Ugrás a tartalomhoz

Genetikai variabilitás a növénynemesítésben

Hajósné Dr. Novák Márta

Mezőgazda Kiadó

Ajánlás

Genetikai variabilitás a növénynemesítésben

Molekuláris diagnosztika

Hajósné Dr. Novák, Márta

Ez a kiadvány az Oktatási Minisztérium támogatásával, a Felsőoktatási Pályázatok Irodája által lebonyolított felsőoktatási tankönyv-támogatási program keretében jelent meg.

Minden jog fenntartva. Bármilyen másolás, sokszorosítás, illetve adatfeldolgozó rendszerben való tárolás a kiadó előzetes írásbeli hozzájárulásához van kötve.


Tartalom

1. Ajánlás
2. Előszó
3. 1. Bevezetés
1.1. A genetikai variabilitás fogalma, genetikai alapjai, növelésének lehetőségei
1.2. A genetikai markerek fogalma és jellemzői
4. 2. A genetikai variabilitás vizsgálata tartalékfehérjékkel
2.1. A tartalékfehérjék általános jellemzése, osztályozása
2.2. A búza tartalékfehérjéi
2.2.1. A búzagliadinok és -gluteninek genetikája
2.3. A kukorica tartalékfehérjéje, a zein
2.3.1. A zeinek osztályozása és genetikai szerveződése
2.3.2. Polimorfizmus és heterogenitás a zeinmintázatban
5. 3. A genetikai variabilitás vizsgálata izoenzimekkel
3.1. Az izoenzimek fogalma, keletkezése, genetikája
3.2. Az izoenzim analízisek alkalmazásának lehetőségei
6. 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel
4.1. A restrikciós fragmentumhossz polimorfizmus, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) elve és lépései
4.1.1. Az RFLP-technika előnyei, hátrányai és alkalmazási területei
4.2. A PCR-technikán alapuló módszerek
4.2.1. A polimeráz láncreakció (PCR) elve
4.2.2. Véletlen primerek használatán alapuló módszerek: MAAP
4.2.3. A miniszatellit polimorfizmus módszere: VNTR
4.2.4. A mikroszatellit polimorfizmus módszerei
4.2.5. Az amplifikált fragmentumhossz polimorfizmus: AFLP
4.3. A különböző DNS-technikák összehasonlítása
4.4. Molekuláris markerezési eljárások a kertészeti növényeknél
4.5. Molekuláris markerek alkalmazása az erdészeti növények nemesítésében
4.5.1. Az izoenzim-analízis erdészeti alkalmazásai és eredményei
4.5.2. DNS-vizsgálatok erdei fafajokon
4.5.2.1. Az adaptív genetikai mintázatok azonosításának korlátai
4.5.3. A DNS-vizsgálatok alkalmazási lehetőségei a rendszertanban és a származásazonosításban
7. 5. A különböző markerekkel kapott mintázatok kiértékelése
5.1. A tartalékfehérje-mintázatok kiértékelése
5.2. Az izoenzim-mintázatok kiértékelése
5.3. Az RFLP-mintázatok kiértékelése
5.4. A RAPD-mintázatok kiértékelése
8. 6. A PCR-reakció optimalizálása
6.1. A reakcióelegy komponenseinek optimalizálása
6.2. A PCR-reakció körülményeinek optimalizálása
6.3. A biokémiai és genetikai analízisek automatizálása; RAPD- és DAF-reakcióelegyek és PCR-körülmények
9. 7. Elválasztástechnika
7.1. Az elektroforézis elve
7.1.1. Az izoenzimek elválasztása gélelektroforézissel
7.1.2. A tartalékfehérjék elválasztása gélelektroforézissel
7.2. A PhastSystem elektroforézis rendszer alkalmazása DNS-szintű polimorfizmus azonosítására
7.2.1. Egy illusztráció a PhastSystem alkalmazására entomopatogén (rovarpatogén) nematódafajok molekuláris taxonómiai elemzéséből merítve
7.2.2. DNS-fragmentumok elválasztása RFLP-analízishez PhastSystemmel
7.3. Nagynyomású vagy nagy teljesítményű folyadékkromatográfia
7.3.1. A nagynyomású folyadékkromatográfiás rendszer elemei
7.3.2. A HPLC-technika előnyei és hátrányai
7.3.3. Néhány alkalmazás
7.4. A kapilláris elektroforézis (CE) elve, alkalmazása
7.4.1. A kapilláris elektroforézis elválasztási módjai
7.4.2. A kapilláris elektroforetikus rendszer felépítése
10. 8. A molekuláris markerekkel kapcsolatos számítások
8.1. A populáció allélszerkezetének vizsgálata
8.1.1. Az alléles összetétel meghatározása
8.1.2. Populáción belüli változatosság mérése
8.1.3. A populációk közötti változatosság mérése
8.2. A PCR-technikán alapuló módszerekkel kapott eredmények matematikai kiértékelése
Irodalom

