóbbi esetben enzimrendszerről beszélünk). Egy adott gén alléljai által meghatározott enzimvariánsokra az allozim (vagy alloenzim) fogalmát alkalmazzák. Az elektroforetikusan szétválasztott izoenzimek a gélen jellegzetes sávozottságot, zimogramot mutatnak előhívás után (9. és 10. ábra).

9. ábra - Egy pomází kocsánytalan tölgyes 10 egyedének zimogramja a PGI (foszfoglükóz-izomeráz) enzim B lokuszán, ahol összesen 8 alléi mutatható ki. A tíz genotípus ezek közül az l-es, 6-os és 8-as alléit hordozza. A PGI-B lokusz dimer, azaz két eltérő típusú enzimfehérjét kódol, ezért a hete-rozigóták esetében egy harmadik, „hibrid" csíkot is látunk. A homozigóták egyféle, erőteljesebb csíkot mutatnak (Borovics A. nyomán). Megj.: az alsó számok az allélkombinációt jelzik

Egy pomází kocsánytalan tölgyes 10 egyedének zimogramja a PGI (foszfoglükóz-izomeráz) enzim B lokuszán, ahol összesen 8 alléi mutatható ki. A tíz genotípus ezek közül az l-es, 6-os és 8-as alléit hordozza. A PGI-B lokusz dimer, azaz két eltérő típusú enzimfehérjét kódol, ezért a hete-rozigóták esetében egy harmadik, „hibrid" csíkot is látunk. A homozigóták egyféle, erőteljesebb csíkot mutatnak (Borovics A. nyomán). Megj.: az alsó számok az allélkombinációt jelzik


10. ábra - Az elektroforézis elve. Az extrahált, centrifugált növényi kivonatot a futtatógélen kialakított zsebekben helyezik el. A részecskék, molekulák a pozitív elektróda irányába vándorolnak. A fehérjeanyagok bomlásának megelőzésére a futtatást 4 °C-on végzik. A futtatás eredményét enzimspecifikus festéssel lehet láthatóvá tenni. Ugyanezt az elvet alkalmazzák a DNS-fragmentumok szétválasztásához is

Az elektroforézis elve. Az extrahált, centrifugált növényi kivonatot a futtatógélen kialakított zsebekben helyezik el. A részecskék, molekulák a pozitív elektróda irányába vándorolnak. A fehérjeanyagok bomlásának megelőzésére a futtatást 4 °C-on végzik. A futtatás eredményét enzimspecifikus festéssel lehet láthatóvá tenni. Ugyanezt az elvet alkalmazzák a DNS-fragmentumok szétválasztásához is


A legegyszerűbb esetben egy lokusz két alléltípusa kétféle fehérjeláncot határoz meg, a heterozigóta egyed emiatt kétféle enzimizomért, azaz izoenzimet állít elő. Monomer (egyetlen molekulaláncból álló) enzim esetén (pl. sikimát-dehidrogenáz, akonitáz) a homozigóta genotípusok egy, a heterozigóták pedig két sávos zimogramot produkálnak Dimer (két molekulából álló), ill. tetramer enzimek (pl. malát-dehidrogenáz) esetén ún. „hibrid” sávok is megjelennek (9. ábra). Itt jegyezzük meg, hogy az enzimvariáns nem feltétlenül egyetlen génhely terméke, a polimerek bizonyosan nem; az izomerek tehát nem feltétlen egyetlen lokuszt jelölnek.

Az izoenzimek alkalmazhatósága

Viszonylagos egyszerűsége miatt az izoenzim-analízist széles körben alkalmazzák a populációgenetikában, az ökológiai és evolúciós genetikában. Izoenzimekkel vált lehetővé az erdei fák párosodási rendszerének vizsgálata, a genetikai diverzitás értékelése populáción és fajon belül, valamint fajok között is. Követhetővé vált a természetes szelekció folyamata, de a mesterséges szelekció és a környezeti ártalmak hatása és következményei is.

