Ugrás a tartalomhoz

Genetikai variabilitás a növénynemesítésben

Hajósné Dr. Novák Márta

Mezőgazda Kiadó

3.2. Az izoenzim analízisek alkalmazásának lehetőségei

3.2. Az izoenzim analízisek alkalmazásának lehetőségei

Az izoenzim analíziseket számos célra alkalmazhatjuk: taxonómiai besorolásra, a génexpresszió tanulmányozására, a különböző eredetű genomokat hordozó fajok genomösszetételének jellemzésére, egy populáció molekuláris polimorfizmusának meghatározására, a nemesítési alapanyagok genetikai azonosságának vagy különbözőségének megállapítására, az elit beltenyésztett vonalak közötti rokonsági viszonyok tisztázására, a kívánt genotípusok kiválasztására a szelekció során, az ön- vagy idegentermékenyülés mértékének meghatározására, az izoenzimeket kódoló génekkel azonos kromoszómán elhelyezkedő rezisztenciagének kimutatására, a haploidok előzetes detektálására, a szomaklonális és gametoklonális variabilitás kimutatására, a hagyományos vagy új módszerrel bejuttatott idegen gének kimutatására, a fajtatisztaság vizsgálatára, a fajta-azonosításra és a fajtavédelemre.

A felsorolt alkalmazási terület mindegyike fontos. Ezek közül szeretnénk kiemelni a biokémiai géntérképek készítését különböző növényfajoknál, amelyeket genetikai eredetű polimorfizmus felmérése és jellemezése után állítottak össze. A genetikai analízisek tanúsága szerint az enzim struktúrgének legalább harmada polimorfizmust mutat, és ez még alulbecsült értéknek tekinthető, mert a kimutatási módszerek korlátai nem teszik lehetővé az enzimek teljes körű elemzését. Kodomináns öröklődésük és a génkölcsönhatások módosító szerepének hiánya miatt rendkívül alkalmasak kapcsoltsági géntérképek összeállítására. Azokban a fajokban, amelyekben sok morfológiai bélyeg már ismert térképhelyű, a klasszikus hárompontos térképezési eljárással az enzim izoformák génjei is meghatározhatók. Így állították össze a kukorica és a paradicsom biokémiai géntérképét is. Az enzimeket kódoló lókuszok térképezését a növények körében gyakori aneuploid formák is segítik. A hexaploid búza (Triticum aestivum) nulli-mono-triszóm stb., sőt diteloszóm vonalai számos enzim struktúrgénjének elhelyezését tették lehetővé nemcsak a kromoszóma, hanem a kar megjelölésével is. A kapcsoltsági térképek ismeretében közvetve tudunk szelektálni valamilyen gazdaságilag fontos tulajdonságra. Mintegy 300 féle növényi izoenzimet ismerünk, azonban csak mintegy 50-nek határozták meg a térképhelyét. Izoenzim-kapcsoltságot pedig elsősorban a kvalitatív tulajdonságok, pl. betegségellenállóság, hímsterilitás között sikerült ezideig kimutatni (2. táblázat).

2. táblázat - Izoenzím lókuszokkal kapcsoltan öröklődő tulajdonságok

Jelleg

Növényfaj

Izoenzim gén

Fonálféreg rezisztencia (Mi)

paradicsom

Aps-1

Bab sárga mozaikvírus rezisztencia (Mo)

borsó

Pgm-p

Hímsterilitás (ms-10)

paradicsom

Prx-2

Inkompatibilitás (S)

alma

Got-1

Sárga mozaikvírus rezisztencia (Ym)

árpa

Est-1, Est-2, Est-4

Rozsdarezisztencia (Rph-11)

árpa

Acp-3


Az izoenzimeknek a gyakorlat szempontjából szintén fontos alkalmazási területe a fajtatisztaság ellenőrzése. Erről a területről két példát mutatunk be.

Olajnövényünk, a napraforgó egyike a legnagyobb területen termesztett szántóföldi növényfajoknak. Ma már kizárólag hímsteril alapon előállított két- vagy háromvonalas hibrideket termesztünk. A nem szakszerűen végzett vetőmag-előállítás következtében az F1 nemzedékben a hibridek mellett megjelennek az öntermékenyülésből vagy vonalon belüli megporzásból származók is. Ez heterogén állományt és terméscsökkenést okoz.

