Ugrás a tartalomhoz

Genetikai variabilitás a növénynemesítésben

Hajósné Dr. Novák Márta

Mezőgazda Kiadó

2.3. A kukorica tartalékfehérjéje, a zein

2.3. A kukorica tartalékfehérjéje, a zein

A kukorica tartalékfehérjéje, amelyet Osborne (1987) zeinnek nevezett, glutaminsavban, prolinban, leucinban és albuminban gazdag, de az esszenciális aminosavak közül lizinből és triptofánból kevés található benne.

A zein az endospermiumban szintetizálódik a megtermékenyülés utáni kb. 15 naptól, és a riboszómák szintetizálják a durva endoplazmás reticulumban (RER). A szintézist egy 1–2 kD molekulatömegű szignál peptid indítja. Ez átjuttatja a szintetizálódott molekulákat a membránon, majd kivágódik, a molekulák pedig a membrán belsejében elhelyezkedve létrehozzák a RER-hez kötött fehérjetestet.

2.3.1. A zeinek osztályozása és genetikai szerveződése

A zeinek SDS-PAGE elválasztása után 27 kD és 10 kD molekulatömegű polipeptideket kapunk. Szokatlan szerkezetű fehérjék, és a gélelektroforézis során a molekulatömegük alapján várhatónál gyorsabban vagy lassabban vándorolnak. Másrészt alkoholos oldószerekben az oldószer természetétől függően számtalan zein frakcióra bomlanak, ezért többféleképpen osztályozzák őket:

  • az SDS-PAGE után relatív mobilitás alapján (Wilson 1991),

  • az oldhatóság alapján (Esen, 1987),

  • a fehérjék szerkezete alapján (Larkins és mtsai, 1989).

A fehérjék szerkezete alapján α-, β-, γ- és δ-zeineket különböztetünk meg.

Az α-zeinek alkotják az összes zein kb. 70%-át. 19 kD és 22 kD molekulatömegű fehérjék, amelyek 210–245 aminosavból állnak, 25% glutamint, 20% leucint, 15% alanint és 11% prolint tartalmaznak. Lizin egyik α-zeinben sem található. A többi zein frakciótól legjobban azzal különböztethetők meg, hogy a fehérje központi részében 20 aminosavból álló, tandem ismétlődésű peptidek vannak. A 22 kD és a 19 kD molekulatömegű sávot izoelektromos fókuszálással (IEF) vagy alacsony pH-jú elektroforézissel számos alkotórészre lehet bontani.

A β-zeinek 14 kD molekulatömegűek, 160 aminosavból állnak és az összes zeinnek csak 10%-át alkotják. Az α-zeineknél kevesebb glutamint (16%), leucint (10%) és prolint (9%) tartalmaznak. Jelentősen nagyobb viszont a metionin (7%) és a cisztein (4%) tartalmuk. IEF-fel sok egyedi polipeptidre bonthatók.

A γ-zeinek csoportjába 27 kD és 16 kD molekulatömegű fehérjék tartoznak. Az előbbiek az összes zeinfrakció 20%-át, az utóbbiak pedig kevesebb mint 5%-át alkotják, és 164–180 aminosav komponensük van. A 27 kD molekulatömegű -zeinek ciszteinben gazdagok (7%), és kivételesen sok prolint (25%) tartalmaznak. A nagy prolintartalmat az NH2 láncvégen lévő hexapeptid ismétlődések (PPPVHL) okozzák. Ebből a tandem ismétlődésből 8 kópia található a 27 kD molekulatömegű és 3 kópia a 16 kD γ-zeinekben. Valószínűleg részben ez okozza a molekulatömegbeli különbséget.

A δ-zeinek kisméretű fehérjék, csak 130 aminosavból állnak. Molekulatömegük 10 kD. Az összes zeinnek kevesebb, mint 5%-át alkotják. Sok kéntartalmú aminosavból állnak (7% metionin, 4% cisztein), és így fontos kénforrást jelentenek a csíra számára.

Egyes szerzők az α-zeineket kódoló gének számát száznál többre becsülik, és néhányról azt feltételezik, hogy pszeudogén. Zein géneket ezideig a 4., a 7. és a 10. kromoszómán térképeztek; a 4. és a 7. kromoszómán lévők struktúrgének, a 10. kromoszómán pedig egy regulátorgén van. A Zp1, a Zp2 és a Zp3 gének csak együtt expresszálódnak vagy nem expresszálódnak. Az α-zeinek öröklődését tanulmányozva azt találták, hogy a hibridekben valamennyi szülői zein mintázat jelen van, de új zeinek nincsenek. Southern hibridizációval kimutatták, hogy a 19 és a 22 kD molekulatömegű fehérjéket kis multigén családok kódolják. Rubenstein és Geraghty (1986) a zein multigén családot négy alcsaládra bontják. A négy alcsaládban (SF1, SF2, SF3, SF4) a zeinek teljes aminosav-szekvenciáját 4 régióra lehet osztani.