A széles körű alkalmazhatóság az izoenzim-analízis számos további előnyéből adódik. Ezek többek között:

  • az izoenzim-expresszió aránylag független a környezeti hatásoktól és az életkortól is;

  • az izoenzimek öröklésmenete aránylag egyszerű és a kapott mintázat alapján viszonylag jól értelmezhető;

  • az elemzéshez szükséges mintanagyság csekély, így nagyszámú minta elemezhető egyidejűleg;

  • az alkalmazott elektroforézis-technológia egyszerű, és más genetikai markerezési eljárásokhoz képest nem túl költséges.

Az izoenzimek esetében az egyes gének alléljai kodominánsnak mutatkoznak. Ez lényeges előny a morfológiai tulajdonságokkal, de a terpén-markerekkel szemben is. A homo- és heterozigóták felismerése viszonylag egyszerű (l. a 9. ábrát). Számos enzimrendszert több gén kódol, ezek a génhatások a zimogramon egyidejűleg megfigyelhetők.

Az izoenzim-markerekkel kapott eredmények használhatóságának korlátai

Az értékeléskor figyelembe kell venni, hogy az enzimeket kódoló gének a genom expresszált részének is csak kis töredékét képviselik, és a kapott diverzitásadatok nem általánosíthatók a teljes genomra. Különösen nagy hibaforrást jelent, ha mindössze egy-két enzimrendszer vizsgálata alapján általános következtetéseket vonnak le, pl. a géndiverzitás mértékéről. Ismeretes, hogy a különböző enzimrendszerek változatossága eltérő mértékű. Míg egyes enzimek polimorfnak mutatkoznak, számos enzim változatossága csekély vagy teljesen hiányzik. Fás növényeknél ilyen a malát-dehidrogenáz (MDH). Emiatt minél nagyobb számú enzim elemzésére van szükség.

Az elektroforézissel kimutatható allozimatikus változatosság emellett nem tükrözi teljes mértékben az enzimet kódoló DNS-szakasz változásait sem. A genetikai kódszótár degenerált jellegéből adódóan a bázissorrend-változás nem jár feltétlen aminosav-változással: pl. a leucint hatféle eltérő kód kódolhatja. Az allozimek eltérései csak 30%-ban jelentenek olyan mértékű töltésváltozást, hogy az eltérések a standard labormódszerekkel kimutathatók legyenek (Bergmann, 1991). Előfordulhat, hogy eltérő enzimvariánsok egymást elfedik és emiatt a változatosság mértékét alábecsüljük. Az elmondottakon kívül azt is figyelembe kell venni, hogy a vizsgált enzimek élő szervezetből kivont aktív szerves anyagok. A kivonás, feldolgozás és az elektroforézis során számos olyan változás történhet, ami a fehérjeszerkezet megváltozásához, esetleg részleges felbomlásához vezethet. Mindezek miatt az elektroforézissel előállított zimogramokat genetikailag értelmezni nehezebb feladat, mint az a módszer leírásából sejthető.

DNS-markerek

Mind az anyagcseretermékek elemzése, mind az izoenzim-technika csak közvetett bepillantást enged az örökítő anyag változatosságába. A nyolcvanas években robbanásszerű fejlődést hozott a DNS-t hasító enzimek alkalmazása, valamint az a felfedezés, hogy a DNS-polimeráz enzim segítségével a DNS megfelelő szakaszai láncreakciószerűen, korlátlan mennyiségben másolhatók. Ezzel a genetikai vizsgálatok a DNS bázissorrendszintjén váltak lehetővé, és genetikai markerként a bázissorrendben beállt, akár egy bázispárnyi változást is fel lehet használni.

A DNS-markerek pontosságuk mellett más előnyöket is kínálnak. Az így feltárt változatosság sokkal szélesebb körű, mint az izoenzimeké, és nem függ a génexpressziótól. Nemcsak élő, hanem élettelen szövetből (pl. többszáz éves csontból) is kinyerhetők, könnyen tárolhatók, és nagyon kis mennyiségekre van szükség.

Növények esetében külön előny, hogy a biparentális eredetű sejtmag (nukleáris) DNS-e, továbbá az uniparentális eredetű mitokondriális és kloropasztisz-DNS más-más információkat szolgáltat.

