Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

7. fejezet - A vírusátvitel módszerei

7. fejezet - A vírusátvitel módszerei

A vírusok átvihetőségének (terjedésének) ismerete – a betegségeket kiváltó egyéb kórokozókhoz hasonlóan – alapvető jelentőségű. A vírusok élő szervezetbe jutása passzív folyamat. A vírusoknak ui. nincsenek olyan enzimei, amelyek lehetővé tehetnék a növényi sejtekbe történő aktív bejutását. Az átvitel többnyire külső segítséggel történik. A vírusátvitel lehetőségei alapvetően két nagy csoportba sorolhatóak: (1) állatvektor nélküli vírusátvitel és (2) állatvektorokkal történő vírusátvitel. Az egyes terjedési, vírusátviteli módok vírusoktól függően eltérőek lehetnek, de az egyes átviteli lehetőségek kombinálódhatnak is egymással (Horváth, 1972; Fritzsche et al., 1972; Schmelzer, 1980; Jones, 1993a,b; Dijkstra és De Jager, 1998; Horváth, 1999).

Állatvektor nélküli vírusátvitel

Oltással történő átvitel

Alapvetően minden növényvírus oltással átvihető; ennek feltétele, hogy a vírus szisztemikus megbetegedést legyen képes kiváltani, és hogy a vírusbeteg, valamint egészséges növények között szöveti kompatibilitás legyen. Az oltás, a szemzés, a dugvá-nyozás igen kiterjedt módszere a vírusátvitelnek. Az alany vagy az oltóvessző fertőzöttsége az egész növényre egyaránt átterjed. Az oltás különböző módjait a 21. ábra szemlélteti.

21. ábra - A virológiában alkalmazott fontosabb oltási módszerek. A: zöldoltás hasítékba; B: párosítás; C: héj alá oltás; D: érintkezéses oltás; E: palackoltás; F: hagymaoltás; G: szemzés; H: szemlapozás (chipszemzés); I: gumóba oltás; J: heteroplasztikus oltás (zöld hajtás fás részbe oltása); K: levéloltás kétszikűek esetében; L: levéloltás az egyszikű Liliaceae családba tartozó növényeknél [Schmelzer, 1980 után]

A virológiában alkalmazott fontosabb oltási módszerek. A: zöldoltás hasítékba; B: párosítás; C: héj alá oltás; D: érintkezéses oltás; E: palackoltás; F: hagymaoltás; G: szemzés; H: szemlapozás (chipszemzés); I: gumóba oltás; J: heteroplasztikus oltás (zöld hajtás fás részbe oltása); K: levéloltás kétszikűek esetében; L: levéloltás az egyszikű Liliaceae családba tartozó növényeknél [Schmelzer, 1980 után]


Az oltás módszere (Noordam, 1973)

  1. Egy vízszintesen félbevágott Nicotiana tabacum növény szárán tegyünk kb. 3 cm mély metszést. Ez képezi majd az oltás alapját, és ez akadályozza meg az oltóág és az alany elmozdulását egymástól.

  2. Vágjuk le egy N. glutinosa növény hajtását. Távolítsunk el róla 1–2 alsó levelet, ezzel megelőzhetjük az oltóvessző elhervadását. Túl sok levelet nem érdemes eltávolítani, mert ez megakadályozhatja a további növekedést. Nyessük meg a szár végét úgy, hogy kb. 2 cm hosszú ék keletkezzen rajta.

  3. Helyezzük a N. glutinosa szárának ék alakú végét a N. tabacum bevágott szárába. Tekerjük körbe rafiával vagy kötözőhánccsal, amelyet előzőleg vízzel hajlékonnyá tettünk. A kötözéshez használhatunk gumiszalagot vagy parafilmet is.

