Ugrás a tartalomhoz

Genetikai variabilitás a növénynemesítésben

Hajósné Dr. Novák Márta

Mezőgazda Kiadó

4.2. A PCR-technikán alapuló módszerek

4.2. A PCR-technikán alapuló módszerek

4.2.1. A polimeráz láncreakció (PCR) elve

A polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction), amelyet K. B. Mullis talált fel 1985-ben, in vitro módszer, amellyel kromoszomális vagy klónozott DNS (cDNS) célszekvenciákat sokszorozhatunk meg (amplifikálunk) enzimatikus úton, hőstabil DNS-polimeráz enzim (Taq polimeráz) segítségével, lánckezdő oligonukleotidok (primerek) jelenlétében, a hőmérsékletet gyorsan és pontosan változtató készülékben (thermocycler). A DNS-fragmentumok enzimatikus felszaporítása egy vagy két olyan oligonukleotid primer felhasználásával történik, amely(ek) a célszekvenciák mindkét fonalának 5’ végével komplementerek. Az egyszálú templátról a DNS polimeráz a primertől kiindulva 5’–3’ irányban komplementer szálat szintetizál. A primer kapcsolódási pontja specifikus, így eltérő kromoszómális szekvenciasorrend esetén eltérő nagyságú DNS-fragmentumok képződnek, amelyek agarózgélen elektroforézissel elválaszthatók.

A PCR-reakció ciklusokból áll, egy cikluson belül pedig három fő lépés van:

  • A szaporítandó kettős DNS-szálat 95 °C körüli hőmérsékleten két egyszálú fonallá denaturáljuk.

  • A hőmérséklet 37 °C-ra csökkentésével a rövid, általában 8–20 nukleotidból álló szintetikus oligonukleotid molekulák, a primerek kapcsolódnak a komplementer célszekvenciákhoz (annealing).

  • 72–75 °C-on a hőstabil DNS Taq polimeráz az egyszálú templát DNS-hez kapcsolódó primerek 3’ végeit meghosszabbítja (elongáció), és ezzel egyidőben megtörténik a templát DNS-sel komplementer szál szintézise (extension) is 5’–3’ irányban.

  • Ezzel az első ciklus befejeződik, és olyan kettős fonalú DNS-molekulát kapunk, amely a primert is tartalmazza. A molekulák újbóli denaturálásával kezdődik a második cilkus (12. ábra).

12. ábra - A polimeráz láncreakció sémája (Stansfield, 1997)

A polimeráz láncreakció sémája (Stansfield, 1997)


Egyetlen DNS-molekulából egy ciklus után kettő lesz, a második után négy, a harmincadik után pedig elméletileg 230, azaz kb. 109. A ciklusok számát az határozza meg, hogy mennyi cél DNS-t kívánunk kapni. 30–40 ciklus alatt a szubsztrátban lévő pikogrammnyi DNS-ből néhány óra alatt mikrogrammnyi mennyiséget lehet előállítani. Mivel a ciklusok ismétlődése során a Taq polimeráz az újonnan elkészített DNS-szálakat is templátként használja, ezért a primer kötőhelyek közötti DNS-szakaszok mennyisége exponenciálisan nő.

Az amplifikációs reakciót a primer kapcsolódási és a lánchosszabbítási hőmérséklet változtatásával módosíthatjuk. A hőmérséklet növelésével minimumra csökkentjük a célszekvenciák versenyét az enzimért és a primerekért. A hőmérséklet csökkentése pedig a célszekvenciákkal rokon szekvenciák amplifikációját eredményezi.

A láncreakció első néhány ciklusában különböző hosszúságú DNS-fragmenteket kapunk, vagyis a célszekvenciánál hosszabb szálak is keletkeznek. A ciklusszám növekedésével azonban a célszekvenciával azonos DNS-fragmentek lesznek többségben.

Polimeráz láncreakcióval 50 bp – 3 kb méretű kromoszomális DNS-fragmenteket lehet felszaporítani, de lehet RNS-t is amplifikálni.

A PCR-technikát széles körben alkalmazzák az evolúció-, a fejlődés- és a molekuláris biológiában, továbbá a diagnosztikában és a populációgenetikában is.

4.2.2. Véletlen primerek használatán alapuló módszerek: MAAP

A láncreakció felfedezése óta számos PCR-en alapuló technika vált ismertté. Közülük ebben a fejezetben csak azokat tárgyaljuk, amelyek ismert szekvenciájú, de véletlen nukleotidokból álló primert vagy primereket használnak. Így a genomnak azokat a régióit tudjuk felszaporítani, ahová a primer vagy a primerek elég közel kapcsolódnak az ellenkező fonalon, lehetővé téve a közbeeső, ismeretlen szekvenciájú DNS-szakasz felszaporítását. Ezek a DNS-fragmentumok megfelelő primer(ek) alkalmazásakor tehát egyedenként vagy vonalanként eltérő mintázatot, polimorfizmust mutatnak.

A véletlen primerekkel történő DNS-amplifikáció magyarázatára Caetano-Anollés és mtsai (1992) modellt dolgoztak ki. A modell szerint az első néhány hőmérsékleti ciklusban a „templát elemző (screening)” fázisban rokon amplikonok (felszaporítandó DNS-szakaszok) egy csoportja szelektálódik ki az amplifikációhoz. Ezt a folyamatot a primer–templát–enzim kölcsönhatások irányítják, amelyek téves primer–templát párosodást okozhatnak. Az első kör amplifikációs termékei kezdetben egyszálúak, de palindrom végük van, és így belőlük primer–templát és templát–templát dimerek, vagy hajtű hurkok jöhetnek létre. A primernek fel kell ismernie és ki kell szorítani ezeket a szerkezeteket, mert csak így válik lehetővé az enzim rögzítése és a primer meghosszabbodása. A következő ciklusokban kialakul az egyensúly. A ritka primer–templát dimerek enzimatikus úton a felaszaporodó amplifikációs termékké alakulnak.

A véletlen primereket használó PCR-technikákat Caetano-Anollés és mtsai (1992) MAAP-nak (Multiple Arbitrary Amplification Profiling = többszörös tetszés szerinti amplifikációs profil) nevezték el. Ide tartoznak a RAPD és a rokon módszerek (AP-PCR, DAF és RAPD-DGGE). Közös jellemzőjük az, hogy a felszaporított kromoszomális DNS-fragmentumokat gélen elválasztjuk, láthatóvá tesszük, lefényképezzük, majd a kapott mintázatot kiértékeljük. Különbség közöttük az alkalmazott primerek hosszában, az amplifikáció körülményeiben, az elválasztás módjában és a felszaporított kromoszomális DNS-fragmentumok láthatóvá tételében van.