Restrikciós enzimek (endonukleázok) alkalmazása

A molekuláris genetika egyik mérföldköve volt a 60-as évek végén az ún. restrikciós enzimek felfedezése. Ezek az enzimek képesek egy meghatározott, általában 4-6 bázispár hosszúságú DNS-szakasz felismerésére, és ott a kettős DNS-szál elhasítására. Mivel az adott bázissorrend a teljes DNS-szálon sokszor megismétlődhet, az enzim a DNS-t milliónyi szakaszra (fragmensre) hasítja. A szakaszok hossza az enzim által felismert bázissorrendtől és annak előfordulásától függ: ritka sorrendet felismerő restrikciós enzimek kevesebb, és hosszabb szakaszt állítanak elő – és fordítva. Az eltérő hosszúságú szakaszok elektroforézissel elkülöníthetők, hasonló elven, mint az izoenzimek.

A restrikcós enzimek alkalmazása révén a genetikai változatosság új formája vált elemezhetővé: a hasítási helyeken megnyilvánuló polimorfizmus (restriction fragment length polymorphism – RFLP). A kereskedelemben számos restrikciós enzim-készítmény kapható (pl. Ava I, Cfol, Hind III), amelyek természetesen eltérő polimorfizmust mutatnak (69., 70. táblázat).

A nyolcvanas évek elején ismerték fel, hogy a hasítással nyert szakaszok markerként felhasználhatók. A módszert az erdészeti genetikában is régóta alkalmazzák (Szmidt – Wang, 1991). Az izoenzimekkel azonosított struktúrgén-változatokkal ellentétben azonban a kapott DNS-szakaszok kódoló vagy nem kódoló szekvenciákat tartalmaznak, vagyis nem feltétlenül gének[7].

Polimeráz-láncreakció (PCR)

A hasító enzimek helyett a polimeráz-enzim funkcióját használja ki a PCR (polymerase chain reaction) módszer. Elve rendkívül egyszerű. A DNS-polimeráz-enzim felelős a DNS-szál megkettőzéséért, és segítségével egy kiválasztott szakasz lemásolása láncreakció-szerűen korlátlan számban megismételhető, azaz tetszőleges menynyiségű DNS-szakasz állítható elő. Egy hőre érzéketlen polimeráz-enzim, az ún. Taq-polimeráz felfedezése lehetővé tette az eljárás automatizálását, amely a molekuláris genetika technológiai áttörését eredményezte.

A polimeráz által másolandó DNS-célszakasz kiválasztásához primereket (ejtsd: prájmer) alkalmaznak. A primerek olyan rövid DNS-szakaszok, amelyek a DNS-célszakasz 5’ és 3’ végeinek bázissorrendjével komplementerek, és oda kapcsolódnak. Polimeráz-enzim jelenlétében a célszakasz lemásolása a primertől indulva történik (11. ábra). Az indító szakaszok közötti távolság (azaz a lemásolt fragmentum hoszsza) 100 és több ezer bázispár között lehet.

11. ábra - A polimeráz-láncreakció-ciklus elve. A ciklus ismétlődő lépései (b): denaturálás magas hőfokon, amikor a DNS-szálak szétválnak (D), az alkalmazott primerek tapadása, kapcsolódása (annealing, A), majd a DNS szakasz polimerizációja (extension, E). Az a) diagramm a szétvált tem-plátszálakon (TI, T2) ellentétes irányban meginduló polimerizációt mutatja. Az ismétlődő ciklusok során a DNS-szakasz exponenciális ütemben szaporodik (c) (Hoelzel - Dover, 1991 nyomán)

A polimeráz-láncreakció-ciklus elve. A ciklus ismétlődő lépései (b): denaturálás magas hőfokon, amikor a DNS-szálak szétválnak (D), az alkalmazott primerek tapadása, kapcsolódása (annealing, A), majd a DNS szakasz polimerizációja (extension, E). Az a) diagramm a szétvált tem-plátszálakon (TI, T2) ellentétes irányban meginduló polimerizációt mutatja. Az ismétlődő ciklusok során a DNS-szakasz exponenciális ütemben szaporodik (c) (Hoelzel - Dover, 1991 nyomán)


A létrejött kettős szálú fragmentumok újbóli másolásához azokat magas hőmérsékleten (95 °C) szét kell választani, majd hűtés után a primerkapcsolódás és a polimerizáció megtörténik.

