Ugrás a tartalomhoz

Genetikai variabilitás a növénynemesítésben

Hajósné Dr. Novák Márta

Mezőgazda Kiadó

7.2. A PhastSystem elektroforézis rendszer alkalmazása DNS-szintű polimorfizmus azonosítására

7.2. A PhastSystem elektroforézis rendszer alkalmazása DNS-szintű polimorfizmus azonosítására

A PhastSystem (Pharmacia) rendszer egy olyan gélelektroforetikus készülék, amelyben a mintafelvitel, az elválasztás és a festés is automatikusan, egy készülékben történik.

A készülék két részből áll: az egyik az elválasztó és szabályozó egység, amelyben

  1. beépített, programozható tápegység,

  2. a Peltier elemmel termosztált horizontális elválasztó lap két gél futtatására,

  3. az elektródok, valamint

  4. a mintafelvivő található.

A másik az előhívó egység, amely fűthető zárt kamra, ahol a festés és a háttér színtelenítése történik.

A készülék egyaránt felhasználható fehérjék és DNS elválasztására, DNS-markerek vizsgálatára. Attól függően, hogy milyen területen használjuk ezt a módszert, ki kell választanunk a megfelelő elválasztó rendszert. Ez a gélösszetétel, az alkalmazott pufferrendszer és az elektroforetikus futtatás körülményeinek optimalizálását jelenti. A gélek mérete mindössze 5x4 cm, vastagságuk 0,5 mm, és azok laboratóriumban elkészíthetők. Egyes típusok gyári kiszerelésben a kereskedelmi forgalomban is beszerezhetők. Egy-egy gélre 6–12 minta vihető fel.

A PhastSystem rendszert DNS-analízisre eddig az alábbi területeken használták:

  • pontmutáció kimutatására PCR-SSCP-analízissel,

  • mikroszatellita-analízisre,

  • RFLP-vel történő molekuláris taxonómiára.

A PhastSystem rendszer előnyei:

  • radioaktív izotópok helyett ezüstfestéssel oldja meg a DNS (vagy fehérje) kimutatását,

  • rendkívül érzékeny és éles elválasztást tesz lehetővé, van olyan pufferrendszerünk, amelyikben már egyetlen bázispárnyi hosszkülönbséget is ki tudunk mutatni, 200 bp körüli hossztartományban,

  • anyagigénye hallatlanul kicsi (pl. egyetlen nematodából, egyetlen pihetollból kifogástalan RFLP-mintázat nyerhető),

  • kezelése egyszerű,

  • gyorsasága rendkívül nagyszámú minta elemzését teszi lehetővé (az elektroforézis csak mintegy 20 percet igényel).

7.2.1. Egy illusztráció a PhastSystem alkalmazására entomopatogén (rovarpatogén) nematódafajok molekuláris taxonómiai elemzéséből merítve

Az entomopatogén nematódák, különösen az Heterorhabditis és a Steinernema fajhoz tartozók, fontos szerepet játszanak a mezőgazdaságban. Ezek a fajok rovarok parazitái. Dauer lárváik a rovarok testébe jutva, ott elszaporodnak és felfalják a gazdarovart. Genetikai rendszerük laboratóriumi modellje a Caenorhabditis elegans fonalféreg. A rovarpatogén nematódák a környezetbarát biológiai növényvédelem fontos eszközeivé válhatnak. A nematóda rokonsági kör ugyanakkor a speciáció, a faj kialakulása, az evolúció jobb megértéséhez is hozzájárulhat. A DNS-molekulákban kimutatott molekuláris változások lenyomatai a múlt történéseinek. Az ilyen típusú vizsgálatokhoz a genom előnyös „terepe” a riboszóma RNS-gén (rRNS-gén). Az előny két körülmény szerencsés összejátszásából adódik. Egyrészt az rRNS-gén 18S és 26S RNS darabját kódoló exonok rendkívül konzervatívak, szekvenciájuk megőrződött az evolúció során. Ennél fogva a PCR amplifikáláshoz szükséges oligonukleotid-primerek a legkülönbözőbb fajok DNS-én használhatók. Másrészt a 18S és 26S exonok egy intront fognak közre, amelyre nem nehezedik szelekciós nyomás. Többé-kevésbé káros következmények nélkül léphetnek fel és őrződhetnek meg mutációk ebben a szekvenciában. Az intron régió tehát teret ad a DNS-polimorfizmusok keletkezésének és fennmaradásának.