Az ábrák listája

1. Beltenyésztett kukorica vonalak és hibridjeik zein mintázata ♀az anya vonal mintázata, ♂ az apa vonal mintázata (drzewiecki, 1996)
2. Kukoricavonalak és -hibridek zein HPLC mintázata
3. A nemegyenlő crossing over eredménye (a génkópiák számának növekedése), a1; a2, a3, a4 homológ szekvenciák
4a. Alegységes szerkezetű enzimek molekuláris polimorfizmusa A) a lehetséges alegységkombinációk, B) az elektroforetikus kép
4b. Alegységes szerkezetű enzimek molekuláris polimorfizmusa
5. Az autotetraploid kukorica alkohol dehidrogenáz-1 (ADH1) enzimjének izoenzim mintázata (Hajós-Novák M. ‑ H. Nagy A. – Vida G., 1986)
6. Nicotiana fajhibridek levélészterázai (Szilágyi és H. Nagy, 1978)
7. Almasav dehidrogenáz (MDH) és aszpartát-aminotranszferáz (AAT) enzimek szerepe a mitokondriális és citoszól anyagcsereutakban
8. Napraforgó levél peroxidázok mintázata szülő (a, b) és az Fx hibridben (c) (H. Nagy és mtsai, nem közölt adatok)
9. Crossing over kimutatása tetraploid kukoricaszem scutellumának ADH1 izoenzim mintázata alapján. A nyíllal jelzett SSSS genotípus triplex genotípusa egyed öntermékenyítése után csak crossing over eredményeként jöhetett létre. (Hajós-Novák és mtsai, 1994/a)
10. Deléció (B), inszerció (D), valamint a restrikciós hasítóhelyen (C) bekövetkezett bázisváltozás kimutatása RFLP-vel (Pérez, 1993)
11. DNS átvitele (blottolása) agaróz gélről membránra
12. A polimeráz láncreakció sémája (Stansfield, 1997)
13. A GCGAAGCGCC „minihajtű primer háromdimenziós szerkezete (Hirao és mtsai, 1994. nyomán)
14. SSR hossz polimorfizmus keletkezése (Cregan és mtsai, 1994)
15. A nádképű csenkesz (Festuca arundinacea L.) 18 szomaklónjának (Scj.jg) SSR-PCR módszerrrel végzett genetikai elemzése A nyilak az alkalmazott (GACA)4 primerrel felismert és felszaporított, polimorfizmust mutató DNS-fragmentumokat jelzik. (Gyulai és mtsai, 1995)
16. MP-PCR szemi-speifikus primőrrel (Weising és mtsai, 1997)
17. Az Inter-SSR-PCR sematikus rajza (Zietkjewicz és mtsai, 1994)
18. Csicseriborsó-fajták AMP-PCR mintázata (Weising és mtsai, 1997)
19. RAMP szemi-specifikus ■ és random □ primerrel (Weising és mtsai, 1997)
20. RAMPO random primőrrel (Weising és mtsai, 1997)
21. Árpa izogén vonalak (AlgR = rezisztens, AlgS = fogékony) RAPD mintázata fluoreszcens festékkel jelölt primerek és Géné Scanner ABI362 automata készülékkel történő elválasztás alkalmazásakor A nyíllal jelölt helyeken eltérés látható a rezisztens és a fogékony vonalak között. (Walsh és mtsai, 1997)
22. Az AFLP-technika sematikus ábrázolása (Vos és mtsai, 1995)
23. E-CAG/M-AGG primer párral létrehozott AFLP-polimorfizmus A nyilak az AFLP-markerként felhasználható polimorf PCR-fragmentumokat jelzik, amelyek 80-300 bp hosszúak. Az 1-19 minták termesztett szója (G. max.) fajták, a 10-19 jelűek pedig vad szójafajok (G. sója). (Maughan és mtsai, 1996)
24. Közép- és nyugateurópai bükkpopulációk allozimatikus változatossága, 12 enzimlókusz elemzése alapján. A csoportok szétválasztása diszkriminancia-analízis segítségével történt. A populációk differenciáltsága a nagy földrajzi távolságok ellenére is csekély. (Comps és mtsai, 1998)
25. A relatív mobilitás meghatározása referenciasáv figyelembevételével
