Ugrás a tartalomhoz

Genetikai variabilitás a növénynemesítésben

Hajósné Dr. Novák Márta

Mezőgazda Kiadó

9. fejezet - 7. Elválasztástechnika

9. fejezet - 7. Elválasztástechnika

7.1. Az elektroforézis elve

Egy oldatban lévő különböző molekulatömegű és töltésű (ionizált) részecskék elektródák (anód: +, katód: –) közötti elektromos erőtér hatására ellentétes töltésük szerint vándorolnak. Ezt elektroforézisnek nevezzük Ma széles körben alkalmazzák, elsősorban peptidek, fehérjék (izoenzimek és nem enzim jellegű fehérjék) és nukleinsavak elválasztására.

Az elektroforetikus szétválasztás történhet szűrőpapíron, membránokon, valamint különböző géleken (pl. keményítő, poliakrilamid, agaróz). A keményítő és a poliakrilamid géleknél az elektroforézis során a töltés szerinti elválasztás mellett „molekulaszűrő hatás” is fellép. Az a gélszerkezet, amelynek átlagos pórusnagysága közel esik az elválasztandó ionok méretéhez, az ionokkal szemben „szűrőként” viselkedik. Az átlagos pórusnagyságot jelentősen meghaladó ionok nem vagy csak lassan, a kisebb ionok gyorsabban hatolnak át a gél pórusain.

7.1.1. Az izoenzimek elválasztása gélelektroforézissel

Mivel az izoenzimek fehérjék, ezért elektroforézissel elválaszthatók és enzimspecifikus festéssel láthatóvá tehetők. Az UPOV a fajtaazonosság és/vagy -különbözőség vizsgálatát az izoenzimek felhasználásával egységes rendszer szerint keményítő gélen végzi. A keményítő gélnek az az előnye, hogy nem mérgező és egy vastag gél kiöntése után, annak több lapra vágásával egyszerre többféle izoenzimet lehet tanulmányozni. Nagyobb feloldóképessége miatt azonban egyre inkább a polakrialmid gélt használjuk, amelynek porózus szerkezete akrilamid (CH2 = CH-CO-NH2) polimerizációjával jön létre a keresztkötést biztosító N,N’-metilén-bisz-akrilamid (CH2 = CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH = = CH2) jelenlétében. A polimerizáció eredményeként színtelen, átlátszó, rugalmas, szilárd, forralásnak és fagyasztásnak ellenálló gél keletkezik. A gél sűrűségét, viszkozitását és pórusméretét az akrilamid és a bisz-akrilamid koncentráció határozza meg. A polimerizációhoz szabad gyökök képződése szükséges, amely termo- vagy fotokatalitikusan indítható meg.

A poliakrilamid lapgél két részből áll: tömörítő gélből és elválasztó gélből. A tömörítő gél 3% akrilamidot tartalmaz, nagy pórusú, feladata a mintafehérjék koncentrálása. Molekulaszűrő hatást nem fejt ki, csak a minták diffúzióját korlátozza. Az elválasztó gél az elválasztandó izoenzim molekulatömegétől függően 420% akrilamidot tartalmaz, kis pórusú, itt történik a fehérjeminták szétválasztása. A poliakrilamid gél lehet homogén, azonos pórusméretű vagy pórus grádiens (PoroPAGE), amikor a gél koncentrációja a fehérjék vándorlásának irányába nő. Grádiens gélen a sávok élesebbek. A gél koncentrációját növényfajonként és izoenzimenként előkísérletben állapítjuk meg.

Az izoenzimek elválasztásakor leggyakrabban lúgos diszkontinuus pufferrendszert alkalmazunk (Orstein, 1964 és Davies, 1964), amelyben az elektródpuffer TRIS-glicin (pH = 8,3), a tömörítő és a szeparáló gél pedig eltérő pH-jú Tris-HCl-puffert tartalmaz (pH = 6,7, illetve 8,9). Ebben a rendszerben a részecskék vándorlása a negatív pólustól a pozitív felé történik, vagyis anód irányú. Vannak azonban katód felé vándorló izoenzimek is, pl. a kukorica-észteráz-1 (EST-1), amelyek ebben a rendszerben nem vizsgálhatók.