  4. Címkézzük fel a cserepeket és különítsük el a növényt a többitől.

  5. Ugyanilyen módszerrel helyezzünk el három N. tabacum alanyra egy N. glutinosa és két N. tabacum hajtást. Hagyjunk meg két N. glutinosa és két N. tabacum növényt teljesen sértetlenül. Valamennyi dohánynövényt helyezzük biztonságba, páradús helyre.

  6. Egy hét elteltével inokuláljuk az alanyon lévő leveleket 5 mg/l dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) és ugyanígy a kontrollnövények alsó leveleit.

  7. Szellőztessük a növényeket, óvjuk őket a befülledéstől. Először három nap múlva, majd rövid periódusonként, később rendszeresen, hosszabb időközönként szellőztessünk.

  8. Távolítsuk el az alsó levelek új hajtásait.

  9. Ellenőrizzük a vírusátvitel eredményességét.

A Nicotiana tabacum cv. Samsun növények levelein (akár alany volt akár nem) egy hét után érkivilágosodás vagy mozaik jelenik meg. A N. glutinosa növények inokulált alsó levelein két nap múlva lokális léziók tűnnek fel. A N. glutinosa oltóvesszők csúcsi levelein nekrózisok fejlődnek ki, míg a kifejlett levelek tünetmentesek maradnak. Ebből arra következtethetünk, hogy a vírustranszport a floemen keresztül valósul meg, valamint láthatóvá válnak a rezisztenciában megmutatkozó különbségek is.

Mechanikai átvitel

A mechanikai átvitel a vírusok legegyszerűbb terjedési módja, amely sebzéseken keresztül történik. Eredményessége függ a vírus környezeti hatásokkal szembeni ellenállóságától, a vírusgazdanövény adottságaitól (inhibitorok) és a fertőzendő tesztnövény fogékonyságától. Ez utóbbit befolyásolják a külső környezeti feltételek, a növény kora és fiziológiai állapota (Schmelzer et al., 1980; Gáborjányi, 1991; Horváth, 1993 a, b; Jones, 1993 a, b). A növény inhibitorai a fertőzés során általában csak ahhoz a családhoz tartozó növények esetében hatnak, amelyekhez maga az inhibitort tartalmazó növény is tartozik. Ezért ezek a gátló anyagok inkább gazda-, mint vírusspecifikusak. A mesterséges mechanikai átvitel (inokulálás) előnye, hogy kis koncentrációban előforduló vírusok is átvihetők a beteg növény szövetnedvével és általában könnyen felismerhető tüneteket okoznak a tesztnövényeken. A természetes mechanikai átvitelre klasszikus példa a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus), amely a szomszédos növények leveleinek érintkezésével is terjed. A talajművelés, ill. a növényápolás is gyakran elősegíti a vírusok terjesztését (traktorok, kaszálógépek).

Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc dohánynövények mechanikai inokulálása dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus)

A dohány mozaik vírus fogékony gazdanövényen (Nicotiana tabacum cv. Samsun) mozaikfoltokat, míg rezisztens növényen (Nicotiana tabacum cv. Érdi) lokális léziókat okoz (22. ábra).

  1. A mozaiktüneteket mutató N. tabacum cv. Samsun legfelső leveleiből egy gramm mennyiséget helyezzünk dörzsmozsárba, és adjunk hozzá 2,5 ml 0,1 M Sörensen foszfát-puffert (pH 7,0). Alaposan dörzsöljük el.

  2. Szórjuk be finoman karborundumporral (500 mesh = 50 µm) egy egészséges N. tabacum cv. Xanthi-nc fertőzni kívánt leveleit. Legegyszerűbb, ha a műveletet lakkfújóval végezzük. A karborundumpor helyett használhatunk Cellitet (kovaföld) is. Ezek az úgynevezett abrazívumok olyan szemcsés anyagok, amelyek segítik a levélfelület felsértését. A levélfelületen keletkezett mikrosérüléseken keresztül jutnak a virionok a levél epidermiszsejtjeibe.