26. Lolium rigidum (a), Lolium multiflorum (b) és egy ismeretlen Lolium faj (c) tartalékfehérje mintázatai kapilláris elektroforézis (CE) után (Dinelli és Bonetti, 1992)
27. A sávok intenzitásának alakulása Adhl-FFFS triplex heterozigóta tetraploid kukorica pajzsocskájában (Hajós-Novák és H. Nagy, 1994)
28. Fenyőfűi erdeifenyő (Pinus sylvestris) populáció leucin-aminopeptidáz (LAP) mintázata. A LAP izoenzimnek két génje (A, B) két-két alléllel aktív a tűlevelekben (Földvári, 1989)
29. A GS-értékeken alapuló UPGMA cluster analízis eredményeinek dendrogramon történő ábrázolása
30. A Hindin-UMC46 enzim-klón kombináció digitalizált RFLP-mintázata Wl 17 (4N) S18 alvonalakban (Hajós-Novák M., Dallmann G., Orosz L., nem közölt adatok)
31. W117 S22 autotetraploidkukorica-alvonalak RAPD-mintázata az OPO12 (5' CAGTGCTGTG3') 10 mérés random primerrel (Hajós-Novák és Dallmann, 1997)
32. W117 4x S22 kukorica-alvonalak RAPD adatokból (27 random primer, 269 fragmentum) UPGMA cluster analízissel számított genetikai távolsága (Hajós-Novák és Dallmann, 1997)
33. A kapcsolódási hőmérséklet hatása a DNS amplifíkációs ujjlenyomatra pentamer (AGCTG) primer használatakor a Smith 92 E. coli törzsnél Az „A” ábrán a PGE ujjlenyomat, a „B” ábrarészen pedig az „IMAGE” programmal történt kiértékelés eredménye látható. A rövid primerek a vártnál kevesebb amplifíkációs terméket hoznak létre és alacsony molekulatömegűek egyáltalán nem keletkeznek. (Caetano-Anollés és mtsai, 1992; Caetano-Anollés, 1994)
34. A vertikális elektroforézis-készülék rajza
35. A dehidrogenázok kimutatásának elve
36. Két entomopatogén nematóda faj RFLP mintázata Egyetlen Heterorhabditis (1-4) és Steinernema (5-8) nematóda példány genomiális DNS (rRNS gén 18S és 26S exonok közötti intron régió) PCR amplifikált régiójának elektroforetikus képe különböző restrikciós enzimekkel (1,5 Alu I; 2,6 Dde I; 3,7 Hinf I és 4,8 Rsa I) történő emésztés után.
37. A nagynyomású kromatográfiás rendszer felépítése El és E2: eluensek, Pl és P2: szivattyúk, K: keverő, M: mintaadagoló, O: oszlop, D: detektor.
38. Két búzafajta gliadin frakciójának kromatográfiás képe „Eagle” (a) és „Condor” (b) búzafajták gliadin frakciójának elválasztása a gyenge anioncserélő MonoQ HR5/5 oszlopon. Eluens 10 mmol/1 CAPS, pH 10,4-10 mmol/1 CAPS + 0,4 mol/1 nátrium acetát. Gradiens 0%-100% B, 20 perc alatt. (Kick és mtsai, 1992)
39. Élesztőben szintetizált a-gliadin kimutatása nagynyomású folyadékkromatográfiával Az élesztőből izolált és Sephadex LH-20 oszlopon előzetesen tisztított fehérjefrakciót fordítottfázisú kromatográfiával, Vydac C-4 oszlopon kromatografálták. Gradienshez használt A-oldat: 0,1% TFA vízben, B-oldat: acetonitril-propanol 3:1, TFAO,1%. Elució 5 ml A-, majd 65%-ig lineárisan emelkedőén B-oldattal (5 perc-85 perc). (Blechl és mtsai, 1992)
40. A micelláris elektrokinetikus kromatográfía sematikus rajza (Boèek és mtsai, 1988)
41. A kapilláris elektroforetikus készülék sematikus rajza
42. A laktóz (1), a galaktóz (2) és a glükóz (3) elektroferogramja. Elektrolit: 5,3 mM szorbinsav oldat pH = 12,1 (0,1 N NaOH-val beállítva) (indirekt UV detektálás: λ = 256 nm), alkalmazott feszültség: 15 000 V, kapilláris: kvarc, hossza: 60 cm, hasznos hossza: l = 36 cm, belső átmérője: K) = 50 λm, mintamennyiség: 5 nl, hőmérséklet: 20 °C.

