Ugrás a tartalomhoz

Genetikai variabilitás a növénynemesítésben

Hajósné Dr. Novák Márta

Mezőgazda Kiadó

5.2. Az izoenzim-mintázatok kiértékelése

5.2. Az izoenzim-mintázatok kiértékelése

A géllapokon megfigyelhető izoenzim-mintázat lehet szimmetrikus és aszimmetrikus. Amennyiben a gyors és a lassú elektroforetikus mobilitású formákat kódoló allélek (F és S) egyenlő hányadban járulnak hozzá az enzimaktivitáshoz és az alegység-kombináció véletlen, akkor szimmetrikus a mintázat. Ez a heterozigóta-mintázat sávjainak az intenzitásából állapítható meg; monomer heterozigótáknál a sávok intenzitása 1:1, a dimereké 1:2:1, a trimereké 1:3:3:1, a tetramereké pedig 1:4:6:4:1 (4b ábra).

Aszimmetrikus mintázat akkor látható a géllapokon, ha az egyik allél által kódolt polipeptid a teljes aktivitáshoz kevésbé járul hozzá, mint a másik. Ezt okozhatja eltérő szintézisráta, kevésbé stabil alegység vagy eltérő katalitikus tulajdonságok. Az eltérő szintézisráta szervspecifikus reguláció következménye is lehet. Az alkohol dehidrogenáz-1 gén alléljainak (Adh1-F és Adh1-S) kvantitatív és szervspecifikus szabályozása figyelhető meg kukoricában. Az elsődleges gyökérben és a mezokotilban az Adh1-F allél expressziója mintegy kétszerese az Adh1-S allélének. A scutellumban (pajzsocska) egyforma a két allélforma aktivitása. Tehát a kukorica elsődleges gyökerében és a mezokotilban az F- és az S-allélek által kódolt polipeptidek (alegységek) 2:1 arányban, a pajzsocskában pedig 1:1 arányban képződnek. Így a heterozigótákban a dimer enzim aktivitása 4:4:1, illetve 1:2:1. Aszimmetrikus mintázat esetén feltétlenül szükség van a heterozigóta sávmintázatok denzitometrálására és annak megállapítására, hogy a kapott sávintenzitások megegyeznek vagy megbízhatóan eltérnek az elméletileg várt arányoktól. Ezt κ2 próbával ellenőrizzük. A 27. ábrán Adh1-FFFS triplex genotípusú heterozigóták sávintenzitásának denzitogramját mutatjuk be tetraploid kukorica scutellumában. Az Adh1-FFFS triplex heterozigótákra jellemző 9:6:1 sávintenzitás helyett 4:3:1, illetve 3:4:1 arányokat kaptunk, amely megbízhatóan eltért az elméletileg várttól (Hajós-Novák és mtsaii, 1994). Ezt feltehetően az okozta, hogy az egyik allélt kódoló polipeptid kevésbé járult hozzá az enzim teljes aktivitásához.

27. ábra - A sávok intenzitásának alakulása Adhl-FFFS triplex heterozigóta tetraploid kukorica pajzsocskájában (Hajós-Novák és H. Nagy, 1994)

A sávok intenzitásának alakulása Adhl-FFFS triplex heterozigóta tetraploid kukorica pajzsocskájában (Hajós-Novák és H. Nagy, 1994)


Mivel az izoenzim-mintázat nem csak sejt-, szövet- és szervspecifikus, hanem fejlődési állapottól is függ, ezért csak azonos fejlettségi állapotú egyedekről származó minták izoenzim mintázatát lehet összehasonlítani.

Az izoenzim-aktivitásra festett géleken minden egyes horizontális zóna egy lókuszt képvisel. Ezek a lókuszok vagy polimorfok, vagy nem. Az egy lókuszon belüli alléleket az eltérő elektroforetikus mobilitású sávok jelzik, amelyek közül – anód irányú vándorlás esetén – a szeparálógél tetejéhez legközelebbi sáv a lassú (Slow=S), a legtávolabbi pedig a gyors (Fast=F) elektroforetikus mobilitású forma. Ez figyelhető meg az egy lókuszos kétalléles izoenzimek esetében. Ha három vagy négy allél van jelen egy zónán (lókuszon) belül, akkor azokat relatív mobilitásuk alapján 1-től kezdődően számozzuk (a leggyorsabb elektroforetikus mobilitású kapja az 1-es számot). A lókuszokat az ABC betűivel jelöljük. A 28. ábrán látható, hogy a Fenyőfű melletti erdeifenyő (Pinus sylvestris) populációban a leucin-aminopeptidáz (LAP) enzimnek két génje (A és B) két-két alléllel (A1 és A2, illetve B1 és B2) volt aktív a tűlevelekben.