Növényi izoenzimeket friss, ritkán – 80 °C-ra lefagyasztott növényi sejtekből, szövetekből, szervekből (pl. kallusz, scutellum, endospermium, gyökér, sziklevél, csíranövény, levél, szár, bibe, portok, pollen stb.) lehet izolálni. Liofilizált anyagból nem lehet aktív izoenzimeket kivonni.

Mivel az enzimaktivitást mind az izolálás, mind pedig az elektroforézis alatt is fenn kell tartani, ezért az extrakciót előhűtött dörzsmozsarakban, 4 °C-os izoláló oldattal kell végezni. Az izolátumokat az izolálás befejezéséig jégen tartjuk, majd 4 °C-on centrifugáljuk. A leggyakrabban használt izoláló 50 mM Tris-HCl-t (pH = 8,3), 5 mM dithiotreitolt és 20% (w/v) cukrot tartalmaz. A lecentrifugált izolátumok felülúszó részét az üveglapok közé kiöntött gélre, a tömörítő gélben kialakított mintahelyekre visszük fel. Az elektroforézist gyárilag vagy házilag készített készülékekben végezzük (34. ábra), amelyek a géllapok helyzetétől függően horizontálisak vagy vertikálisak. A futtatás 4 °C hőmérsékleten történik.

34. ábra - A vertikális elektroforézis-készülék rajza

A vertikális elektroforézis-készülék rajza


Az izoenzimeket elektroforézis után in situ enzimspecifikus festéssel tesszük láthatóvá. A dehidrogenázokat a gélek tetrazolium sóban történő inkubálása után tudjuk lokalizálni. Inkubálás után a tetrazolium só terminális elektronakceptorként működik, redukálódik és csapadékot ad. Az NBT és az MTT fényérzékeny tetrazolium sók, ezért az inkubálást PMS jelenlétében, sötétben végezzük. A reakció eredményeképpen kék színű csapadék, formazán képződik (35. ábra).

35. ábra - A dehidrogenázok kimutatásának elve

A dehidrogenázok kimutatásának elve


A hidrolázok színes fluoreszcens terméket adó homogén vagy fluorogén szubsztrátokkal azonosítók.

A transzferázokat és izoemrázokat ezzel a módszerrel nem tudjuk tanulmányozni. Ezeknél a hívóoldatban segédenzimeket is alkalmazunk, amelyek az enzimterméket egy olyan termékké alakítják át, amellyel a hívóoldatban lévő dehidrogenázok reakcióba léphetnek. A segédenzimek alkalmazásakor színes termék csak a gél felszínén képződik.

A foszfatázok és észterázok hidrolizálják az α- és β-naftil-származékokat, és ezáltal α- és β-naftolt szabadítanak fel. Ezen termékek „azo festékkel” történő egyesítése után színes csapadék keletkezik.

A gélek festőoldatba helyezése után a sávok előhívása legtöbbször szobahőmérsékleten (25–30 °C) vagy termosztátban 37 °C-on, nagyon ritkán ennél magasabb hőmérsékleten történik. Az enzimspecifikus festéseket jobb sötétben végezni, mert pl. a tetrazolium sók fény hatására redukálódnak, a háttér sötét lesz, és így a sávok kevésbé láthatók. A Fast Blue BB diazonium só már kevés fény hatására is inaktiválódik. Ha a sávok elég élesek, akkor a reakciót általában 7%-os ecetsavban állítjuk le, peroxidáznál desztillált vízben, a 6-PGDH esetében pedig 50%-os ethanolban.

A továbbiakban a 6%-os natív poliakrilamid gél készítéséhez szükséges oldatokat és néhány reakcióelegy összetételét adjuk meg.

A szeparáló gél készítéséhez szükséges oldatok:

Gélpuffer: 48 ml 1n HCl-ben felodunk 18,3 g Tris-HCl-t, majd desztillált vízzel 100 ml-re kiegészítjük.

Akrilamid törzsoldat: 30 g akrilamidot és 0,8 g N,N-metilén-bis-akrilamidot 100 ml desztillált vízben feloldunk.

Tarálypuffer: 6 g Tris-HCl-t és 28,8 g glikokollt 1000 ml desztillált vízben feloldunk (pH = 8,3).

A tömörítő gél oldatai:

4. oldat: 48 ml 1n HCl-ben feloldunk 5,98 g Trisz-HCl-t, majd 100 ml-re kiegészítjük desztillált vízzel (pH = 6,7).