  3. Egyik kezünket helyezzük a levél alá, a másikba fogjunk egy sterilezett spatulát. Az üvegspatula segítségével a levél csúcsától az alap felé közepes erősséggel, körkörös mozdulatokkal vigyük fel a vírusos szövetnedvet. A kezünk és a levél közé helyezhetünk kivágott szűrőpapír-darabkákat is. Érdemes az inokulált leveleket megjelölni (pl. steril műanyag szívószállal kis lyukat fúrunk a levél csúcsába).

  4. Az inokulálást követő 2–3 nap múlva lokális, nekrotikus léziók jelennek meg a megjelölt leveleken.

22. ábra - A: dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) tünetei Nicotiana tabacum cv. Samsun és B: N. tabacum cv. Érdi dohánynövények levelein [Horváth József szívessége folytán]

A: dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) tünetei Nicotiana tabacum cv. Samsun és B: N. tabacum cv. Érdi dohánynövények levelein [Horváth József szívessége folytán]


Megjegyzés: Mesterséges mechanikai átvitelt lehetőség szerint mindig a reggeli vagy a kora délelőtti órákban végezzünk. A mechanikai vírusátvitelhez különböző segédeszközökre van szükség (23. ábra).

23. ábra - A vírusok mechanikai átviteléhez használatos eszközök. A: orsóprés [J.A. de Bokx szívessége folytán]; B: 1 = gömblombik; 2 = dörzsmozsarak; 3 = üvegspatulák; 4 = desztillált víz; 5 = műanyag jelfa; 6 = pufferoldat; 7 = mérőhenger; 8 = karborundumszóró [Horváth József szívessége folytán]

A vírusok mechanikai átviteléhez használatos eszközök. A: orsóprés [J.A. de Bokx szívessége folytán]; B: 1 = gömblombik; 2 = dörzsmozsarak; 3 = üvegspatulák; 4 = desztillált víz; 5 = műanyag jelfa; 6 = pufferoldat; 7 = mérőhenger; 8 = karborundumszóró [Horváth József szívessége folytán]


Egyléziós kultúrák kialakítása

Ha tiszta, tehát azonos populációt képviselő tenyészetet szeretnénk kapni, egyetlen lézióból kell kiindulni. Az így kapott vírusizolátumot egyléziós kultúrának nevezzük.

  1. A levél felületét 2%-os NaOH-val fertőtleníteni kell.

  2. Szakítsuk le egy lokális tüneteket mutató Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc egyik levelét, és vágjunk ki belőle egy léziót.

  3. A léziót helyezzük porcelán dörzsmozsárba és adjunk hozzá pár csepp 0,1 M Sörensen foszfát-puffert (pH 7,0). Dörzsöljük szét.

  4. A kapott szövetnedvet óvatosan vigyük fel a 2–3 leveles N. tabacum cv. Xanthi-nc növény levelére.

  5. Ha a levélen pár nap múlva megjelennek a tünetek, már a teljes levelet eldörzsölhetjük, és a szövetnedvet átvihetjük egészséges dohánynövényekre.

Petricsésze-módszer

A módszer előnye, hogy nem kell egy teljes növényt használni a vizsgálathoz a kórokozó tesztelésekor, elegendő hozzá a tesztnövény egyetlen levele is. Ezt a vizsgálatot Petri-csészében, nedves szűrőpapíron végezzük (Horváth és Pocsai, 1971). A módszert lokális tüneteket okozó vírusoknál alkalmazzuk.

Vegetatív szaporítószervekkel történő vírusátvitel

Ismert, hogy továbbszaporításhoz felhasznált szervek (gumók, hagymák, rizómák stb.) – az anyanövényhez hasonlóan – vírussal fertőződhetnek. Ezért a vegetatív úton történő növényszaporítással vírusterjedés érhető el a leghatékonyabb vírusátvitel.

