Ugrás a tartalomhoz

Genetikai variabilitás a növénynemesítésben

Hajósné Dr. Novák Márta

Mezőgazda Kiadó

4.4. Molekuláris markerezési eljárások a kertészeti növényeknél

4.4. Molekuláris markerezési eljárások a kertészeti növényeknél

A kertészeti növények – a paradicsom kivételével – korábban csak valamilyen speciális szempont alapján – mint pl. jó in vitro tenyészthetőség és regenerációs képesség (sárgarépa, dohány, petúnia) transzpozonok tanulmányozása (Antirrhinum) – kerültek a molekuláris vizsgálatok porondjára és esetenként kapcsolatba a molekuláris markerezéssel. A 90-es évek közepére viszont már minden növénycsaládban, a gazdaságilag vagy genetikailag érdekes fajokkal – számos kutató- és nemesítő helyen egyidejűleg – megindult a markerezés. A párhuzamos izoenzim-, RAPD-, illetve AFLP-, SSR- stb. vizsgálatok kiegészítik egymást, mert sokszor más a növényanyag (eltérő fajták, más nemesítési alapanyagok) és sokszor mások a kitűzött célok is (fajta-összehasonlítás, genomanalízis, molekuláris markerre alapozott szelekció [„Marker Assisted Selection”, MAS] vagy genetikai térkép készítése). A néhány felsorolt példa és az 5. táblázat a teljesség igénye nélkül kíván képet adni a kertészeti növényeknél alkalmazott molekuláris módszerekről és eredményekről.

5. táblázat - Kertészeti növényeknél alkalmazott molekuláris markerezési eljárások és eredmények

Magyar

Latin

Molekuláris markerezési

eljárások

eredmények

név

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

GT

FR

Zöldségfélék

Bab

Phaseolussp.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

2,3,4

Schneider és mtsai, 1997

Vignasp.

+

+

Borsó

Pisum sp.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

3,4

Csicseriborsó

Cicer arietimim

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

3

Lencse

Lens culinaris

+

+

+

+

+

+

3

Káposztafélék

Brassica sp.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

4

Osborn és mtsai, 1997

Sárgarépa

Daucus carota

+

+

+

3,4

Schulz és mtsai, 1994

Paprika

Capsicum annuum

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

2,3,4,

Lefebvre és mtsai, 1995

Paradicsom

Lycopersicon sp.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

2,3,4,5,6

Yoder, 1993

Görögdinnye

Citrulhis lanatus

+

+

+

+

+

2

Sárgadinnye

Cucumis méh

+

+

+

+

+

+

+

3,4

Katzir és mtsai, 1996

Uborka

Cucumis sativus

+

+

+

+

+

+

+

+

2,3,4,6

Serquen és mtsai, 1997

Vöröshagyma

Allhim cepa

+

+

+

Bark és mtsai, 1994

Csemegekukorica

Zeamays

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

3,4,5,

Gyümölcsfélék

Alma

Malus domestica

+

+

+

+

+

+

+

+

3,4

Conner és mtsai, 1997

Körte

Pyrus communis

+

+

2

Cseresznye

Prunus aviwn

+

+

Stockinoer és mtsai, 1996

Meggy

Prunus cerasus

+

+

Őszibarack

Prunus perska

+

+

3

Warburton és mtsai, 1996

Sárgabarack

Prunus armeniaca

+

+

Dió

Juglans regia

+

+

Szamóca

Fragaria sp.

+

Davis és Yu, 1997

Avokádó

Avocado sp.

+

+

+

3,4,6

Szőlő

Vitissp.

+

+

+

+

+

+

+

+

3,5

Vignani és mtsai, 1996

Gyógy- és fűszernövények

Cickafark

Achilleasp.

+

+

Gyűszűvirág

Digitális sp.

+

Útifű

Plantago sp.

+

Zsálya

Salvia sp.

+

Libatop

Chenopodium sp.

+

Menta

Mentha sp.

+

Mustár

Brassica juncea

+

+

+

+

+

4

Cheuno és mtsai, 1997

Dísznövények

Szegfű

Dianthus caryophyllus

+

+

+

+

+

Tzuri és mtsai, 1991

Rózsa

Rosa sp.

+

+

Gerbera

Gerbera sp.

+

+


Jelmagyarázat: l - Fehérjeprofll, 2 - Izoenzim, 3 - RAPD, 4 - RFsLP, 5 - AFLP, 6 - VNTR, 7 - NIL, 8 - RIL, 9 - BSA, 10 - MAS, 11 - QTL, GT - Géntérkép, FR - Föreferencia

A könyvben tárgyalt módszereket fel lehet használni a genetikai polimorfizmus vizsgálatára, a markeres szelekcióra, a genetikai térképezésre, a genomanalízisre, az evolúció során történt génáramlás tanulmányozására, az extrakromoszómális tulajdonságok vizsgálatára, a géndetektálásra transzgénikus növényekben, valamint a kórokozók kimutatására és jellemzésére.