5. oldat: 10 g akrilamidot és 2,5 g N, N-metilén-bis-akrilamidot feloldunk 100 ml desztillált vízben.

6. oldat: 4 mg riboflavint 100 ml desztillált vízben oldunk fel (1 hétig áll el).

7. oldat: 10 g szacharózt feloldunk 25 ml desztillált vízben.

Gélkészítés: A felhasználásig hűtve tárolt oldatokat gélöntés előtt 10–15 perccel kivesszük a hűtőszekrényből. Először a szeparáló gélt készítjük el. Egy 8 cm × 8 cm × 0,2 cm-es laphoz 3,75 ml gélpuffert, 3 ml akrilamid törzsoldatot és 8,125 ml desztillált vizet mérünk össze. Ezután az oldatot vízsugár vákuumszivattyúval légtelenítjük, és adunk hozzá 270 μl 10%-os ammónium perszulfátot és 15 μl koncentrált TEMED-et. A géloldatot pipettával az összeragasztott lapok közé mérjük, és desztillált vizet rétegezünk a tetejére. Kb. 15–20 perc múlva, amikor gél megdermedt, leöntjük a tetejéről a desztillált vizet, és rápipettázzuk az alábbi összetételű tömörítő gélt: 1ml 4-es + 2 ml 5-ös + 1 ml 6-os + 4 ml 7-es oldat. A tömörítő gélbe belehelyezzük a fésűt (mintahelyek), majd UV lámpa alá tesszük, hogy a polimerizáció végbemenjen. Amikor opálos fényű a gél, akkor kivesszük a lámpa alól, és ha másnap használjuk fel, akkor hűtőszekrénybe tesszük. Felhasználás előtt a zsebekből kivesszük a fésűt és desztillált vízzel feltöltjük. Ezután a lapokat a készülékre erősítjük. A mintákból 20–40 μl-t teszünk pipettával a zsebekbe. Minden mintához új pipettahegyet használunk. A futtatást 200 V feszültségnél és laponként 15 mA áramerősségnél végezzük. A futtatási idő 4–5 óra. Amikor a minták elérték a gél alját, a tápegységet kikapcsoljuk, a gélt kivesszük az üveglapok közül, majd az alábbi hívóoldatok valamelyikébe tesszük.

1) ALKOHOL DEHIDROGENÁZ (ADH)

Alkohol: NAD+ oxidoreduktáz (E.C.1.1.1.1.)

Reakció: Alkohol + NAD+ → Aldehid vagy keton + NADH

Festés: Tetrazolium rendszer

Festőoldat:

0,1 M Tris-HCl

100 ml

pH = 7,5

NAD+

30 mg

MTT

20 mg

PMS

4 mg

Ethanol

6 ml

Festés: enzimaktivitástól függően 15–60 percig sötétben. Reakció leállítása 7%-os ecetsavban.

2) GLÜKÓZ-6-FOSZFÁT-DEHIDROGENÁZ (6-PGDH)

D-glükóz-6-foszfát: NADP+ →1-oxidoreduktáz (E.C.1.1.1.49)

Reakció: D-Glükóz-6-P +NADP+ → 6 PG + NADPH

NADPH + MTT + PMS → formazán (szín) + NADP

Inkubálás sötétben 37 °C-on 1 órát. Öblítés desztillált vízben, a reakció leállítása 50%-os etanolban.

3) GLUTAMÁT DEHIDROGENÁZ (GDH)

Glükóz + NAD → glükoniksav + NADH

NADH + MTT + PMS → Formazán (színes csapadék) + NAD

Festőoldat:

0,1 M Tris-HCl

100 ml

pH = 7,5

10 mM CaCl2

0,2 ml

Nátrium-glutamát

800 mg

NAD+

30 mg

NBT

20 mg

PMS

4 mg

Inkubálás sötétben 30 °C-on 30 perctől–2 óráig. Öblítés desztillált vízben, fixálás 50%-os etanolban.

4) IZOCITRÁT DEHIDROGENÁZ (IDH) (E.C.1.1.1.42)

Threo-Ds-izocitrát + NADP+ → 2-Oxoglutarát + CO2 + NADPH

Reakcióelegy:

0,1 M Tris-HCl

100 ml

pH = 7,5

1 M MnCl2

1 ml

DL-Izocitrát (Na3)

100 mg

NADP+

15 mg

MTT

20 mg

PMS

4 mg

Inkubálás sötétben 37 °C-on 30 perctől 1 óráig. Öblítés desztillált vízben, majd fixálás 50%-os ethanolban.