28. ábra - Fenyőfűi erdeifenyő (Pinus sylvestris) populáció leucin-aminopeptidáz (LAP) mintázata. A LAP izoenzimnek két génje (A, B) két-két alléllel aktív a tűlevelekben (Földvári, 1989)

Fenyőfűi erdeifenyő (Pinus sylvestris) populáció leucin-aminopeptidáz (LAP) mintázata. A LAP izoenzimnek két génje (A, B) két-két alléllel aktív a tűlevelekben (Földvári, 1989)


A vizsgált 48 erdeifenyő közül 2 db A1A1 B1B1, 1 db. A1A2 B1B2 és 45 db A2A2 B2B2 genotípusú volt (11. táblázat). Polimorfizmus vizsgálatok során ezen adatokból a különböző LAP-allélek gyakorisága az alábbi módon számítható ki:

A1 allél gyakorisága:

p (A1) = (2 A 1 A 1 )+ A 1 A 2 2 vizsgáltegyedszám= (22)+1 2 48=0,052 MathType@MTEF@5@5@+=feaafiart1ev1aqatCvAUfeBSjuyZL2yd9gzLbvyNv2CaerbuLwBLnhiov2DGi1BTfMBaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacHOWxf9irVeeu0dXdh9vqqj=hEeeu0xXdbba9frFf0=OqFfea0dXdd9qqaq=JfrVkFHe9pgea0dXdar=Jb9hs0dXdbPYxe9vr0=vr0=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@7114@

A2 allél gyakorisága:

p(A2) = 1 – p(A1) = 1 – 0,052 = 0,948

B1 allél gyakorisága:

p (B1) = (22)+1 96 =0,052 MathType@MTEF@5@5@+=feaafiart1ev1aqatCvAUfeBSjuyZL2yd9gzLbvyNv2CaerbuLwBLnhiov2DGi1BTfMBaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacHOWxf9irVeeu0dXdh9vqqj=hEeeu0xXdbba9frFf0=OqFfea0dXdd9qqaq=JfrVkFHe9pgea0dXdar=Jb9hs0dXdbPYxe9vr0=vr0=vqpWqaaeaabaGaaiaacaqabeaabaqaamaaaOqaaiaadchadaWgaaWcbaGaaiikaiaadkeacaaIXaGaaiykaaqabaGccqGH9aqpdaWcaaqaaiaacIcacaaIYaGaeyyXICTaaGOmaiaacMcacqGHRaWkcaaIXaaabaGaaGyoaiaaiAdaaaGaeyypa0JaaGimaiaacYcacaaIWaGaaGynaiaaikdaaaa@4384@

B2 allél gyakorisága:

P(B2) = 1 – 0,052 = 0,948

11. táblázat - A lehetséges LAP-izoenzim genotípusok száma és tényleges gyakorisága erdeifenyő (Pinus sylvestris) populációban két gén és lókuszonként két-két alléi esetében (FÖLDVÁRI, 1989)

Lehetséges genotípusok

B-lókusz

A-lókusz

----

----

AiAiBiBi

----

----

----

AiAiBiB2

----

----

AiAiB2B2

Gyakoriság (db)

2

0

0

B-lókusz

A-lókusz

----

----

----

AiA2BiBi

----

----

----

----

AiA2BiB2

----

----

----

AiA2B2B2

Gyakoriság (db)

0

1

0

B-lókusz

A-lókusz

----

----

A2A2BiBi

----

----

----

A2A2BiB2

----

----

A2A2B2B2

Gyakoriság (db)

0

0

45


Az eredményekből tehát az állapítható meg, hogy a vizsgált Pinus sylvestris populáció a LAP-gén vonatkozásában nem nagy polimorfizmust mutat, mert a lehetséges 9 genotípus közül csak három jelent meg. A tanulmányozott egyedek 94%-a a négy allél közül az A2-t és a B2-t hordozza legnagyobb gyakorisággal.

A sávok helyzetét a gélen az előzőekben ismertetett kódolás után mobilitásuk szerint kétféleképpen is jellemezhetjük:

  1. az ismeretlen sávnak a szeparáló gél tetejétől mért távolságát osztjuk a gél hosszával, vagy

  2. az ismeretlen sáv szeparáló gél tetejétől mért távolságát osztjuk a gél közepén lévő sáv szeparáló gél tetejétől mért távolságával és szorozzuk 50-nel (a gél közepén lévő sáv relatív mobilitásával). A távolságokat mm-ben adjuk meg.

Ez különösen ajánlatos akkor, ha egy izoenzim génnek kettőnél több allélje van. De így tudjuk kimutatni és jellemezni a töltésváltozás következtében fellépő eltérő mobilitású, új elektroforetikus variánsokat is.

Néha két vagy több enzimlókusz termékei elfedik egymást vagy együtt vándorolnak. Ha ez a citoplazmában, a kloroplasztiszban és a mitokondriumban is működő enzimeknél fordul elő, akkor vagy megváltoztatjuk az elválasztási körülményeket, vagy egyetlen sejtfrakcióból izoláljuk az enzimet.

Ha az izoenzimek nem válnak jól szét a gélen, akkor a heterozigóta mintázat egyetlen széles sáv lesz a várt két vagy három külön sáv helyett. Nulla allél esetében a monomer és a dimer enzimek a homo- és a heterozigótákat nem különböztetik meg; trimerek és tetramerek esetében heterozigótáknak a vártnál kevesebb, de legalább kétsávos a mintázata.