A ciklus korlátlanul ismételhető, miközben a célszakasz mennyisége exponenciálisan növekszik. A váltakozó hőmérsékletű ciklusok előállításához automatikus készüléket fejlesztettek ki (thermocycler).

A PCR-módszernél általában a célszakasz mindkét végén alkalmaznak primert, de lehetőség van egyetlen primer felhasználására is. Ebben az esetben nem specifikus célszakaszt jelölnek ki, hanem a primer véletlenszerűen tapad és indít el polimerizációt a DNS megfelelő sorrendű pontjain.

Megfelelő primerek kiválasztásával elméletileg a DNS bármely régiója felszaporítható (amplifikálható). Az amplifikált szakasz markerként való alkalmazhatósága attól függ, hogy mennyire egyedi a kiválasztott szakasz.

A DNS-polimorfizmus elemzéséhez alkalmazott módszerek (Bordács Sándor)

A molekuláris genetikai elemzések során a kétféle enzimtechnikát (restrikciós és polimeráz) kombinálni is lehet. Az eljárásokat aszerint szokás csoportosítani, hogy PCR-alapúak-e vagy nem, továbbá, hogy véletlenszerűen amplifikáló primert használnak-e, vagy meghatározott célszakaszokat vizsgálnak. Ezen a helyen csak az erdészeti genetikában gyakrabban alkalmazott eljárások elvét adjuk meg.

Restrikciós (RFLP) markerek

Az RFLP (restriction fragment length polimorphism – restrikciós szakaszhosszúság polimorfizmus) markerek kodominánsak, azaz mindkét DNS-szál által kódolt szakasz kimutatható. A restrikciós (endonukleáz) enzimekkel emésztett fragmenseket elektroforézissel választják szét. Mivel rendkívül sok, eltérő hosszúságú DNS-szakasz van az elegyben, az elektroforézis nem eredményez világosan elkülöníthető sávokat, mint az izoenzimek esetében, ehhez külön jelölő DNS alkalmazása szükséges.

A Southern hibridizálás során az emésztőenzimmel kapott szakaszokat páratlan DNS-szálakra választják szét (denaturálják), egy szűrőpapírra viszik át, majd egy radioaktiv izotóppal jelölt, ugyancsak egyszálas DNS-szakasszal tesztelik (hibridizációs próba). Ez rövid, kb. 800 bp hosszúságú, meghatározott vagy véletlen sorrendű DNS- vagy RNS-minta. Homológ szakaszok esetén a minta a próbával hibridizál, azaz kettős szálat alkot. Fényérzékeny filmre helyezve, a szűrőpapír az izoenzimsávokhoz hasonló mintázatot produkál. (Izotópos jelölés helyett fluoreszcens festési eljárások is lehetségesek.)

A módszer hátránya, hogy nagy mennyiségű DNS-re van szükség, és az eljárás nem automatizálható. Aránylag drága és munkaigényes.

PCR-alapú markerek

Viszonylag olcsó és egyszerű eljárások. Az alkalmazott primertől függően a marker lehet szekvenciaspecifikus vagy véletlenszerű. Az előbbi ismert eredetű és funkciójú markereket, az utóbbi „névtelen” szakaszokat szolgáltat. Elektroforézissel csak a DNS-szakaszhossz eltérések mutathatók ki, a szekvencia-eltérések nem. Utóbbi kimutatására specifikus enzimek használhatók fel.

RAPD-technika (random amplified polimorphic DNA): a módszerhez tetszőleges sorrendű, általában rövid, 10 nukleotid hosszúságú, guanin és citozin bázisokban gazdag primereket alkalmaznak, az amplifikálás véletlenszerű, és általában a DNS nem kódoló szakaszain történik. A RAPD segítségével csak domináns markerek állíthatók elő. Megbízhatósága és ellenőrizhetősége a többi eljárásénál rosszabb, ez az egyszerűségéből származó előnyöket lerontja. A vizsgálatok többszöri ismétlésével a megbízhatóság jelentősen növelhető. A módszer egyedi szekvencia-eltérésekre érzékeny, emiatt egyedek (klónok) azonosítására és hibridizálás ellenőrzésére jól alkalmazható (12. ábra).