A genetikai polimorfizmus vizsgálata szinte minden faj esetében megindult. Időrendileg az izoenzim-vizsgálat (pl. alma, kajszi- és őszibarack), majd a RAPD-módszer került széleskörű alkalmazásra. A nagy- vagy kielégítő mértékű genetikai variabilitással rendelkező növényeknél már az izoenzim- és RAPD-módszer (szőlő, kajszi, zeller) is igen eredményes lehet, de klónok, közel rokon fajták közötti különbségtételre az AFLP, az SSR, az ISTR vagy a SCAR javasolt. Eddig számos esetben (pl. Cicer, Cucumis, Citrullus, Galium fajoknál) adott jó eredményt az ismétlődő szekvenciákon (VNTR) alapuló különbségtétel – főleg a mikroszatellitek (SSR) – alkalmazása.

A minőségbiztosítás, a fajtatisztaság és a fajtavédelem területén az izoenzim-vizsgálatokat már rutinszerűen alkalmazzák kukoricánál, babnál és paprikánál (pl. hibriditás ellenőrzésére). De terjed a genommarkerek használata is, amelyek a jogi védelemben egyre fontosabb szerepet játszanak (pl. dinnyék esetében az AFLP). A hibridek vizsgálata a távoli keresztezések esetén kutatási céllal folyik. A hibridjelleg kimutatására Cucumis, Daucus, Prunus, Vitis fajhibrideknél az izoenzimeket, Allium fajhibrideknél az allotetraploid eredet tisztázására pedig az RFLP-vel kombinált citogenetikai módszert és RAPD-technikát alkalmazták sikerrel. A burgonya és a paradicsom szomatikus keresztezésével nyert nemzetséghibrideket mind izoenzim-technikával, mind pedig RFLP-vel és RAPD-dal is vizsgálták.

Markeres szelekciót (MAS) használtak beltenyésztett vonalak azonosítására babnál és borsónál (RAPD); monogénes rezisztencia – paradicsomnál nematódarezisztencia (izoenzim, RFLP, RAPD, SCAR), paprikánál dohány mozaikvírus-rezisztencia (RFLP), borsónál lisztharmat-, fuzárium- és vírusrezisztencia követésére. Gyümölcsfáknál, dísznövényeknél, arborétumi anyagoknál (nyárfa) a korai, differenciáló morfológiai bélyegek hiánya miatt, a magoncok kiválogatására (fenyőfélék) használták (RAPD). Mennyiségi tulajdonságok, illetve az ezekért felelős lókuszok követése történt pl. a nem meghatározása (uborka), a hajtáshossz, a koraiság, a gyümölcssúly (uborka, dinnye, paradicsom), a virágzási idő (káposztafélék), a paradicsom sárga levélsodróvírus- és rovarrezisztencia (paradicsom – RAPD), a részleges uborka mozaikvírus-rezisztencia (paprika – RAPD), a gyümölcshússzín (őszibarack – RAPD), a faminőség (Eucaliptus – RAPD) vizsgálatának esetében. Babnál MAS segítségével folyik a mono- és a poligénes jellegek összeépítése, és már sikerült halmozott baktérium- (Pseudomonas-, Xanthomonas-), vírus-, gomba-, nematóda-rezisztenciát és kedvező QTL-eket összeépíteni.

A genetikai térképezés legtöbb eredményt a paradicsom esetében hozott. Mind hagyományos, mind molekuláris markerekkel készültek kapcsoltsági térképek, és jelenleg az egyik legtelítettebb komplex kapcsoltsági géntérkép áll rendelkezésre. Különböző kiterjedésű, teljes és részleges térképek készültek pl. bab (izoenzim, RFLP, RAPD), mandula (izoenzim+RFLP-394cM), káposzta (RFLP-921cM, AFLP-615cM), Brassica napus (RFLP-1016cM), B. campestris, uborka (RAPD-600cM), hagyma (RAPD), spárga stb. vonatkozásában. A gyengén polimorf sárgadinnyénél az AFLP-markerek hatékonyabbak voltak a mikroszatellit (SSR) és RAPD-markereknél. A térképek lehetővé teszik a térképezésen alapuló génizolálást. De eredményes a fordított eljárás is: génkönyvtárból történő génizolálás (káposzta, paradicsom) pl. homológ (Arabidopsis) szekvenciák alapján, majd a megismert gén helyének azonosítása a géntérképen.