Közülük először a RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) technikát írták le Williams és mtsai (1990), valamint Welsh és mtsai (1990) olyan eljárásként, amellyel az RFLP-nél használt klónozott DNS-próbák nélkül lehet polimorfizmust találni. A RAPD módszerrel tehát a genom ismeretlen DNS szekvenciáit lehet felszaporítani 1 vagy 2 önkényesen választott, 10 nukleotidból álló (10 mer) primerrel (pl. GGTGACGCAG). Az amplifikáció kiindulását képező primer(ek) a genomon véletlenszerűen hibridizál(nak) a komplementer szekvenciával.

Ha az amplifikációhoz egy primert használunk, akkor a DNS mindkét szálának felszaporításához a primerrel komplementer szekvenciáknak mindkettőn néhány kbp-nyi távolságon belül kell lenniük. PCR-rel általában maximum 2 kbp DNS-fragmentumot lehet felszaporítani. Azok a DNS-régiók, amelyek nem tartalmazzák egymástól kb. 2 kbp-re a primer szekvencia két kópiáját fordított orientációban, PCR-rel csak akkor amplifikálhatók, ha két primert használunk.

Az amplifikációs termékeket a PCR-reakció után 1,5%-os agarózgélen futtatjuk, és etídium-bromiddal tesszük láthatóvá. UV fényben azonnal fényképezzük vagy számítógépbe visszük. Megfelelő primer vagy primerek alkalmazásakor a gélen primerenként változó számú (maximum 10) és méretű (néhány 100 bp – 2000 bp) fragmentumokat látunk. A fragmentumok méretét a mintákkal együtt futtatott DNS-markerek segítségével állapítjuk meg.

Véletlen primerek használatakor az egyedek vagy a vonalak közötti polimorfizmust egyrészt a primer kötőhelyi DNS-szekvenciakülönbség, másrészt pedig az amplifikált régióban vagy a primer kapcsolódási helyén deléció, inszerció vagy inverzió okozhatja. Ha az amplifikációt két tetszőleges primerrel végezzük, akkor olyan reprodukálható mintázatokat kapunk, amelyek különböznek bármelyik egyetlen primerrel létrehozott mintázattól. Primerpárok használatakor a termékeknek több mint 50%-a különbözik a bármelyik egyedüli primer által létrehozottól. A primerpárok használata növeli a RAPD analitikai feloldóképességét. Egyetlen primer használatakor a véletlen kiválasztás során arra kell vigyázni, hogy a G + C tartalom 40–60% között legyen, és palindrom szekvenciák ne forduljanak elő. Két primer együttes használatakor pedig arra kell ügyelni, hogy ne legyen közöttük komplementaritás.

A RAPD-okkal kimutatott genetikai polimorfizmus lókuszonként 1 allélt fed fel, ami megfelel a látható amplifikációs terméknek. A RAPD-ok domináns öröklődésűek, ezért a heterozigóta genotípusok kimutatására nem alkalmasak.

A RAPD-mintázatok reprodukálhatósága körül sok vita van. A reprodukálhatóságot főleg a templát DNS minősége és mennyisége határozza meg, ezért a DNS bomlását kizáró izolálási módszert kell választani.

A RAPD-mintázatokban lévő variabilitást leginkább a DNS etanollal kicsapható szennyeződései okozzák. A templát DNS minőségét hígítási sor készítésével lehet ellenőrizni. Ha jó minőségű a templát DNS, akkor minden koncentrációnál azonos mintázatot kapunk.

A nagyon magas vagy nagyon alacsony templát DNS-koncentráció szintén megbízhatatlan mintázathoz vezet. Ha egy adott templát DNS-re az optimális koncentrációt megállapítottuk, akkor a további RAPD-analíziseknél is ezt kell használni.

Néhány primer-templát kombináció nem ad reprodukálható mintázatot standard amplifikációs körülmények között. Ekkor a reakció paramétereit (pl. magnéziumkoncentráció) is optimalizálni kell. A legjobb azonban nagyszámú primert vizsgálni, és ezek közül a további vizsgálatokhoz azokat kiválasztani, amelyek a kérdéses templát DNS-sel ismételhető mintázatot adnak.

Mivel az agaróz gélen a fragmentumokat csak hosszuk alapján lehet elválasztani, ezért az alacsony feloldóképességű RAPD-technikával csak a túlsúlyban lévő termékeket lehet kimutatni.

A RAPD-markeres polimorfizmus alkalmazási területei:

  • genetikai különbözőség és/vagy rokonság megállapítása,

  • tulajdonságok térképezése,

  • DNS-ujjlenyomat készítése,

  • beltenyésztett vonalak homozigótaságának megállapítása,

  • fajták homogenitás vizsgálata,

  • F1 hibrid vetőmagok uniformitásának megállapítása.

Morell és mtsai (1995) hagyma-, árpa-, repce-, brokkoli-, karfiol-, zeller-, zab- és kakaófajták azonosítására használták a RAPD-technikát, és még olyan közeli rokon fajtákat is meg tudtak különböztetni, amelyeknek genomja 94% hasonlóságot mutatott. A RAPD-analízissel feltárt rokonságot az alloenzim és a tartalékfehérje markerekkel kapott eredmények is igazolták.

Fajtaazonosítás esetében nagyon fontos, de nehezen megválaszolható kérdés az, hogy hány RAPD primert kell használni, és hogy a fajtákat hány sáv alapján lehet megkülönböztetni. Repcefajták megkülönböztetéséhez pl. elég lehet egy jól kiválasztott primer és/vagy 5–25 véletlenül kiválasztott fragmentum.

Az AP-PCR (Arbitrary Primed PCR = PCR tetszés szerinti primerrel) elve ugyanaz, mint a RAPD-é, csak itt a primerek 20 nukleotidból állnak, a PCR-reakció pedig több ciklusos, mint a RAPD esetében.

DNS amplifikációs ujjlenyomat, DAF (DNA Amplification Fingerprinting) (Caetano-Anollés és mtsai 1991).