Az ön- és a vonalon belüli megporzás mértékét hagyományosan minden vetőmagtételből egy bizonyos mennyiségű magot elvetve a morfológiai tulajdonságok alapján a nem hibrid egyedek százalékos arányából állapítják meg. Ez az ún. kitermeltetési módszer azonban hosszadalmas és földterületet is igényel.

Az idegen egyedek arányát sokkal rövidebb idő alatt meg tudjuk határozni a csíranövények izoenzim mintázata alapján. Ehhez azonban olyan izoenzim lókuszokra van szükség, amelyek a szülőkben eltérő allélesek.

H. Nagy és mtsai különböző napraforgó hibridek fajtatisztaságágát vizsgálták izoenzim elemzés segítségével (nem közölt adatok). Olyan izoenzimrendszernek, amely a szülővonalakban és a hibridekben eltérő mintázatot (polimorfizmust) mutat, a vizsgált izoenzim rendszerek közül a négyhetes csíranövények legidősebb leveléből izolált peroxidáz bizonyult. Megállapították, hogy a vizsgált vonalakban és hibridekben a kimutatható peroxidázokat 2 lókusz 2 allélja határozza meg. Az egyes lókuszoknak megfelelő allélikus enzimek két mobilitási zónában helyezkedtek el, mindkét zónában allozimekkel együtt. A tiszta vonalú szülői forma kétsávos, mindkét zónában egy-egy aktív sávval (8a ábra). A kiváló vonalakból származó F1 hibridet a 8c ábrán látható négysávos additív kép jellemezte. A szülői vonalak heterogenitásából (8b ábra) adódóan a különböző hibridek változatos képet mutattak, variabilitásuk az enzimmintázat alapján számszerűsíthető volt. A peroxidáz izoenzim analízis eredményeinek és a kitermeltetés adatainak (növénymagasság, virágzási idő stb.), összehasonlításából kitűnt, hogy a peroxidáz enzimrendszer alkalmas az F1 hibridek genetikai tisztaságának jellemzésére. A levélben képződő peroxidázok szintézisét szabályzó két lókusz allélformái a napraforgó izoenzimek genetikájában újdonságot képviselnek.

8. ábra - Napraforgó levél peroxidázok mintázata szülő (a, b) és az Fx hibridben (c) (H. Nagy és mtsai, nem közölt adatok)

Napraforgó levél peroxidázok mintázata szülő (a, b) és az Fx hibridben (c) (H. Nagy és mtsai, nem közölt adatok)


A kukoricának két-, három- és négyvonalas hibridjeit termesztjük. A vetőmag-előállítás kézi vagy gépi címerezéssel történik. A szakszerűtlen idegenelés, a pontatlan címerezés, a fattyak visszahagyása, az izolációs távolság be nem tartása öntermékenyülést, vonalon belüli megporzást, illetve más fajtával történő beporzást okoz. Ennek mértékét hagyományos módon kitermeltetéssel állapítjuk meg, de itt is lehetséges az izoenzim-analízis alkalmazása. A helyzet egyszerű, ha kétvonalas (SC) hibridről van szó, mert ha a szülők különböző allélra voltak homozigóták, akkor az F1 nemzedékben – attól függően, hogy az enzim monomer vagy dimer szerkezetű – minden egyednek a heterozigótákra jellemző két- vagy háromsávos mintázatot kell adnia. A vetőmag-előállítási hibát az anyai homozigóta mintázat vagy elégtelen izolációs távolság esetén az idegen apa eltérő mintázatának megjelenése mutatja.

Mint említettük, a kukorica ADH1 izoenzimjének gyors- (Adh1-F) és lassú (Adh1-S) elektroforetikus mobilitású alegységét egy lókusz két allélja kódolja. Mivel az enzim dimer szerkezetű, a két különböző allélra homozigóta egyed keresztezéséből származó utódban háromsávos mintázatot kapunk (4b ábra). Ennek alapján az idegen egyedek százalékos arányának megállapításához a gél lapokon csak azt kell megszámolni, hogy az összes szemből hánynak volt egysávos, homozigóta mintázata.