A burgonya levélsodródás vírussal (potato leafroll polerovirus) fertőzött anyanövény alól származó gumók többnyire vírusfertőzöttek lesznek, de előfordul az is, hogy nem mindegyik gumó fertőződik, ezért ezekből egészséges növények is kifejlődhetnek. A gumókkal átvihető burgonyavírusok súlyos gazdasági problémát jelenthetnek a termesztésben. A vegetatív szaporítószervekkel történő átvitelben szerepet játszhat a gumón kívül a módosult föld alatti megvastagodott szár, a rizóma, a szamóca indája vagy a tulipán hagymája. A tulipán színtörés vírus (tulip breaking potyvirus) átvitelében és terjedésében a legnagyobb szerepe a vírusfertőzött tulipánhagymának van.

Rügydugványteszt (Horváth, 1962)

A burgonya nyugalmi állapotát megszakító vegyi készítmények alkalmazásával lehetővé vált a rügydugványok vizsgálata már az ültetések megkezdése előtt. Ennél a módszernél a gumók dugófúróval kivájt csíráit virágcserepekbe ültetjük. Ha a burgonya pl. levélsodródás vírust (potato leafroll polerovirus) tartalmazott, akkor megfigyelhető a fiatal növények leveleinek főér menti sodródása, kanalasodása. Biztosabb eredményt érhetünk el, ha a rügyeket a gumó csúcsi részéből vesszük és azokat gibberellinnel (10–50 mg/l) kezeljük.

Maggal és pollennel történő átvitel

A maggal és pollennel történő átvitel a vírusok természetes elterjedésének gyakori lehetőségei. A maggal történő vírusátvitel gazdaságilag nagyon jelentős problémákat okoz (Mink, 1993; Schmidt, 1994). Jelenlegi ismereteink szerint több mint száz, maggal átvihető vírus ismert; ezek a vírusok 25 taxonómiai csoportba (nemzetségbe) tartoznak. Öt vírusnemzetségben [alfamovirus (1) cucumovirus (4), waikavirus (1), enamovirus (1), tospovirus (1)] 8 olyan vírus található, amelyek maggal 100%-ban átvihetők. Az összes cryptovirus [pl. szegfű vírus 1 (carnation 1 alphacryptovirus), vöröshere vírus 2 (red clover 2 betacryptovirus)] maggal könnyen átvihető, és eltekintve a növények vegetatív szaporításától, ez az egyetlen vírusterjedési lehetőség a fenti vírusok esetében. A maggal terjedő vírusok mechanikailag is átvihetőek, és parenchimasejteket fertőznek. A floem-fertőző vírusok [pl. burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus)] maggal nem terjednek. A magátvitel szempontjából fontos a vírusszaporodás, -terjedés és a gazdanövény növekedésének mértéke közötti egyensúly (Johansen et al., 1994). Befolyásoló tényező többek között a növények fiziológiai állapota, a vírusstabilitás, a hőmérséklet, a fajta és a tárolási idő is. Ha a kórokozó a mag felületén tapad meg, külső magátvitelről beszélünk. Ilyenkor a csíranövény a talajban, a talajrögök által ejtett apró sérülések következtében fertőződik. Az átvitelnek ez a formája főleg stabil vírusoknál lehetséges [dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) (24A ábra)].

24. ábra - A: a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) tünetei a fertőzött paradicsommaggal történő átvitel után Lycopersicon esculentum növények levelein; B: bab sárga mozaik vírus (bean yellow mosaic potyvirus) tünetei Phaseolus vulgaris cv. Red Kidney növényen [Horváth József szívessége folytán]

A: a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) tünetei a fertőzött paradicsommaggal történő átvitel után Lycopersicon esculentum növények levelein; B: bab sárga mozaik vírus (bean yellow mosaic potyvirus) tünetei Phaseolus vulgaris cv. Red Kidney növényen [Horváth József szívessége folytán]


A belső magátvitel bonyolultabb folyamat. Feltétele – többek között – az, hogy a vírus bejuthasson a csírakezdeménybe vagy azok sejtjeibe. A bab sárga mozaik vírus (bean yellow mosaic potyvirus) is ezzel a módszerrel terjed (24B ábra). Ez egyes esetekben sterilitást is eredményezhet [paradicsom magtalanság vírus (tomato aspermy cucumovirus)].