A DAF-reakcióban általában egyetlen, 8–12 nukleotidból (pl. GCCCGCCC) (nt) álló primert használunk kromoszomális szekvenciák amplifikálására. De egyetlen, 5 nt primer is hozhat létre jellegzetes, nagyon informatív mintázatot. A különböző primer templát kombinációk különböző hosszúságú, rövid DNS-fragmentumokat eredményeznek. Az amplifikációs termékek spektruma primer–templát kombinációnkét változó és az adott kombinációra jellemző. A fragmentumokat általában poliakrilamid gélen választjuk el és ezüstfestéssel tesszük láthatóvá, de használhatunk agaróz gélelektroforézist, denaturáló grádiens gélelelktroforézist (DGGE), kapilláris gélelektroforézist vagy DNS-szekvenálót is.

Primer párokkal is lehet DAF-mintázatot létrehozni. Így nem csupán az egyes primerekkel külön-külön kapott mintázatok összegződnek, hanem egyes sávok eltűnnek, és újak is keletkeznek. Ha külön-külön használjuk az egyes primereket, akkor azok a genomnak egy diszkrét, meghatározott részét amplifikálják, és jellegzetes fragmentumokat alakítanak ki.

A primer szekvencia – és így a G + C tartalom – változtatásával szabályozni tudjuk, hogy egyszerű, kevés sávból álló vagy komplex, több információt adó, soksávos mintázatot kapjunk. A 10 nukleotidból álló, nagy G + C tartalmú (60–70%) véletlen primerek használatával – a genommérettől függően – több fragmentumot lehet kapni, mint a 40–60%-osakkal; embernél pl. 0–19, szójánál pedig 2–49 fragmentumot. A kevés sávból álló mintázatokat a genetikai térképezésnél, a komplex mintázatot pedig DNS-ujjlenyomat készítésére használjuk. Egyszerű mintázatot jobb rövidebb primerrel és magasabb kapcsolódási hőmérséklettel előállítani, mint kisebb primer- vagy magnézium-koncentrációval.

A sávok számát és a polimorfizmust növelni lehet az amplifikáció előtt a DNS restrikciós endonukleázos emésztésével (tecMAAP = Template Endonuclease Cleavage MAAP) is. Ezzel a módszerrel nagyon közeli rokon fajtákat, valamint kontroll és EMS mutáns vonalakat is meg tudunk különböztetni.

A DAF-technika alkalmazási területei:

  • azonosság tesztelése,

  • populáció- és pedigreanalízis,

  • közel izogén vonalak molekuláris jellemzése,

  • nagy felbontású genetikai térképek készítése.

Ha bármelyik véletlen primerrel létrehozott amplifikációs terméket egy vagy két primerrel, vagy ha a DAF-mintázatot „mini hajtű”-nek nevezett primerekkel (13. ábra) vagy standard véletlen primerekkel ismét amplifikáljuk, akkor ezt ASAP (Arbitrary Signatures from Amplification Profiles) analízisnek nevezzük (Caetano-Anollés és Gresshoff, 1996). A módszerrel lehetővé válik az elsődleges szekvencia további vizsgálata. Ha az egyik vagy mindkét PCR-reakció során két primert használunk, akkor 104 vagy 1016 különböző reakció lehetséges. Bár az első amplifikáció során létrejött DAF-fragmentumok között kapcsolódás (priming) is létre jöhet.

13. ábra - A GCGAAGCGCC „minihajtű primer háromdimenziós szerkezete (Hirao és mtsai, 1994. nyomán)

A GCGAAGCGCC „minihajtű primer háromdimenziós szerkezete (Hirao és mtsai, 1994. nyomán)


Az ismertetett MAAP-technikák jellemzőit a 4. táblázat foglalja össze.

4. táblázat - A MAAP-technikák összehasonlítása

Jellemzők

RAPD

AP-PCR

DAF

Feloldóképesség

alacsony

közepes

magas

Termékek

1–10

3–50

10–100

Elválasztás

agaróz

PAGE

PAGE

Detektálás

EtBr

radioaktív

ezüstfestés

Primer hosszúság (nt)

9–10

20–34

5–15

Primer koncentráció (mM)

0,3

3

30

Kapcsolódási hőmérséklet

alacsony

magas és alacsony

alacsony vagy magas


4.2.3. A miniszatellit polimorfizmus módszere: VNTR

Az eukarióta genom nem kódoló régiójában, a heterokromatikus részekben előforduló szatellit DNS is felhasználható molekuláris markerként. A szatellit DNS egyszerű, tandem ismétlődő oligonukleotid központi (core), di- ATn, tri-ATCn, tetra-AGTCn és pentamer AGTCTn szekvenciából áll. Méretük alapján három csoportba sorolhatók: midi-, mini- és mikroszatellitek. Közülük a 0,530 kb hosszú,változó számú tandem ismétlődő szekvenciákat Jeffreys és mtsai (1985) VNTR-nek (Variable Number of Tandem Repeats = változó számú tandemismétlődések) vagy miniszatelliteknek nevezték el. A miniszatellitek 2–100 nukleotidból álló szekvencia csoportok (cluster-ek). Pl. a GGAAGGGAAGGGAAAGGGAAAG alap szekvenciában a GGAAG szekvencia négyszer ismétlődik tandem módon. Az ilyen szekvenciacsoportok az emberi genomban nagyon gyakoriak. Az ismétlődések száma egy adott lókuszra vonatkozóan különböző, ezért mindegyik variáció egy VNTR-allélt képvisel. A VNTR-szekvenciák restrikciós endonukleázokkal történő emésztése és Southern blottolása után kapott DNS ujjlenyomat az egyedre jellemző, és független attól, hogy melyik szervből vagy szövetből izoláltuk a DNS-t. A VNTR módszer az RFLP-hez hasonlít azzal a különbséggel, hogy itt olyan próbákat használunk, amelyek három vagy két nukleotidból álló ismétlődő szekvenciákkal hibridizálnak.

A miniszatellitek állatoknál 0,1–20 kb. hosszúak, és az ismétlődő régiót konzervatív endonukleáz hasító helyek határolják. Ha tehát a PCR-reakció során olyan primer(eke)t használunk, amely(ek) ezekhez a konzervatív régiókhoz kapcsolódik(nak), akkor egy adott VNTR lókuszt amplifikálni tudunk. A kapott PCR-termék vagy fragmentum hossza pedig aszerint változik, hogy az amplifikált VNTR-allélen vagy alléleken belül hány ismétlődő DNS-egység van. Azok a fragmentumok, amelyeken belül a központi szekvencia többször ismétlődik, hosszabbak, mint a kevesebbszer ismétlődő, rövidebb szekvenciák.