A táblázatok listája

1. Enzimek alegységes szerkezete
2. Izoenzím lókuszokkal kapcsoltan öröklődő tulajdonságok
3. Háromvonalas (TC) kukoricahibridek lehetséges alkohol dehidrogenáz-1 (Adhl) mintázatai a szülők genotípusától függően (LELKES és HAJÓS-NOVÁK nem közölt adatok)
4. A MAAP-technikák összehasonlítása
5. Kertészeti növényeknél alkalmazott molekuláris markerezési eljárások és eredmények
6. Néhány európai és északázsiai fafaj allozirnatikus genetikai változatosságának becsült értékei Az adatok általában időskorú állományokból vett mintákra vonatkoznak. Embriók és csemeték adatsorát "juv." megjelölés jelzi. (MÜLLER-STARCK, 1991 nyomán, kiegészítve)
7. Az erdeifenyő (Pinus silvestris), a lúdfű (Arabidopsis thaliana) és az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) sejtmagi DNS-tartalmának, valamint a szekvenált repetitív DNS-szakaszok számának összehasonlítása
8. DNS adatokra számított genetikai diverzitás (He), Shannon-Weaver diverzitás index (H), közös tenyészkerti kísérletben mért fenotípusos variancia (Vp), valamint a populációk közötti variancia százalékos aránya (Vbetw) egy dél-finnországi (Helsinki) és egy lappföldi (Ylläs) erdeifenyő (Pinus silvestris) populációra (SAVOLAINEN, 1997)
9. A Quercus petraea és Qu. robur fajkomplex allozimatikus és kloroplasztisz-DNS diverzitásának komponensei (KREMER és mtsai, 1991)
10. Ismert és ismeretlen Lolium fajok RSI (%) értékei (DINELLI és BONETTI, 1992)
11. A lehetséges LAP-izoenzim genotípusok száma és tényleges gyakorisága erdeifenyő (Pinus sylvestris) populációban két gén és lókuszonként két-két alléi esetében (FÖLDVÁRI, 1989)
12. W117 S18 tetraploid kukorica alvonalak RFLP-mintázatának (Hind HI-UMC46 enzim-klón kombináció) bináris kódolása
13. Wl 17 4x S22 kukorica-alvonalak OPO12 primerrel (5' CAGTGCTGTG 3') létrehozott RAPD-mintázata bináris mátrix formájában (HAJÓS-NOVÁK és DALLMAN, 1997)
14. A DAF-reakcióelegy négy legfontosabb komponensének optimális intervalluma és ajánlott mennyisége (CAETANO-ANOLLÉS, 1996)
15. PCR ciklusok száma a templát DNS-molekulák számától függően (CAETANO-ANOLLÉS, 1996)
16. Néhány jellegzetes HPLC-média