A genomanalízisek hasznos információkat adhatnak a nemzetségek rokonsági fokáról. Bab és szója esetében egy adott lókusz szekvenciájának változása, továbbá RFLP- vagy ctDNS-analízis alapján meg lehetett állapítani közöttük a rokonsági fokot. Fűféléknél az evolúciós leszármazást tárták fel, a burgonya, a paradicsom és a paprika esetében pedig genom homológiát és kromoszómaszerkezet, illetve génsorrend azonosságokat és különbségeket mutattak ki (RAPD, RFLP, kromoszóma in situ hibridizáció). A részleges és teljes géntérképeken alapuló összehasonlító genomanalízisre még csak kevés kertészeti faj esetében (pl. Lycopersicon, Solanum, Capsicum, Brassica, Allium nemzetségekben) van lehetőség.

Extrakromoszomális tulajdonságok vizsgálatánál az organellumok jellemzésére is használják a DNS-markereket (RAPD, RFLP). Így pl. a cikória és a napraforgó cibridek tanulmányozásánál alkalmazták. Káposztaféléknél és hagymánál a hímsterilitást, uborkánál az apai mitokondriális öröklődést vizsgálták mtDNS markerekkel.

A szelekció során gyakran szükséges a növényekben az idegen gének jelenlétének kimutatása. Ezeket a géneket a Southern hibridizáción alapuló eljárásnál gyorsabb PCR-technikával detektálják a pl. a tojásgyümölcs, a sárgadinnye, a szilva, a kajszi és a paradicsom esetében.

A kórokozók kimutatása és jellemzése a hagyományos módszerek mellett, amelyekkel pl. a kórokozókra jellemző fehérjék (pl. vírus köpenyfehérjék) kimutatására van lehetőség, újabban nukleinsav detektálási módszerekkel is folyik. Itt a kórokozók – pl. vírusok, mikoplazmák, gombák – genomjának kimutatására és jellemzésére van lehetőség. Ezt a technikát már eredményesen alkalmazták pl. alma, csonthéjasok, szőlő, dísznövények kórokozói esetében és vetőmagvak fertőzöttségének kimutatására.

A molekuláris módszerekkel kapott hazai eredmények a kertészeti növények esetében szerényebbek, mint a gabonafélékkel elértek (MTA Mezőgazdasági Kutató Intézete Martonvásár, GK KHT Szeged), vagy amelyekkel a lucerna géntérképezésében az MTA Szegedi Biológiai Központ munkatársai nemzetközileg is kiemelkedtek. A kertészeti növényekkel végzett hazai markerezési eredmények közül elsősorban a gödöllői Mezőgazdasági Biotechnológiai Központban a paprika polimorfizmusát feltáró és a MAS-t segítő AFLP, mikroszatellit és RAPD-markerekkel végzett munkát kell kiemelni. Ennek során fajtaazonosítási, fajtavédelmi problémák megoldásán túl TMV-, Xanthomonas- és fonálféreg-rezisztencia kimutatását oldották meg. Az OMMI laboratóriumában a rutinszerű fajta- és hibridvizsgálatokhoz használt izoenzimes módszereket a kertészeti növényeknél is alkalmazni kezdték (paprika, bab). A gazdaságilag fontos és a nemzetközileg is jelentős hazai szőlő génanyag feldolgozása genommarkerekkel (RAPD) nemzetközi kooperációban az egri kutatóintézetben indult el. Taxonómiai, populációgenetikai vizsgálatok folytak (izoenzim markerekkel) termesztett és vad paprika fajokkal hagymás növényekkel (izoenzim markerekkel), újabban pedig fás növényekkel (RAPD) az ELTE Genetikai Tanszékén. A GATE Genetika és Növénynemesítés Tanszékén is színvonalas izoenzimes munka folyik, esetenként kertészeti növényekkel. A paprikanemesítésben Keszthelyen a Pannon Agrártudományi Egyetemen megkezdték a RAPD-markerek használatát. A paradicsom esetében a fonálféreg-rezisztencia izoenzimes markerezését éveken át rutinszerűen végezték a Kertészeti Kutató Intézet Kecskeméti Telepén, mely munka a Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetemen folytatódott. Az utóbbi egyetem Genetika és Növénynemesítési Tanszékén izoenzimes és RAPD-vizsgálatok folynak nemesítési és taxonómiai céllal bab, kajszi, szőlő, görög- és sárgadinnye vonatkozásában, és új biokémiai markerezési eljárások – metilezéssel összefüggő rezisztenciafaktorok OPTLC-s kimutatásának – fejlesztése is folyik. A NIR-technika egyik hazai bázisát a Központi Élelmiszeripari Kutató Intézetben hozták létre, ahol szójafajták elkülönítő jellemzésére indultak meg a vizsgálatok, a Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetemen pedig számos kertészeti növény esetében a minőségellenőrzésében (meggy, cseresznye, alma stb.) és genetikai vizsgálatokban (dinnye, bab) alkalmazzák.