A VNTR-ek méretük miatt nehezen amplifikálhatók. Növényeknél a miniszatellitek kevésbé tanulmányozottak. A legmegfelelőbb DNS-ujjlenyomatot olyan oligonukleotid primerek felhasználásával készítették, amelyek a (GATA)n szekvenciát tartalmazták (n = 2–5). Ezzel a módszerrel fajra jellemző ujjlenyomatot készítettek a Triticum, a Secale, a Hordeum, a Beta, a Brassica és a Nicotiana nemzetségekben (Beyermann és mtsai, 1992).

A többlókuszos VNTR-mintázatot oligonukleotid ujjlenyomatnak is nevezzük. Ez könnyen reprodukálható és nagyon érzékeny. Segítségével egyes fajokban egyedspecifikus mintázatok is kimutathatók. Hátránya viszont, hogy a laboratóriumi protokoll elég bonyolult, mikrogramnyi mennyiségű DNS kell hozzá és a többlókuszos mintázat nem ad elég információt az allélekről. Mitotikus stabilitása miatt az oligonukleotid ujjlenyomat segítségével a fajtaazonosság és/vagy -különbözőség egyértelműen megállapítható. A VNTR-ek felhasználhatók tulajdonságok térképezésére is. Itt azonban problémát jelent, hogy a miniszatellitek esetében elég gyakori a mutáció (emberi miniszatelliteknél 0,5–1% gamétánként és nemzedékenként), amely új, eltérő hosszúságú allélek kialakulását okozhatja. Így jelentős mennyiségű nem szülői mintázat is megfigyelhető. Ez a jelenség növényeknél és gombáknál is megtalálható.

4.2.4. A mikroszatellit polimorfizmus módszerei

Ha a tandem ismétlődő régiók két nukleotidból állnak, akkor VNDR-nek (Variable Number of Dinucleotide Repeats = változó számú dinukleotid ismétlődések, Nakamura és mtsai 1987), STR-nek (Short Tandem Repeat = rövid tandem ismétlődés, Edwards és mtsai, 1991) mikroszatellitnek (Litt és Luty, 1989) vagy SSR-nak (Simple Sequence Repeat = egyszerű szekvencia ismétlődés, Jacob és mtsai, 1991) nevezzük. A mikroszatellitek egyes szerzők szerint 11–60 bp, mások szerint 20–40 bp hosszú, könnyen amplifikálható, nagy polimorfizmust mutató DNS-szakaszok, amelyek egyenletesebben oszlanak el a genomban, mint a miniszatellitek.

Egy 20 bp-nál hosszabb ismétlődés (SSR) átlagosan 30 kbp-ként fordul elő a növényi genomban; Brassica fajokban pl. 19 kbp-ként (Lagercrantz és mtsai, 1993). Az emberi genomban 6 kbp-ként találhatók 20 bp-nál hosszabb mikroszatellitek. Az SSR-k különböző típusainak gyakorisága növényfajonként eltérő. A növényi genom legelterjedtebb dinukleotid ismétlődése az AA/TT motívum. Ennél kevesebbszer fordulnak elő az AT/TA és a CT/GA motívumok. Ez a három dinukleotid SSR átlag 1–6-szor ismétlődik egymás után, és az összes növényi mikroszatellit 75%-át teszik ki (Lagercrantz és mtsai, 1993) A mikroszatellitek tehát nagy polimorfizmust mutató DNS-szakaszok, amelyek 25 bp hosszúságúak. A trinukleotidok közül a rizsnél a GGCn mikroszatellit fordul elő a leggyakrabban, n = 13 tandemszámmal, kukoricánál pedig a (TTG)n és a (TTC)n ismétlődések a leggyakoribbak (Taramino és Tingey, 1996). A három és négy nukleotidból álló ismétlődések előnye a két nukleotidból állókkal szemben az, hogy a kis méretbeli különbséget mutató allélvariánsok vizsgálatát is lehetővé teszik. Azok a heterozigóta egyedek, amelyek alléljei 4 bp-ban különböznek, jól elkülöníthetők, viszont 2 bp-nyi különbség az allélek között már nem mutatható ki.

A mikroszatelliteket (SSR-okat) határoló DNS-szekvenciák ugyanazon faj egyedein belül általában konzervatívak. A konzervatív DNS-szekvenciák ellentétes szálaival azonos primerekkel a közbeeső mikroszatelliteket PCR-rel amplifikálni tudjuk egy adott faj valamennyi genotípusában. A fragmentumokat agaróz gélen választjuk el és etídium-bromiddal tesszük láthatóvá. Ezt a speciális, mikroszatellit primerekkel történő amplifikációt szekvenciával jelölt PCR-nek vagy STS-PCR-nek (Sequence-Tagged-Site) nevezzük. A módszerrel a nukleotid ismétlődések számában („n”) meglévő különbséget tudjuk kimutatni a fragmentumok eltérő hosszúsága alapján. A 14. ábra két homzigóta genotípus (A és B) SSR hossz különbségét mutatja. Az „A” genotípus egy bizonyos SSR lókusznak (AT)/(TA)18 alléljét hordozza, a „B” genotípusú egyed pedig az (AT)/(TA)22 allélt. Mindkét genotípus egyetlen PCR-terméket, fragmentumot hoz létre. A „B” egyedtől származó fragmentum azonban nagyobb, mert több (AT)/(TA) ismétlődő egység-ből áll.

14. ábra - SSR hossz polimorfizmus keletkezése (Cregan és mtsai, 1994)

SSR hossz polimorfizmus keletkezése (Cregan és mtsai, 1994)


Az (AT)n és a (TAT)n mikroszatellitek szójánál nagy polimorfizmust mutatnak, szomatikusan stabilak és kodominánsan öröklődnek. SSR-markereket ezideig szójára, szőlőre, rizsre és árpára fejlesztettek ki.

A mikroszatellit hossz polimorfizmust

  • populációs tanulmányokra,

  • kapcsoltsági és fizikai térképek készítésére, valamint

  • fajtaazonosításra lehet használni.

Az SSR-technikát a nádképű csenkesz (Festuca arundinacea) szomaklónok közötti genetikai variabilitásának kimutatására használták Gyulai és mtsai (1995) (15. ábra).