12. ábra - A PCR-alapú marker típusú, fajspecifikus DNS-fragmentumok alkalmasak a fekete nyár fajtisztaságának ellenőrzésére. Az ábra két szélén a DNS-szakaszok méretmeghatározására szolgáló standard „létra” látható. A négy minta balról jobbra: Populus nigra 'Thevestina' klón, P. nigra és P. deltoides fajú egyed, valamint egy P. euramericana hibrid klón. Jól látható a két fajt elkülönítő DNS-szakasz; a hibridben mindkettő megjelenik. További leírás a fekete nyár ismertetésénél található (Bordács S. felvétele)

A PCR-alapú marker típusú, fajspecifikus DNS-fragmentumok alkalmasak a fekete nyár fajtisztaságának ellenőrzésére. Az ábra két szélén a DNS-szakaszok méretmeghatározására szolgáló standard „létra” látható. A négy minta balról jobbra: Populus nigra 'Thevestina' klón, P. nigra és P. deltoides fajú egyed, valamint egy P. euramericana hibrid klón. Jól látható a két fajt elkülönítő DNS-szakasz; a hibridben mindkettő megjelenik. További leírás a fekete nyár ismertetésénél található (Bordács S. felvétele)


Mikroszatellit elemzés (SSR, simple sequence repeat – rövid, ismétlődő bázissorrend): ez a PCR-alapú módszer azoknak az ismétlődő, rövid (6-8 bázispárnál rövidebb) DNS-szakaszoknak az amplifikálásán alapszik, amelyek a magasabbrendű szervezetekben nagy számban fordulnak elő és jelentős változatosságot mutatnak. Egyszerű és megfelelő polimorfizmust eredményező eljárás. Nemcsak a nukleáris, hanem az organellum-DNS-ben is alkalmazható. Tekintettel arra, hogy a mikroszatellit-szakaszok a DNS-állomány legváltozatosabb részét képezik, a módszer genotípusok elkülönítése mellett rokonsági/leszármazási kapcsolatok feltárására is jól alkalmazható.

PCR-RFLP: újabban alkalmazott kombinált eljárás, amely során szekvencia (bázissorrend) specifikus primerekkel nagy, akár 10 kb hosszúságú fragmenseket állítanak elő PCR-rel, majd restrikciós emésztés után a kapott rövidebb szakaszokat elektroforézissel szétválasztják. Jól alkalmazható minden olyan esetben, ahol a hagyományos RFLP-eljáráshoz nem áll rendelkezésre elegendő mennyiségű DNS-minta. Elsősorban az organellum-DNS (kloroplasztisz-DNS) analízisek egyik gyakori, közepes költségigényű módszere.

AFLP (amplified fragment length polymorphism – amplifikált szakaszhossz-polimorfizmus): Az előbbihez hasonló, de gyakorlatilag fordított sorrendű PCR-alapú vizsgálat. A DNS-t először restrikciós enzimekkel emésztik, majd a feldarabolt DNS-láncok végéhez, a RAPD-nál alkalmazott primereknél hosszabb primereket kapcsolnak. Az eljárás domináns markereket szolgáltat. A hosszabb, ezáltal nagyobb biztonsággal kapcsolódó primerek, valamint a restrikciós enzimek specifikus kapcsolódása miatt az eredmények megbízhatósága és reprodukálhatósága kedvezőbb a RAPD-hoz képest, viszont bonyolultsága és drágasága sokat ront az alkalmazhatóságán. A populációkon belüli egyedi változatosság, ill. klónok homogenitásvizsgálatára jól alkalmazható.

Célszakaszok elemzése specifikus primerekkel: Ha a vizsgált faj(ok) genomja sok részletében feltárt, akkor a fajspecifikus szekvenciák ismeretében olyan primereket készíthetők, amelyek egyszerű PCR-amplifikációval faj (taxon) szerint felismerik és szelektálják az egyedeket. A specifikus primerek elegyét (subset) minden vizsgálati mintához hozzáadjuk, de az amplifikálás során csak a fajra specifikus primer képes kapcsolódni, így mindig csak az adott fajra jellemző szakaszok jelennek meg az elektroforézis során. Elsősorban rutinszerű teszteléseknél, hibridek vizsgálatánál van jelentősége, ahol a külső morfológiai bélyegek nem vagy csak nehezen alkalmazhatók a taxonómiai státusz megállapítására.