A maggal átvihető vírusok a vírusbeteg növények pollenjével is terjednek. A kontaminálódott virágpor nemcsak az embriózsákot, hanem a magkezdeményeket is fertőzi. Ilyen kórokozó a bab közönséges mozaik vírus (bean common mosaic potyvirus). A vírusok pollennel történő terjedésének jelentős epidemiológiai szerepe van (Schmelzer, 1980).

Vírusátvitel a talajban

A talajban történő vírusátvitel általában gyökérrel, alacsonyabb rendű gombákkal és nematódákkal (fonálférgekkel) történhet; ez utóbbi átvitelről a Nematódák (fonélférgek) c. alfejezetben számolunk be. Ismeretesek azonban olyan vírusok is, amelyek talajban vektor nélkül terjednek. A jelenleg ismert 13, talajjal terjedő vírus [pl. szegfű foltosság vírus (carnation mottle carmovirus), Chenopodium mozaik vírus (sowbane mosaic sobemovirus), szegfű gyűrűsfoltosság vírus (carnation ringspot dianthovirus), burgonya X-vírus (potato X potexvirus), dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus), paradicsom bokros törpülés vírus (tomato bushy stunt tombusvirus)] hat vírusnemzetségbe tartozik. Az említett vírusok mindegyike nagy koncentrációban fordul elő a növényekben, igen stabil, széles gazdanövénykörrel rendelkezik, és mechanikailag könnyen átvihető. A növények talajból, abiotikus körülmények között történő fertőződésének mechanizmusa nem ismert.

Gyökérrel történő átvitel

A vírusfertőzött növény gyökere jelentős szerepet játszik néhány vírus átvitelében. Feltétele az, hogy a fertőzött növényben a víruskoncentráció elég nagy legyen, gyökerei pedig szorosan érintkezzenek az egészséges növény gyökereivel. Ez az átviteli lehetőség különösen nagy gondot okoz a faiskolákban [pl. alma mozaik vírus (apple mosaic ilarvirus)], valamint a szőlőkultúrákban és a többéves hüvelyes takarmánynövények köré-ben is.

Alacsonyabb rendű gombákkal történő átvitel

A gyökérfertőző Olpidium gomba az egyik legismertebb vírusvektor, amely több vírus [dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus), uborka nekrózis vírus (cucumber necrosis tombusvirus), saláta érvastagodás vírus (lettuce big vein varicosavirus), dohány satnyulás vírus (tobacco stunt varicosavirus)] átvitelére képes (25. ábra). Egy másik gomba, a Polymyxa betae a répa nekrotikus sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein benyvirus) terjesztésében vesz részt. Az árpa sárga mozaik vírust (barley yellow mosaic bymovirus) a gabonaféléken élő Polymyxa graminis terjeszti. A Spongospora spp. a burgonya szártörpülés vírust (potato mop-top pomovirus), míg a Pythium spp. a borsó ál-levélsodródás vírust (pea false leaf roll virus) képes átvinni (Horváth, 1972).

25. ábra - Az Olpidium brassicae gombavektor zoosporangiumai. A: saláta törzs (lettuce strain) vektora; B: káposzta törzs (cabbage strain) nem vektor; C: az Olpidium spp. zoospórái [Teakle, 1967 után]

Az Olpidium brassicae gombavektor zoosporangiumai. A: saláta törzs (lettuce strain) vektora; B: káposzta törzs (cabbage strain) nem vektor; C: az Olpidium spp. zoospórái [Teakle, 1967 után]


A vírusok gombaátvitelének kritériumai a következők: a) légszáraz talajban a fertőzőképesség megmaradása; b) a jelenlevő vírus mechanikai átvitellel vagy oltással történő kimutatása; c) kapcsolat a gomba és a vírus között; d) a gombamentes vírusfertőzött gazdanövényekről a vírussteril gomba által történő vírusfelvétel és vírusátvitel.