A PhastSystem rendszer óriási előnye más gélelektroforetikus technikákkal szemben ebben a kísérletsorozatban is jól látható. Az RFLP-analízishez szükséges nanogramm mennyiségű DNS lehetővé teszi, hogy egyedi nematódákból származó genomiális DNS PCR-rel amplifikált régióját használjuk fel különböző restrikciós enzimes emésztéshez, és az így kapott mintázatokat hasonlíthatjuk össze. A 36. ábra két entomopatogén nematódafaj RFLP-mintázatát mutatja be.

36. ábra - Két entomopatogén nematóda faj RFLP mintázata Egyetlen Heterorhabditis (1-4) és Steinernema (5-8) nematóda példány genomiális DNS (rRNS gén 18S és 26S exonok közötti intron régió) PCR amplifikált régiójának elektroforetikus képe különböző restrikciós enzimekkel (1,5 Alu I; 2,6 Dde I; 3,7 Hinf I és 4,8 Rsa I) történő emésztés után.

Két entomopatogén nematóda faj RFLP mintázata Egyetlen Heterorhabditis (1-4) és Steinernema (5-8) nematóda példány genomiális DNS (rRNS gén 18S és 26S exonok közötti intron régió) PCR amplifikált régiójának elektroforetikus képe különböző restrikciós enzimekkel (1,5 Alu I; 2,6 Dde I; 3,7 Hinf I és 4,8 Rsa I) történő emésztés után.


7.2.2. DNS-fragmentumok elválasztása RFLP-analízishez PhastSystemmel

A gél, a katolit és az anolit összetétele:

Gélösszetétel:

7,5%T5% C(Bis) elválasztó gél,

5%T3% C(Bis) „stacking” gél,

a puffer mindkét gélben 0,112M Tris/0,112M acetát, pH= 6,4.

Katolit és anolit:

0,2M Tris, 0,2M tricin,

0,55% SDS,

2,8% Isogel (FMC Cat. No.50202) agaróz.

Gélkészítés PhastSystem RFLP-analízishez

A gélt GelBond-PAG (FMC Cat. No. 54721) lapra öntjük, UltraMould (Pharmacia Cat. No. 18-1018-16) gélöntő készülékben a következő módon:

5 ml elválasztó gél készítése:

40% T 5% C (Bis)

törzsoldat

0,94 ml

10 × Tris/acetát puffer

0,50 ml

desztillált víz

3,56 ml

légtelenítés után:

10% ammónium‑perszulfát

25 μl

TEMED

3 μl

5 ml stacking gél készítése:

40% T 3% C (Bis)

törzsoldat

0,62 ml

10 × Tris/acetát puffer

0,50 ml

desztillált víz

3,88 ml

légtelenítés után:

10% ammónium‑perszulfát

25 μl

TEMED

3 μl

5 ml elválasztó gél oldatot pipettázunk a kazettába, szobahőmérsékleten polimerizáljuk levegő kizárásával legalább két órán keresztül, majd 5 ml stacking gél oldatot polimerizálunk hasonló körülmények között, végül ismét 5 ml elválasztó gélt öntünk a kazettába és az egész rendszert egy éjszakán át hagyjuk gélesedni.

Másnap az üveglapok eltávolítása után felvágjuk a gélt a stacking gél közepén hosszában, utána pedig mindegyik részt tovább vágjuk 5 részre. Így 10 db 50×43×0,5 mm méretű gélt kapunk.

Az elektroforézist 400 V állandó feszültség mellett végezzük 45 Vh-n (volt óra) keresztül. Ennek ideje kb. 20 perc 0,3 μl megfelelő restrikciós enzimmel emésztett minta esetében. A DNS-fragmenteket a gélben ezüstfestéssel tesszük láthatóvá (kb. 40 min).

Összehasonlításként standard DNS-létrát használunk (Molecular Weight Marker V, Boehringer, Cat.No.821705).