Más szerzők szerint (Thompson és mtsai, 1992, Pedersen és mtsai, 1986) a 22 kD α-zeineket 25, a 19 kD molekulatömegűeket pedig 50 gén határozza meg. Ezeken kívül olyan mutáns géneket (opaque és floury) is térképeztek, amelyek recesszív alléljai gátolják a zein szintézisét, ezért a szemben növekszik a lizintartalom. Mindkét mutáns gén alléljeinek hatására a kukorica endospermiuma lágy, lisztes konzisztenciájú lesz. Az o1, o2, o5, o6 és o7 opaque gének térképhelye a 4., a 7. és a 10. kromoszómán, a floury géneké (fl1, fl2 és fl3) pedig a 2., a 4. és a 8. kromoszómán van. Az o9, o10, o11, o12 és az o13 gének lokalizációja még nem ismert, és nem mindegyik opaque és floury génnek ismert a genetikai kölcsönhatása sem. Általában additíven hatnak vagy episztatikusak. Pl. az o2 additív az o6-tal és az o7-tel, és elnyomja (episztatikus) az fl2-t. A mutáns gének közül csak az o2 zeinszintézisre gyakorolt hatása ismert. Motto és mtsai (1988), Schmidt és mtsai (1990) valamint Lohmer és mtsai (1991) az o2 gént transzpozonnal jelölték, majd klónozták. Megállapították, hogy az o2 gén egy leucin cipzár-típusú transzkripciós regulátorfehérjét kódol, amely kapcsolódik a 22 kD α-zein gének promotereihez, és így azok átíródnak. Az α-zeineket kódoló gének közül néhányat már klónoztak és szekvenáltak.

A haploid genomban az α-zein géneknek 100 kópiája van jelen. A triploid endospermium sejtekben tehát 300-ra becsülhető az α-zein gének száma. A β-, γ- és δ-zeineket valószínűleg olyan gének kódolják, amelyek genomonként csak egy vagy két kópiában vannak jelen.

2.3.2. Polimorfizmus és heterogenitás a zeinmintázatban

A zeinmintázatban polimorfizmust először Turner és mtsai mutattak ki 1965-ben. Ez a polimorfizmus adódhat egyrészt a homozigóta egyedek magvaiból nyert prolamin frakció különböző összetételéből, másrészt származhat abból, hogy az elválasztható komponensek száma függ az alkalmazott módszertől és a hibridtől is. A prolamin komponensek eltérő elektroforetikus sajátosságaik miatt szülői genotípustól függően hibridenként változhatnak.

A zein-polimorfizmus többségét poszttranszlációs modifikáció okozza. Righetti és mtsai (1977) a megfigyelt zein-heterogenitást részben in vivo deaminációból származtatják. Különböző zein IEF-mintázatú kukoricavonalak reciprok keresztezésének eredményeiből arra lehet következtetni, hogy az IEF-sávok additív módon működő struktúrgén rendszernek felelnek meg.

Mivel a zeinmintázatot a környezeti tényezők nem befolyásolják, a zein-polimorfizmussal beltenyésztett kukoricavonalak és -hibridek genetikai azonosságát vagy különbözőségét lehet kimutatni (1. ábra). Viszont azt a teljes genetikai különbözőséget, amely alapján az agronómiai teljesítmény (pl. heterózis) pontosan előrejelezhető, ezzel a módszerrel sem lehet feltárni.

1. ábra - Beltenyésztett kukorica vonalak és hibridjeik zein mintázata ♀az anya vonal mintázata, ♂ az apa vonal mintázata (drzewiecki, 1996)

Beltenyésztett kukorica vonalak és hibridjeik zein mintázata ♀az anya vonal mintázata, ♂ az apa vonal mintázata (drzewiecki, 1996)


Wilson (1987) az alábbi módszereket tartja alkalmasnak a zein-polimorfizmus kimutatására:

  • SDS-PAGE (molekulatömeg alapján),

  • IEF (a sáv helyzete alapján),

  • savas PAGE karbamid jelenlétében,

  • RP-HPLC (fordított fázisú, nagy felbontóképességű folyadék-kromatográfia),

  • kapilláris gélelektroforézis,

  • aminosav komponensek alapján történő molekulatömeg-meghatározás,

  • zeint befolyásoló regulátorgének (pl. o2),

  • zein struktúrgének térképezése,

  • zein cDNS klónozása.

Bietz (1983) módszere, az RP-HPLC, a fehérjéket – és így a zeint is – a felszíni hidrofób csoportok alapján bontja részeire. Ezzel a technikával a heterogén zeint több frakcióra lehet bontani, mint bármely más kromatográfiás vagy elektroforetikus módszerrel. Utóbbi két módszert úgy kombinálják, hogy először a zeint HPLC-vel, majd IEF-fel frakcionálják. A 2. ábrán egy zein HPLC-mintázatot láthatunk.

2. ábra - Kukoricavonalak és -hibridek zein HPLC mintázata

Kukoricavonalak és -hibridek zein HPLC mintázata