Szekvenálás (bázissorrend-meghatározás): a legpontosabb módszer

A DNS bázissorrendjében bekövetkező változások, illetve eltérések pontos elemzéséhez a kérdéses DNS-régiót szekvenálni kell. Jelenleg már automatizált módszerek állnak rendelkezésre, de egyelőre költséges eljárás, ezért populációbiológiai elemzésekhez alig használják. Mindenesetre a bázissorrend pontos kimutatása megszünteti azt a problémát, amely különösen az izoenzim-elemzésnél jelentkezik, azaz hogy különböző, de azonos vándorlási sebességű fehérjék nem különböztethetők meg. Ugyanez a nehézség a DNS-fragmentumok szétválasztásakor is felmerül.

A szekvenálás automatizált végrehajtása teremtette meg a lehetőséget a szerkezeti genom-analízisek gyors végrehajtásához, amelyek közül a 2001 elején befejezett emberi genom-program a leglátványosabb.

A DNS-szekvenálás új lehetőségeket nyitott meg a genetikai elemzésben: sokkal alaposabb leszármazás-elemzések váltak lehetővé nemcsak fajok és nemzetségek, hanem magasabb taxonómiai egységek esetében is. A bázissorrend (szekvencia) összehasonlítása az egyedek, populációk, fajok közötti genetikai különbségek kimutatásának legkifinomultabb eszköze.

Markerek erdészeti alkalmazási lehetőségei

Összességében megállapítható, hogy a biokémiai és molekuláris markerek – minden nehézség ellenére – sok területen valóban áttörést hoztak az erdészeti genetikában (l. Mátyás in: Hajósné-Novák, 1999). A továbbiakban néhány alkalmazási területet mutatunk be, amelyekre a későbbiekben még többnyire visszatérünk.

Az öröklődés elemzése

Az átörökítést szabályozó genetikai folyamatok megismeréséhez az ellenőrzött keresztezés az egyetlen igazán biztos lehetőség. Erdei fáknál a keresztezések végrehajtásának a technikai nehézségeken túl számos egyéb akadálya is van; a legtöbb faj esetében aránylag csekély számú utóddal kell megelégedni, emellett pl. az öntermékenyítésnek (amely egy rendkívül hatékony és fontos tesztelési forma) komoly akadályai vannak, mivel az erdei fák többnyire obligát idegentermékenyülők. A hosszú generációs idők miatt a keresztezéses elemzés továbbvitele több generáción át, azaz a pedigré-vizsgálat erdészetileg alig alkalmazható. Ezért a markerekre alapozott elemzés jelentősége nagy.

Ha az öröklésmenet egyszerű és könnyen felismerhető, a szülők markertípusából és az utódokban tapasztalható típusok gyakorisági eloszlásából az átörökítés mikéntjére megfelelő hipotézis állítható fel. Ha ismerjük a szülők genotípusát, az utódok genotípusainak Hardy–Weinberg képlettel számított megoszlása megadható. A ténylegesen megfigyelt megoszlás ettől rendszerint eltérően alakul. Matematikai statisztikai módszerekkel (χ2-teszttel, l. a 4. fejezetben a Hardy – Weinberg egyensúly ismertetésénél) lehetőség van annak eldöntésére, hogy a számított és a mért genotípus arányok közötti eltérés véletlen, vagy szignifikáns hatások következménye-e.

Genetikai elemzések haploid szövetek felhasználásával

Az erdei fák közül a nyitvatermők magjának tápszövete haploid, míg az embrió természetesen diploid. Az elemzés során tehát a diploid (2n) és a haploid (1n) szövetet is meg lehet vizsgálni. Ha az anya heterozigóta a kérdéses tulajdonságra, a haploid szövetben a gaméta-szegregációhoz analóg módon tanulmányozhatók a „haplotípusok” (13. ábra). Az embrió és a tápszövet összehasonlítása alapján az öröklődés módjára lényeges megállapítások tehetők anélkül, hogy keresztezéseket kellene végrehajtani, a vizsgálathoz mindössze szabad beporzású magra van szükség. A legtöbb enzim génlokuszát ilyen módon azonosították be a fenyőfajok esetében. A rendkívül hatékony módszer alkalmazhatóságát Bartels (1971) igazolta.