A három- vagy négyvonalas hibridek esetében ennek pontos arányát nem lehet megállapítani, mert itt a hasadás miatt számíthatunk homozigóta egyedek megjelenésére. Ha nem kapjuk meg a szülői vonalakat – mint ahogy az leggyakrabban előfordul -, akkor végig kell gondolni, hogy a hasadás miatt mennyi és milyen mintázat várható. Ugyanis akkor vetőmag-előállítási hibára valamelyik homozigóta forma vártnál nagyobb gyakoriságából következtethetünk. A 3. táblázatból látható, hogy TC hibrid előállításakor az ADH1 izoenzim vonatkozásában nyolc féle variáció lehetséges a szülők genotípusától függően. Ha a keresztezésben résztvevő mindhárom szülő ugyanarra az allélre homozigóta, akkor az F2 nemzedék egyedei is ugyanarra az allélre homozigóták (1. és 2. eset). Legkönnyebb a vetőmag-előállítási hiba kimutatása a 3. és a 4. esetben, amikor az egyszeres mindkét szülővonala azonos allélre homozigóta, így az F1 is homozigóta. Ha erre az SC anyára egy másik allélre homozigóta apával keresztezünk, akkor a végtermék 100%-ban heterozigóta lesz. Az 5–8. esetekben, amikor az anyai egyszeres Adh1-FS heterozigóta, bármelyik homozigóta apával végezzük a keresztezést, az utódnemzedékben a hasadás miatt akkor is megjelenik a homozigóta mintázat, ha nem történt címerezési hiba.

3. táblázat - Háromvonalas (TC) kukoricahibridek lehetséges alkohol dehidrogenáz-1 (Adhl) mintázatai a szülők genotípusától függően (LELKES és HAJÓS-NOVÁK nem közölt adatok)

Sorszám

Anyai egyszeres (SC)

F1 hibrid genotípusa

Apa vonal genotípusa

TC hibrid (F2) genotípusa

anya vonal genotípusa

apa vonal genotípusa

1

FF

FF

FF

FF

Mind FF

2

SS

SS

SS

SS

Mind SS

3

FF

FF

FF

SS

Mind FS

4

SS

SS

SS

FF

MindFS

5

FF

SS

FS

SS

50% FS + 50% SS

6

SS

FF

FS

SS

50% FS + 50% SS

7

FF

SS

FS

FF

50% FS + 50% FF

8

SS

FF

FS

FF

50% FS + 50% FF


FF = gyors allélra homozigóta, SS = lassú allélra homozigóta, FS = heterozigóta

A 9. ábrán a kukorica Adh1 gén és a centromeron közötti crossing over eredménye látható. Egy scutellumban Adh1-FFFS triplex heterozigóta mintázatot mutató tetraploid kukorica növényt öntermékenyítettünk, és a csövön valamennyi szem pajzsocskájában megnéztük az ADH1 izoenzimmintázatot. Autotetraploid szinten az említett genotípusú növény öntermékenyítése után háromféle feno-/genotípus várható (FFFF, FFFS, FFSS) 1:2:1 arányban. A gél lapokon látható negyedik, lassú allélra homozigóta (SSSS) mintázatot csak crossing over és kettős redukció hozhatta létre (Hajós-Novák és mtsai, 1994/a).

9. ábra - Crossing over kimutatása tetraploid kukoricaszem scutellumának ADH1 izoenzim mintázata alapján. A nyíllal jelzett SSSS genotípus triplex genotípusa egyed öntermékenyítése után csak crossing over eredményeként jöhetett létre. (Hajós-Novák és mtsai, 1994/a)

Crossing over kimutatása tetraploid kukoricaszem scutellumának ADH1 izoenzim mintázata alapján. A nyíllal jelzett SSSS genotípus triplex genotípusa egyed öntermékenyítése után csak crossing over eredményeként jöhetett létre. (Hajós-Novák és mtsai, 1994/a)


Az izoenzim markerek előnyei összefoglalva az alábbiak:

  • kodomináns allélexpresszió,

  • nincs episztatikus kölcsönhatás,

  • környezeti tényezők hatására ritkán változnak meg,

  • a különböző lókuszok alléljai jól megkülönböztethetők,

  • az allélikus különbségek elektroforetikus mobilitásbeli különbségként detektálhatók,

  • egyszerűen, gyorsan és olcsón vizsgálhatók.

Az izoenzim markerek hátrányai:

  • kevés a térképezett izoenzim lókusz,

  • a szűk genetikai bázisú elit beltenyésztett anyagokban kevés a polimorf lókusz,

  • nem minden DNS szinten bekövetkező változás detektálható fehérje szinten is.