15. ábra - A nádképű csenkesz (Festuca arundinacea L.) 18 szomaklónjának (Scj.jg) SSR-PCR módszerrrel végzett genetikai elemzése A nyilak az alkalmazott (GACA)4 primerrel felismert és felszaporított, polimorfizmust mutató DNS-fragmentumokat jelzik. (Gyulai és mtsai, 1995)

A nádképű csenkesz (Festuca arundinacea L.) 18 szomaklónjának (Scj.jg) SSR-PCR módszerrrel végzett genetikai elemzése A nyilak az alkalmazott (GACA)4 primerrel felismert és felszaporított, polimorfizmust mutató DNS-fragmentumokat jelzik. (Gyulai és mtsai, 1995)


A 90-es évek elejétől az alábbi, PCR-en alapuló mikroszatellit markermódszereket dolgozták ki: MP-PCR, AMP-PCR, RAMP, RAMPO, STMS. Ezek főleg az amplifikációhoz használt primer(ek) pozíciójában és típusában különböznek.

MP-PCR (Microsatellite-Primed PCR = PCR mikroszatellit primerrel; Meyer és mtsai, 1993)

Az MP-PCR az Alu-PCR (Nelson és Laskey, 1990), az STMS és a RAPD néhány elemét kombinálja. Ennél a módszernél a mikroszatellittel komplementer oligonukleotidokat nem hibridizációs próbaként használjuk, mint a VNTR-nél, hanem primerként. Ha a genomban fordítottan ismétlődő mikroszatellitek vannak egymástól amplifikálható távolságra, akkor az ismétlődés közötti szekvenciák amplifikálódnak (16. ábra). A PCR-termékeket agaróz gélen választjuk el és etídium-bromiddal festjük.

16. ábra - MP-PCR szemi-speifikus primőrrel (Weising és mtsai, 1997)

MP-PCR szemi-speifikus primőrrel (Weising és mtsai, 1997)


Az MP-PCR azon változatát, amikor egy primert használunk az amplifikációs reakciókban, SPAR-nak (Single Primer Amplification Reaction = egy primerrel végzett amplifikációs reakció) nevezzük (Gupta és mtsai, 1996). A módszer során ismeretlen szekvenciájú cél DNS-szakaszokat szaporítunk fel egy vagy két nem végálló mikroszatellit primerrel [pl. (CCG)5 vagy (CGA)5] olyan körülmények között, amelyek biztosítják a pontos primerkapcsolódást. Ha a PCR-t radioaktív jelöléssel végezzük (a primerek 5’ végét 32P izotóppal jelöljük), és a kapott termékeket nem agaróz gélen, hanem denaturáló poliakrilamidgélen választjuk el, akkor még a nagyon kis méretű (300 bp) fragmentumok is jól láthatók. Polimorfizmus létrehozására a tetranukleotid primerek a legalkalmasabbak. Az MP-PCR-módszerrel primer–templát kombinációnként 1–20, az adott fajra specifikus sávot lehet a géleken megfigyelni, amelyek 0,3–2 kb méretűek. Ha primerként dinukleotid vagy AT-ben gazdag trinukleotid ismétlődéseket használunk, akkor a sávok kevésbé élesek, elkenődnek, mert az ilyen típusú mikroszatellitek nagy kópiaszámban fordulnak elő a növényi DNS-ben.

Az MP-PCR reprodukálhatósága azonos a RAPD-éval, mert a sávok között sok téves primerkapcsolódás eredményeként jön létre.

AMP-PCR (Anchored Microsatellite-Primed PCR = végálló mikroszatellit primerekkel végzett PCR; Zietkiewicz és mtsai, 1994)

Egyik változata a 17. ábrán bemutatott Inter-SSR-PCR.

17. ábra - Az Inter-SSR-PCR sematikus rajza (Zietkjewicz és mtsai, 1994)

Az Inter-SSR-PCR sematikus rajza (Zietkjewicz és mtsai, 1994)


Az AMP-PCR egy másik változatával ismeretlen kromoszomális DNS-szekvenciákat amplifikálunk egyetlen, az 5’ vagy a 3’, illetve mindkét végen álló di- vagy trinukleotid mikroszatellit primerekkel [pl. VDV (CT)8 vagy BDB (AC)7A, ahol B = C , D = A, G vagy T, V = A, C vagy G] (18. ábra). A fragmentumokat poliakrilamid gélen választjuk el és autoradiográfiával tesszük láthatóvá. Leginformatívabb mintázatot a végálló GA és GT dinukleotid motívumokkal lehet létrehozni. A mintázat 10–15 sávból áll. A sávok domináns markerként viselkednek. AMP-PCR-rel főleg fajspecifikus különbségeket, esetenként a fajok közötti polimorfizmust lehet kimutatni. A módszert krizantém- és olajrepcefajták azonosítására, továbbá beltenyésztett pattogatni való kukoricavonalak közötti genetikai különbözőség kimutatására használták.

18. ábra - Csicseriborsó-fajták AMP-PCR mintázata (Weising és mtsai, 1997)

Csicseriborsó-fajták AMP-PCR mintázata (Weising és mtsai, 1997)


RAMP (Random Amplified Polymorphic Microsatellites = véletlen amplifikálódott polimorf mikroszatellitek; Wu és mtsai, 1994)

A módszer alkalmazásakor az amplifikációhoz 5’ végálló mikroszatellit primerek és dekameres RAPD-primerek kombinációját használjuk (19. ábra). A mikroszatellit komplementer primert 33P-dATP izotóppal jelöljük. A PCR-reakció úgy van beállítva, hogy magas és alacsony kapcsolódási hőmérsékletek között vált át, és ezáltal elsősorban a mikroszatellit lókuszok amplifikálódnak. A PCR-termékeket denaturáló poliakrilamid gélen választjuk el. Az autoradiogramon csak az izotóppal jelölt mikroszatellit eredetű sávok láthatók. Ha az izotópos jelölés helyett ezüstfestést alkalmazunk, akkor a RAPD-sávok is láthatók. Arabidopsis ökotípusok RAMP-vizsgálata során primerenként 10–30 polimorf sávot és 2–7 allélt kaptak. Hasadó populációban a 104 RAMP-fragmentumból 67 kodomináns markerként viselkedett.