5) almasav DEHIDROGENÁZ (MDH)

L-Malát : NAD+ oxidoreduktáz (E.C.1.1.1.37)

l-Malát + NAD → Oxálacetát + NADH

NADH + MTT + PMS → NAD + Formazán (színes csapadék)

Reakcióelegy:

0,1 M Tris-HCl

100 ml

pH = 7,5

1M DL-Malát

1 ml

pH = 7,5

NAD+

30 mg

MTT

20 mg

PMS

4 mg

Festés sötétben 37 °C-on, amíg a kék sávok meg nem jelennek. Öblítés desztillált vízben, fixálás 50%-os ethanolban.

6) SIKIMISAV DEHIDROGENÁZ (SKDH vagy SAD) (E.C.1.1.1.25)

Sikimát + NADP+ → 3-Dehidrosikimát + NADPH

Reakcióelegy:

0,1 M Tris‑HCl

100 ml

pH = 7,5

Sikimisav

100 mg

NADP+

15 mg

MTT

20 mg

PMS

4 mg

A gélt 30 perctől 1 óráig festjük sötétben 37 °C-on. Öblítés desztillált vízben majd fixálás 50%-os ethanolban.

7) ASZPARTÁT-AMINO TRANSZFERÁZ (GLUTAMÁT-OXÁLACETÁT TRANSZAMINÁZ = GOT) (E.C.2.6.1.1)

L-Aszpartát + 2-Oxoglutarát → Oxálacetát + L-Glutamát

Reakcióelegy:

A)

0,1 M Tris-HCl

100 ml

pH = 8,5

α-Ketoglutarát

100 mg

Aszpartátsav

200 mg

B)

Piridoxál-5-foszfát

10 mg

Fast Blue BB

150 mg

Az „A” oldatot legalább 15 perccel a felhasználás előtt elkészítjük, mert a savak nehezen oldódnak. Közvetlenül felhasználás előtt beleöntjük a „B” reagenseket tartalmazó lombikba. Az oldatnak sárga színűnek kell lenni. Ha sokáig tartjuk fényen, akkor a diazonium só inaktiválódik és az oldat barna színű lesz. Ekkor újat kell készíteni. A géleket sötétben, szobahőmérsékleten 1–2 óráig inkubáljuk, majd desztillált vízzel leöblítjük és 50%-os etanolban fixáljuk.

8) SAVAS FOSZFATÁZ (ACP) (E.C.3.1.3.2)

α-naftilfoszfát → foszfát + α-naftol

α-naftol + Fast garnet GB → színes festék

50 mM Na-acetát

100 ml

pH = 5,5

1 M Mg Cl2 6H2O

1 ml

Fast Garnet GB só

100 mg

1% β-Naftilsav-foszfát (50% acetonban)

3 ml

A pufferben először a diazonium sót oldjuk fel, majd hozzáadjuk a naftilfoszfátot. Ekkor az oldatban apró részecskék jelennek meg. Ezeket úgy lehet eltüntetni, hogy közvetlenül a gélre történő öntés előtt mágneses keverőre tesszük az oldatot. Az inkubálás sötétben, 30 °C-on 1–5 órát tart, amíg a lila vagy piros sávok meg nem jelennek. Ekkor leöntjük az oldatot, a gélt desztillált vízzel leöblítjük, majd 50%-os etanolban fixáljuk. Néhány perc múlva fényképezzük és/vagy számítógépbe visszük.

7.1.2. A tartalékfehérjék elválasztása gélelektroforézissel

A tartalékfehérjéket SDS-PAGE vagy savas PAGE-módszerrel választjuk el. Az SDS gélelektroforézis alkalmazásakor az izolálóban, a gélrendszerben és a tartálypufferben is van ionos detergens (sodium-dodecyl-szulfát = SDS). A fehérje-SDS-komplex az anód felé vándorol.

Az SDS-poliakrilamid gél tömörítő és elválasztó gélből áll. A tömörítő gél nagypórusú mintahelyeire tesszük fel a denaturált fehérje-mintákat (általában 10 μl-t). Az elválasztó gél lehet átlagos pórusméretű vagy grádiens gél.