13. ábra - Egy A1A2 genotípusa nyitvatermő (fenyő) egyed szabad beporzásból nyert magjainak allé-likus viszonyai. Apárosodásban résztvevő pollen-donorok között az A3 alléi is előfordul. A diploid nő-virág (a) egy termőlevele beporzóit (b). A haploid tápszövet (d) haplotípusa a mendeli szabályokkal analóg módon csak az Al vagy A2, a diploid embriók (c) egy része viszont az A3 alléit is tartalmazza (Mátyás Cs., eredeti)

Egy A1A2 genotípusa nyitvatermő (fenyő) egyed szabad beporzásból nyert magjainak allé-likus viszonyai. Apárosodásban résztvevő pollen-donorok között az A3 alléi is előfordul. A diploid nő-virág (a) egy termőlevele beporzóit (b). A haploid tápszövet (d) haplotípusa a mendeli szabályokkal analóg módon csak az Al vagy A2, a diploid embriók (c) egy része viszont az A3 alléit is tartalmazza (Mátyás Cs., eredeti)


Hasonló jelenség használható egyes rovarcsaládok, így a hártyásszárnyúak esetében is, ahol megtermékenyítetlen tojásból haploid (homozigóta) egyedek fejlődhetnek ki, amelyek hím ivarúak (Hattemer et al., 1993).

DNS-markerek alkalmazási lehetőségei az erdészeti taxonómiában és származás-azonosításban (Bordács Sándor – Mátyás Csaba)

Származási körzetek azonosítása organellum DNS-sel

A legutóbbi időkig a citoplazma organellumaiban található és uniparentálisan (egyetlen szülő révén) átörökített genetikai információ elemzése nem volt lehetséges. A nukleáris DNS-hez képest egyszerűbb vizsgálhatóság és a génáramlásban betöltött különleges szerep miatt a citoplazmatikus vagy organellum DNS felhasználása az erdészetben elég széles körű az infraspecifikus genetikai mintázatok elemzésére.

Az organellum DNS vizsgálatának jelentőségét az erdészeti genetika számára az adja, hogy a génáramlás mértéke a pollen ill. a mag esetében eltérő. A pollen migrációs távolsága közismerten nagy, ugyanakkor a mag terjedőképessége viszonylag korlátozott. A paternálisan örökített organellumallélok elterjedtsége ezért széles körű, míg az anyai úton örökített allélok csak lényegesen kisebb területen belül mutatnak azonosságot. A sejtmag DNS-ében kódolt allélok igen hatékony génáramlásával szemben tehát a maternális öröklés helyi mintázatok fennmaradását teszi lehetővé. Ezáltal az organellum-DNS markerek azon kevés genetikai marker közé tartoznak, amelyek potenciálisan lehetővé teszik kisebb térségek populációinak azonosítását, azaz a szaporítóanyag származásának ellenőrzését. Természetesen ennek előfeltétele, hogy a kérdéses populációk valóban autochtonok legyenek. Jó példa erre a szlavón tölgy (Qu. robur ssp. slavonica). A XIX. század második felétől kezdve a szlavón tölgyet mint különösen értékes erdészeti származást sokfelé ültették Európában, elsősorban azonban az akkori magyar országhatárokon belül. A több mint 100 éves ültetett állományokat vizsgálva mindenütt 3-4, a horvátországi populációkra jellemző haplotípus mutatható ki (Bordács et al., 2002).

Kloroplasztisz-markerek alkalmazása az őshonosság ellenőrzésére

A tölgyek esetében az őshonosságot indikáló egyik legjobb bélyeg a populáción belül azonos cpDNS-haplotípus (Petit et al., 1993). A mesterséges erdősítések során általában idegen génkészletű és vegyes szaporítóanyag kerül a helyi, természetes populációk helyére, ami cpDNS típusuk eltérésében megmutatkozik. Az alföldi őshonosnak tartott maradványtölgyesek esetében szinte egyetlen lehetőség ez a módszer a populációk származásának ellenőrzésére. A természetvédelmi szempontból értékesnek tartott kerecsendi és újszentmargitai lösztölgyesek vegyes, míg pl. a nagykőrösi és albertirsai homoki tölgyesek elég homogén mintázatot mutatnak (Bordács et al., 2002), megkérdőjelezve ezzel az előbbiek autochtonitását.