19. ábra - RAMP szemi-specifikus ■ és random □ primerrel (Weising és mtsai, 1997)

RAMP szemi-specifikus ■ és random □ primerrel (Weising és mtsai, 1997)


Ha a szokásos 10 meres random primereknél hosszabbat használunk (16 vagy 20 mer), akkor a két primer részére közel azonos kapcsolódási hőmérsékletet tudunk biztosítani. Ezzel elkerüljük a hőmérséklet szempontjából aszimmetrikus PCR-körülmények kialakítását. Ha a kapott PCR-terméket restrikciós endonukleázokkal emésztjük (pl. MseI), akkor további polimorfizmust, dRAMP-okat kapunk. A RAMP-technikát Sanchez de la Hoz és mtsai (1996) geneteikai rokonság megállapítására és térképezésre használták árpánál.

RAMPO (Random Amplified Microsatellite Polymorphisms = véletlen amplifikált mikroszatellit polimorfizmus; Richardson és mtsai, 1995), RAHM (Random Amplified Hybridization Microsatellites = véletlen amplifikált hibridizációs mikroszatellitek; Cifarelli és mtsai, 1995), RAMS (Randomly Amplified Microsatellites = véletlen amplifikált mikroszatellitek; Ender és mtsai, 1996)

A technika kombinálja a véletlen (20. ábra) vagy a mikroszatellit primerekkel végzett PCR-t és a mikroszatellit hibridizációt. A módszer alkalmazása során első lépésként kromoszomális DNS-t amplifikálunk a RAPD-analíziseknél használt 10 meres véletlen primerrel vagy egy mikroszatellittel komplementer 15 vagy 16 meres primerrel. A PCR-termékeket elektroforetizáljuk, etídium-bromiddal láthatóvá tesszük, fényképezzük, blottoljuk és 32P izotóppal vagy digoxigeninnel (DIG) jelölt próbákkal [pl. (A)16, (GA)8, (CAA)5 vagy (GATA)4] hibridizáljuk. Az autoradiográfia után reprodukálható, próbától függő mintázatot kapunk, amely különbözik az etídium-bromidos festés után kapott mintázattól, és alkalmas a fajok közötti polimorfizmus kimutatására.

20. ábra - RAMPO random primőrrel (Weising és mtsai, 1997)

RAMPO random primőrrel (Weising és mtsai, 1997)


A véletlen, 10 meres primerrel történő PCR-reakció után az etídium-bromidos festés csak a nagy mennyiségben keletkezett fragmentumokat teszi láthatóvá. A mikroszatellit próbával történő hibridizáció után viszont a kis amplifikációs termékek is detektálhatók. Egy bizonyos mikroszatellit motívumot tartalmazó fragmentumok jelintenzitását mind a motívum hossza, mind pedig a fragmentum mennyisége befolyásolja. A hibridizáló sávokat lehet klónozni, szekvenálni, majd próbaként használni RAPD- vagy RFLP-géleken. Klónozott RAMPO-fragmentumokkal fajon belüli és fajok közötti polimorfizmust is ki lehet mutatni. A RAMPO-technikával eddig yam-, olajbogyó-, cukorrépa- és napraforgófajokat vizsgáltak, de valószínűleg sikeresen használható valamennyi növényfaj esetében. Nagy előnye ennek a módszernek, hogy PCR-reakcióval indul, ezért akkor is alkalmazható, ha nanogram mennyiségű DNS áll rendelkezésre.

A mikroszatelliteken alapuló markertechnikák kevés kivétellel, pl RAMP, domináns típusú markereket hoznak létre. Tehát ezekkel a homo- és a heterozigóta állapotot nagyon nehéz vagy lehetetlen megállapítani. Mivel többlókuszos markerek, ezért az egyedi lókuszokat is nehéz velük elkülöníteni.

STMS (Sequence Tagged Microsatellite Sites = szekvenciával jelölt mikroszatellit helyek; Beckmann és Soller, 1990)

A lókusz-specifikus mikroszatellit analízis (STMS) kiküszöböli a mikroszatelliteken alapuló markermódszerek előzőekben ismertetett hátrányait, mert lókusz-specifikus kodomináns markereket és jól azonosítható alléleket eredményez.

Az STMS-módszer lépései:

  1. mikroszatellit ismétlődések keresése genomkönyvtárban,

  2. a megfelelő klónok szekvenálása,

  3. az ismétlődésekhez kapcsolódó primerek tervezése,

  4. kromoszomális DNS amplifikálása az elkészített specifikus primerekkel,

  5. a PCR-termékek radioaktív jelölése és elválasztása denaturáló gélen,

  6. detektálás autoradiográfiával.

Azokat a fragmentumokat, amelyek között 4 bp-nál nagyobb a különbség, 2%-os agaróz gélen is el lehet választani és etídium-bromiddal láthatóvá lehet tenni. Szintén jó feloldóképességet ad a nem denaturáló poliakrialmid gélen történő elválasztás ezüst- vagy etídium-bromidos festéssel kombinálva. Ezáltal elkerülhető a radioaktív jelölés.

A legújabb STMS-technika alkalmazásakor az 5’ és a 3’ végen fluoreszcens festékkel jelölt primereket és félautomata szekvenálót használnak. Így a fluoreszcens PCR-termékek az elektroforézis alatt lézerszkenneléssel kimutathatók (21. ábra). A kiértékelés GENESCAN szoftver programmal végezhető. A technikával egyetlen zsebben futtatott 24 különböző mikroszatellit lókuszt is lehet sávonként analizálni. A Gene Scanner ABI 362 készülék azonban nagyon drága.

21. ábra - Árpa izogén vonalak (AlgR = rezisztens, AlgS = fogékony) RAPD mintázata fluoreszcens festékkel jelölt primerek és Géné Scanner ABI362 automata készülékkel történő elválasztás alkalmazásakor A nyíllal jelölt helyeken eltérés látható a rezisztens és a fogékony vonalak között. (Walsh és mtsai, 1997)

Árpa izogén vonalak (AlgR = rezisztens, AlgS = fogékony) RAPD mintázata fluoreszcens festékkel jelölt primerek és Géné Scanner ABI362 automata készülékkel történő elválasztás alkalmazásakor A nyíllal jelölt helyeken eltérés látható a rezisztens és a fogékony vonalak között. (Walsh és mtsai, 1997)


Az STMS-mintázatnál a dinukleotid ismétlődések enzimatikus amplifikációja miatt külön sávok helyett homályos csíkok csoportját látjuk, amelyek 2 bp-nyi intervallumonként különülnek el egymástól. A további csíkok nagy valószínűséggel a Taq polimerázos replikáció alatti elcsúszás miatt jönnek létre. Ezek a „műtermékek” gyakran nehezítik az allélek pontos méretének a meghatározását, különösen akkor, ha a két allél csak 2 bázispárban különbözik. Tri- és tetranukleotid ismétlődések amplifikálása esetén az elcsúszás kisebb, a sávok pedig élesebbek.