Az elektroforézis után a sávokat hisztokémiai festéssel (Coomassie Blue R-250) vagy az ennél százszor érzékenyebb ezüstfestéssel tesszük láthatóvá.

A tartalékfehérjék savas közegben (savas PAGE) történő elválasztásakor mind a gél, mind pedig a pufferek savas kémhatásúak. A futtatás pedig a pozitív pólustól a negatív irányába történik. A savas PAGE-t búzagliadinok elválasztására az alábbiak szerint végezzük:

A búzaszemet dörzsmozsárban eldörzsöljük, majd kisméretű szitán átszitáljuk. A nyers lisztet eppendorfba tesszük és 200 μl 70%-os etanolt töltünk rá. Alaposan összekeverjük és egy éjszakán át állni hagyjuk. Felkeverés után centrifugáljuk (3500 ford/perc). A felülúszót új eppendorfba tesszük, majd 1:1 arányban jelzőfestéket tartalmazó oldatot teszünk hozzá.

Mintafelvivő oldat: 75 μl tartálypuffer, 25 μl glicerin, 0,15 mg brómfenolkék.

A jelzőfestéket is tartalmazó oldatból 20 μt-t viszünk fel a zsebekbe.

Savas PAGE-géloldatok. Akrilamid törzsoldat: 15 g akrilamidot, 0,75 g N,N-metilén-bis-akrilamidot és 0,2 g aszkorbinsavat 70 ml desztillált vízben feloldunk, majd 5 ml 0,1%-os FeSO4 oldatot adunk hozzá, és desztillált vízzel 100 ml-re kiegészítjük.

Gélpuffer: 2,56 ml ecetsavat desztillált vízzel 90 ml-re higítunk, majd az oldat pH-értékét 3,1-re állítjuk be glikokollal, és végül 100 ml-re egészítjük ki desztillált vízzel.

Katalizátor oldat: 1,4 g ammónium-perszulfátot kb. 60 ml desztillált vízben feloldunk, pH-értékét glikokollal 3,1-re állítjuk be, majd a térfogatát 100 ml-re egészítjük ki.

Tartálypuffer: 2500 ml desztillált vízben feloldunk 30 g glikokollt, majd ecetsavval az oldat pH értékét 3,1-re állítjuk be. Végül desztillált vízzel 3000 ml-re egészítjük ki.

Coomassie Brillant Blue G-250 színezőoldat: Szilárd Coomassie Blue G-250 színezékből desztillált vízben oldva 1%-os oldatot készítünk. Ebből 1 részt 19 rész 12,5%-os triklórecetsav oldattal keverve kapjuk a színezőoldatot. Ha Coomassie Blue R-250-et használunk, akkor a színezéket etanolban oldva készítjük el az 1%-os oldatot. Az elegyítési arány pedig 1:25. Szükség esetén a színező oldatot elkészítése után 20 perccel szűrni kell.

Gélkészítés. A felhasználásig hűtve tárolt akrilamid törzsoldatból és a gél-pufferoldatból 1:1 arányban elegyítjük a szükséges mennyiséget. Ezután az oldatot vízsugár vákuumszivattyúval légmentesítjük, majd 1,7 ml katalizátoroldatot adunk hozzá (120 ml géloldat esetén). A folyadékot a lapok közé öntjük és éjszakára a hűtőszekrénybe tesszük polimerizálni.

A minták futtatása. A polimerizálódott gélt a készülékbe helyezzük, figyelembe véve, hogy savas rendszerben a vándorlás a negatív pólus (katód) felé történik. A minta felvitele előtt a géllapot 30 percig 100 V egyenfeszültséggel előfuttatjuk.

A feszültségmentesítés után minden mintából 20 μl-t viszünk fel a mintatartó helyekre, majd 20 percre 6 mA egyenáramot kapcsolunk a készülékre. Ezután 400 V feszültség alá helyezzük a rendszert (40–50 mA). A futási idő 400 V-on 5–6 óra.

A gélek festése elektroforézis után. Az elektroforézis befejezése után a gélt néhány percre 12,5%-os triklór-ecetsav oldatba tesszük. Ennek leöntése után pedig a géleket 16–18 órára Coomassie Blue G festőoldatba, majd 2–3 órára desztillált vízbe helyezzük. Végül magát a gélt vagy fotóját beszkenneljük és számítógéppel kiértékeljük.