Tölgytaxonok azonosítása nukleáris DNS-markerekkel

A kocsányos és kocsánytalan tölgy faji elkülönülése sem allozimatikus, sem kloroplaszt – DNS differenciálódás alapján nem látszik nagymértékűnek. A nukleáris (sejtmagban található) DNS vonatkozásában sem találtak olyan genetikai markert, amely a tölgyek fajazonosítását egyértelműen lehetővé tenné, bár ilyen utalások az irodalomban találhatók (pl. Kreike et al., 1991; Dumoulin – Lapégue et al., 1997). Legújabban Bordács és Burg (1997) kísérelték meg a kocsányos tölgy, azon belül a szlavón tölgy azonosítását sejtmag RAPD-markerek segítségével. A viszonylag jól elkülöníthető, de szűk földrajzi elterjedést mutató szlavón tölgy (Qu. robur ssp. slavonica) és a hasonlóan magas ártéri fekvésű beregi, kárpátaljai Qu. robur populációkban 20–71%-os gyakorisággal unikális RAPD-marker fordul elő, amely marker sem a Qu. robur más populációiban, sem más, vizsgált tölgytaxonban nem található (Bordács – Burg, 1997). Bár csak kezdeti eredményekről van szó, nem zárható ki, hogy a markerek szelekciós hatást jeleznek.

Introgresszió, hibridizálódás vizsgálata

A természetes hibridizálás (introgresszió) mellett egyre nagyobb figyelmet kap az antropogén hatások nyomán jelentkező, nem kívánatos fajkereszteződés. A hibridizálás egyedül morfológiai alapon való eldöntése még képzett taxonómusok számára is nehéz feladat. A fajspecifikus genetikai markerek segítségével az introgresszió ténye egyértelműen igazolható. Pl. PCR marker segítségével sikerült kimutatni az amerikai fekete nyár introgresszióját az európai fekete nyár génkészletébe (Heinze, 1997, részletesen l. a fafaj leírásánál). A kloroplasztisz-DNS markerekkel bizonyítható az európai fehér tölgy szekció fajai (Qu. petraea, robur és pubescens) közötti génáramlás (Finkeldey – Mátyás, 1999; Bacilieri et al., 1996), vagy a délkelet-ázsiai Pinus fajok hibridizálása (Wang – Szmidt, 1993).

Egyedi genotípus (klón) azonosítása

Egyedek, illetve vegetatív szaporítással előállított klónok elkülöníthetősége és azonosítása a legtöbb esetben a viszonylag olcsó és egyszerű RAPD analízissel megoldható. A bonyolultabb és drágább genotípus-azonosítást lehetővé tevő DNS-markerek, mint például a mikroszatellit- vagy AFLP-markerek felhasználását az utóbbi évek technikai fejlődése tette lehetővé. Sok esetben felhasználásuk új, pontosabb lehetőséget teremt, de ismeretlen vagy kevésbé feltárt genomú fajok esetében a RAPD-vizsgálat gyors és kielégítő eredményeket nyújthat. A hazai erdészeti gyakorlatban alkalmazott akác klónfajták és fajtajelöltek elkülönítésére, katalogizálására a RAPD-markerek jól beváltak (Major et al., 1998).

Törjék és mtsai (2001) nemesnyár fajták azonosításának lehetőségét vizsgálták meg RAPD módszerrel. A 40 kipróbált primer közül 35 esetében találtak polimorfizmust a klónok között. A fajszintű elkülönítéshez általában egyetlen primer elegendő. Az azonos fajkombinációból előállított hibridek (pl. P. trichocarpa × P.deltoides) elkülönítéséhez több, általában négy primer alkalmazása szükséges.



[6] Az egyszerűség kedvéért a két markertípust sokszor együtt értik molekuláris marker alatt.

[7] A molekuláris genetikai irodalomban meghonosodott az azonosított DNS-szakaszok „lokusz"-ként való megnevezése. Világosan látni kell, hogy ez esetben általában nem génekről van szó!