Az STMS-markereket főleg térképezésre és genotípus azonosításra használják. Fajtaazonosításra megbízhatóbb, mint a RAPD, az MP-PCR vagy az oligonukleotid ujjlenyomat, mert az alléleket és a genotípusokat a kodomináns öröklődés miatt egyértelműen meg lehet határozni. Genotípus meghatározására főleg szójánál alkalmazták, és megállapították, hogy 10 vagy 15 lókusz elegendő szoros rokonságban lévő genotípusok megkülönböztetésére. Szőlőre olyan fajtaazonosító rendszert dolgoztak ki, amelynek során az STMS-lókuszokat fluoreszcens primerekkel vizsgálják, az eredményeket pedig GENESCAN szoftver programmal értékelik ki.

Az STMS-markereket tulajdonságok térképezésére rizsnél, Arabidopsisnál, szójánál, árpánál, kukoricánál és paradicsomnál alkalmazták.

A jelenleg rendelkezésre álló mikroszatellit markerek közül az STMS-markerek egyesítik az ideális markerekre jellemző tulajdonságokból a legtöbbet. Ezek az alábbiak:

  1. nagyon polimorfak és informatívak,

  2. kodominánsan öröklődnek, és így a homo- és heterozigóta genotípusokat jól megkülönböztetik,

  3. a PCR-rel felszaporított mikroszatellitek szekvenáló gélen történő elválasztásával lehetővé teszik az allélek pontos meghatározását és az allélgyakoriságok kiszámítását,

  4. az eukariota genomban mikroszatellitek mindenütt bőségesen jelen vannak,

  5. valószínűleg semlegesek, mert csak kevés mikroszatellit íródik át,

  6. megfelelő primerek esetében az egyes genotípusok meghatározása PCR-rel gyors, könnyű, csak nanogramnyi templát DNS kell hozzá és automatizálható,

  7. az eredmények nagymértékben reprodukálhatók, ha szigorú (sztringens) PCR körülményeket alkalmazunk,

  8. a primer szekvenciákkal kapcsolatos információk könnyen cserélhetők az egyes laboratóriumok között.

A STMS-technika széleskörű alkalmazására azonban a klónozás és a szekvenálás nagy pénz- és munkaigénye, valamint a genotípusok fárasztó azonosítása és a sávok elcsúszása („dadogása”) miatt csak a legfontosabb növényfajoknál számíthatunk.

4.2.5. Az amplifikált fragmentumhossz polimorfizmus: AFLP

4.2.5.1. Az AFLP elve

Az AFLP-módszert (Amplified Fragment Lenght Polymorphism = amplifikált fragmentumhossz polimorfizmus), az egyik legújabb DNS-technikát, Zabeau és Vos (Key Gene, Hollandia) 1993-ban szabadalmaztatta és 1995-ben publikálta.

Lényege: ismeretlen szekvenciájú kromoszomális restrikciós fragmentumokat amplifikálunk PCR-rel. Az amplifkáció előtt a genomiális DNS-t két restrikciós endonukleázzal hasítjuk, és a DNS-fragmentumok végeire helyspecifikus ds (double stranded = kettős fonalú) adaptereket ligálunk. Így az adapterek szekvenciája és a csatlakozó hasított vég lesz a restrikciós fragmentumok primerkötő helye az amplifikáció alatt. A PCR-primerek 3’ végeihez szelektív nukleotidokat adunk, amelyek a hasítási helyek csak egy csoportját tudják azonosítani. Így csak azok a restrikciós fragmentumok amplifikálódnak, amelyekben a hasítási helyhez kapcsolódó nukleotidok összeillenek a szelektív nukleotidokkal (22. ábra).

22. ábra - Az AFLP-technika sematikus ábrázolása (Vos és mtsai, 1995)

Az AFLP-technika sematikus ábrázolása (Vos és mtsai, 1995)


A fragmentumokat létrehozó két restrikciós enzim közül az egyik ritkán, a másik pedig gyakran vág. Ezért az AFLP-módszer elsősorban olyan restrikciós fragmentumok amplifikációját eredményezi, amelyeknek egyik végén ritkán vágott, a másik végén pedig gyakran vágott szekvenciák vannak. A kétféle restrikciós enzim használatának az alábbi okai vannak:

  1. A gyakran vágó restrikciós enzim kis DNS-fragmentumokat hoz létre, amelyek jól amplifikálódnak és optimális méretűek a denaturáló gélen történő elválasztáshoz.

  2. A ritkán vágó restrikciós enzimek az amplifikálódott fragmentumok számát csökkentik. Ez limitálja az AFLP-reakcióhoz szükséges szelektív nukleotidok számát.

  3. Két restrikciós enzim használata lehetővé teszi, hogy a kettős szálú PCR-termékek közül csak az egyik legyen jelölve. Ez megelőzi a gélen az amplifikálódott fragmentumok két szálának különböző mobilitása miatt kialakuló másolatok (doublets) jelenlétét.

4.2.5.2. Az AFLP lépései

Az AFLP-módszer három fő lépésből áll:

  • templátkészítés,

  • fragmentum amplifikáció,

  • gélanalízis.

Alapvető a DNS minősége. Nagyon fontos, hogy a DNS teljesen hasítódjon. Ha ugyanis két olyan DNS-t hasonlítunk össze, amelyek a nem teljes hasítás miatt különböznek, akkor nagy valószínűséggel nem igazi DNS-polimorfizmust mutató sávok jelennek meg.

A templátkészítés első lépése a DNS hasítása a ritkán és a gyakran vágó restrikciós enzimekkel. Ritkán vágó enzimként általában az EcoRI-t (GAATTC), gyakran vágó enzimként pedig az MseI-t (TTAA) használják. Jó minőségű AFLP ujjlenyomathoz 500 bp fragmentumokra van szükség. Az MseI-gyel (TTAA) történő hasítás a legtöbb növényfajnál kis DNS-fragmentumokat eredményez, mert a legtöbb növény genomja A-T-ben gazdag. Az egyszikűeknél azonban az MseI nem hasít elég kis fragmentumokat, és a másik 4 bázispárnál vágó enzim is hasonló eredményt ad.