Vírusátvitel Cuscuta fajokkal

A Cuscuta nemzetségbe tartozó fajok levél nélküli, megnyúlt, fonalszerű szárral rendelkező gyomnövények, amelyek klorofillban szegények, ezért más növények parazitálására kényszerülnek. Az arankafajok a száron kifejlődő szívógyökerek (hausztórium) segítségével veszik fel a gazdanövényből a táplálékot és ezzel gyakran a vírusokat is. A vírus átvitele rendszerint passzívan történik, a parazita növény táplálékáramlása közben. A tápanyagok a hausztóriumokon keresztül mind a fertőzött, mind az egészséges növény edénynyaláb-rendszeréből az aranka floemjébe jutnak, és itt keverednek egymással. Számos Cuscuta faj alkalmas az átvitelre, de a hatékonyság fajonként különböző. Legnagyobb jelentőségűek a C. subinclusa és a C. campestris fajok (Schmelzer, 1956; Hosford, 1967; Jones, 1993a). Mindkét faj közismert vírus-gazdanövény is. Olyan növényekre is átvihető a vírus arankával, amelyek a szövet-inkompatibilitás miatt nem mutatják az átvitelt oltással vagy szemzéssel. Az aranka-átvitel különösen jelentős akkor, amikor mechanikai vagy vektorátvitellel nem érhető el eredmény [pl. orgona boszorkányseprűsödés fitoplazma (lilac witches broom phytoplasma)].

Vízzel történő vírusátvitel

Csaknem négy évtizedre nyúlnak vissza azok a vizsgálatok, amelyek alapján megállapítást nyert, hogy öntöző- és vízleeresztő csatornák (vízfolyások) vizéből növényvírus [uborka zöldfoltosság mozaik vírus (cucumber green mottle mosaic tobamovirus) (26A ábra)] izolálható (Van Dorst, 1961). Megállapítást nyert az is, hogy az öntözővízben jelen lévő vírus és az uborka vírusfertőzöttsége között szoros összefüggés van (26B ábra). Az elmúlt évtizedekben számos stabil növénypatogén vírust izoláltak folyók és tavak vizeiből (Koenig és Lesemann, 1985; Koenig, 1986; Horváth et al., 1986; Juretiæ et al., 1986; Koenig et al., 1988), valamint vízinövényekből (Horváth, 1994). Ezek a kutatási eredmények felvetették azt a lehetőséget – amely később bizonyítottá vált –, hogy növények vektormentes úton (állatvektorok és/vagy talajban élő gombák nélkül), gyökéren keresztül, vírussal kontaminálódott vízzel (pl. öntözővízzel) is fertőződhetnek. Ezáltal a víz mint „vektor” szerepet játszik stabil vírusok átvitelében és a növények megbetegítésében (Meyer-Kahsnitz, 1993). Ismert az is, hogy a bentonit és az agyagásványok proteineket (vírusrészecskéket) képesek adszorbeálni, és ezáltal a növényekből a kórokozó vírusok a talajkomponensekhez adszorbeálódva víz közvetítésével további fertőzést indukálhatnak (Gibbs és Harrison, 1976; Blanco-Sanches et al., 1986; Juretiæ és Horváth, 1991).

26. ábra - A: az uborka zöldfoltosság mozaik vírus (cucumber green mottle mosaic tobamovirus) tünetei Cucumis sativus cv. Delicatess uborkanövényen; B: az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) tünetei Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc dohányon [Horváth József szívessége folytán]

A: az uborka zöldfoltosság mozaik vírus (cucumber green mottle mosaic tobamovirus) tünetei Cucumis sativus cv. Delicatess uborkanövényen; B: az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) tünetei Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc dohányon [Horváth József szívessége folytán]