Az AFLP-adapterek egy központi és egy hasító enzimspecifikus szekvenciából állnak. Ezek szerkezete az alábbi:

EcoRI:

5-biotin-CTCGTAGACTGCGTACC

CATCTGACGCATGGTTAA-5

MseI:

5-GACGATGAGTCCTGAG

TACTCAGGACTCAT-5

Az adapterek úgy kapcsolódnak, hogy a hasítási helyek ligálás után nem alakulnak vissza. A ligálási reakcióban a restrikciós enzimek működése miatt a fragmentumok egymással nem ligálódnak. Az adapterek pedig azért nem tudnak egymással kapcsolódni, mert nem foszforiláltak.

A ligálás után háromféle fragmentumot kapunk:

  • MseI-MseI,

  • EcoRI-MseI és

  • EcoRI-EcoRI.

Mivel az EcoRI-primert biotinnal jelöltük, ezért csak azokat a DNS-fragmentumokat tudjuk detektálni, amelyeknek EcoRI végük van. A biotinnal jelölt fragmentumokat a biotinnal nem jelölt MseI-MseI fragmentumoktól sztreptavidinhez való kötődés alapján lehet elkülöníteni. Ha az MseI primer végét 32P-vel vagy [-33P]ATP-vel jelölik, akkor az EcoRI-MseI és az MseI-MseI fragmentumokat is ki lehet mutatni. A 33P izotóppal végzett jelölés drága, de éles sávokat ad. Az izotópos jelölés helyett ezüstfestést is lehet alkalmazni az AFLP-vizsgálatoknál. Az ezüstfestés feloldóképessége azonos a 33P izotópéval, de több munkát és gyakorlatot igényel, mint az utóbbi.

A sikeres PCR-amplifikáció feltétele a megfelelő primer konstrukció. Az AFLP-primerek három részből állnak:

  1. az 5’ régió, a központi rész,

  2. a középső rész, az enzimspecifikus szekvencia (ENZ),

  3. a 3’ vég, ahol 1 vagy 3 szelektív nukleotid található (jelölésük: + 1 vagy + 3, illetve N vagy NNN).

Tehát az EcoRI- és az MseI-primerek szerkezete az alábbiak szerint alakul:

Központi rész

ENZ

Szelektív nukleotidok

EcoRI

5‑GACTGCGTACC

AATC

NNN‑3

MseI

5‑GATGAGTCCTGAG

TAA

NNN‑3

Az AFLP-primerek szerkezetét elsősorban a restrikciós fragmentumokhoz ligálódott adapterek szerkezete határozza meg. Különböző szerkezetű adapterekhez más és más PCR körülmények tartoznak. Ezért először a specifikus konstrukciójú adaptert választjuk ki, és ehhez optimalizáljuk a PCR-reakciót. Általában 16–20 nukleotidból álló AFLP-primereket használnak.

Az AFLP-analíziseknél a két restrikciós enzimmel pontosan be lehet állítani az amplifikálandó fragmentumok számát. Specifikus AFPL-primer készlet alkalmazásakor a várható fragmentumok számát a 2R/4n képlettel lehet becsülni, ahol R = a ritka hasítási helyek (szekvenciák), n = a szelektív nukleotidok összes száma.

Ezzel a képlettel azért lehet csak becsülni a fragmentumok számát, mert az amplifikált fragmentumok száma a szelektív nukleotidok természetétől is függ. Az A-T-ben gazdag szervezetekben az A-T-ben gazdag szakaszok meghosszabbodásakor több amplifikált fragmentum jön létre, mint a G-C-ben gazdagokban.

Az AFLP-módszer, amely kromoszomális eredetű restrikciós fragmentumok detektálására alkalmas, hasonlít az RFLP-re. Közöttük a legfontosabb különbség az, hogy a restrikciós fragmentumok detektálása az RFLP-nél Southern hibridizációval, az AFLP-nél pedig PCR amplifikációval történik. Az RFLP-technika a restrikciós fragmentumhossz különbségeit mutatja, míg az AFLP a restrikciós fragmentumok meglétét vagy hiányát jelzi.

4.2.5.3. Az AFLP alkalmazási területei

Az AFLP nagy feloldóképességű technika. Komplex genomok esetében ezzel a módszerrel korlátlan számú restrikciós fragmentumot lehet kapni. Egyetlen, pl. egy specifikus hat- és négybázisú restrikciós enzimkombinációval az egyedi AFLP-fragmentumok százezereit lehet létrehozni. Ezzel a módszerrel független lókuszok ezreinek gyors szűrését lehet elvégezni. AFLP-vel tízszer több (20–100) lókuszt lehet detektálni, mint RAPD-dal. Az AFLP-markerek viszont domináns, mendeli öröklődést mutatnak, így a homo- és a heterozigótákat nem lehet a mintázat alapján megkülönböztetni.

Alkalmazási területek:

  • géntérképezés (a genetikai és a fizikai térképek közötti különbséget is áthidalhatja),

  • bulk szegregációs analízis,

  • nemesítési alapanyagok genetikai különbözőségének a vizsgálata (23. ábra),

  • fajtavédelem.

23. ábra - E-CAG/M-AGG primer párral létrehozott AFLP-polimorfizmus A nyilak az AFLP-markerként felhasználható polimorf PCR-fragmentumokat jelzik, amelyek 80-300 bp hosszúak. Az 1-19 minták termesztett szója (G. max.) fajták, a 10-19 jelűek pedig vad szójafajok (G. sója). (Maughan és mtsai, 1996)

E-CAG/M-AGG primer párral létrehozott AFLP-polimorfizmus A nyilak az AFLP-markerként felhasználható polimorf PCR-fragmentumokat jelzik, amelyek 80-300 bp hosszúak. Az 1-19 minták termesztett szója (G. max.) fajták, a 10-19 jelűek pedig vad szójafajok (G. sója). (Maughan és mtsai, 1996)


Maughan és mtsai (1996) genetikailag nagyon eltérő vad és termesztett szója nemesítési alapanyagok diverzitását tanulmányozták 15 AFLP-primer párral, és 274 polimorf fragmentumot találta. Az RFLP-próbákkal és a mikroszatellitekkel egy, a RAPD-okkal pedig primerenként mindössze 0,5 polimorf lókuszt mutattak ki. Smith és mtsai (1994) kimutatták, hogy 20 AFLP-primer párral végzett analízis eredményei 35 beltenyésztett kukoricavonal esetében szoros korrelációban volt az F1 szemterméssel, a heterózis hatással, a pedigrével és az RFLP-adatokkal.