Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

A vírusátvitel módszertana

A vírusátvitel módszertana

Vírusátvitel levéltetvekkel

A vírus levéltetvekkel történő átvitele nem-perzisztens, szemiperzisztens vagy perzisztens (cirkulatív) módon lehetséges. Egy nem-perzisztens vírust tartalmazó beteg növényen a levéltetveknek optimálisan 10–60 másodpercet kell táplálkozniuk ahhoz, hogy az adott vírust felvegyék. Az ún. felvételi táplálkozás hatékonysága jelentősen csökken, ha pár perc helyett néhány napig tart. A vírus „inokulációs“ táplálkozással közvetlenül a felvételi szívás után átvihető. Az átvitel hatékonysága fokozatosan csökken néhány perc után, és kb. 1 óra múlva teljesen megszűnik. A levéltetveket az egészséges növényről (tápnövényről) levéve éheztetni kell néhány óráig, ezzel az átvitel eredményessége növelhető. Szemiperzisztens vírusoknál a felvételi táplálkozás optimuma 12–24 óra. Ezt követően 1–3 nap múlva történik meg az átvitel. Perzisztens vírusok esetén legalább félórás felvételi szívásra van szükség, de hosszabb ideig is történhet. A táplálkozás után 1–20 napos látens periódus (inkubációs idő) van; ezt követően a vírus átvihetővé válik. Ez a típusú átvitel akkor történik meg, ha a felvételi táplálkozás legalább néhány órán keresztül tart.

A vírusmentes levéltetvek tenyésztése

A vírusok ritkán vihetők át a levéltetvek tojásával. Az újonnan kikelő levéltetvek általában vírusmentesek, ezért egy ilyen kultúrából elindítható a tenyészet (Sylvester, 1969).

  1. Tegyük egy egészséges kínaikel-palánta (Brassica pekinensis) levelét Petri-csészébe, egy kissé megnedvesített szűrőpapírra. A kifejlett, szárnyatlan (még szárnykezdeménnyel sem rendelkező) egyedeket finom ecset segítségével rakjuk át 1 vagy 2 levélre. Megkönnyíti a munkánkat, ha az ecsetet előtte vízbe mártjuk. Fedjük le a Petri-csészét, és néhány óra múlva tegyük át a levéltetveket egy egészséges kínai kel növényre.

  2. A növényt helyezzük inszektáriumba (34A, B, C ábra), amelynek 3 oldalát háló határolja (20 mesh/cm), egyet pedig üveglap zár le. Az inszektáriumnak nincs alja, de a váz alá homokkal vagy kaviccsal teli tálcát helyezünk. Ez az inszektárium megakadályozza az állatok szökését. A szárnyas alakok kifejlődését a 16 órás megvilágítás megakadályozza. A Myzus persicae folyamatos megvilágítást igényel, az Aphis fabae esetében szükség van sötét periódusokra is. A vírusok átvitelének tanulmányozásához sok esetben ún. „miniatűr” inszektáriumokat is használnak (34D, E, F ábra).

  3. A levéltetvek rendkívül érzékenyek az inszekticidekre. A környezet permetezése a rovarok pusztulását vagy fejlődésbeli visszamaradását eredményezheti. Ha mégis permeteznünk kell, használjunk olyan szert, amely toxicitását csak pár napig őrzi meg, pl. tetraetil-pirofoszfátot.

34. ábra - A–C: szövethálóval és üvegajtóval ellátott inszektáriumok; D–F: miniatűr levéltetű-inszektáriumok, amelyeket csíptetővel lehet a növények levelére, egy meghatározott helyre elhelyezni [Horváth József szívessége folytán]

A–C: szövethálóval és üvegajtóval ellátott inszektáriumok; D–F: miniatűr levéltetű-inszektáriumok, amelyeket csíptetővel lehet a növények levelére, egy meghatározott helyre elhelyezni [Horváth József szívessége folytán]


A tesztnövények felnevelése

A Myzus persicae táplálására a legalkalmasabb a retek (Raphanus sativus) és a kínai kel (Brassica pekinensis). Ezek a növények magas páratartalmú helyiségben gyorsan csíráznak, a magvetéstől számított öt héten belül felhasználhatók, és immunisak pl. a burgonya levélsodródás vírussal (potato leafroll polerovirus) szemben. A gőzöléssel sterilezett és átszitált talajba ültetett magvak magas páratartalom és 27 °C hőmérséklet mellett hamar kicsíráznak. Később elég a 20–22 °C is. Amikor az első, valódi levél eléri a sziklevelek hosszának felét, a növények alkalmasak a fertőzésre. Célszerű hetente háromszor is magot vetni, hogy a felhasznált tesztnövények egyforma fejlettségűek legyenek. A Physalis floridana tesztnövények kiváló vírusforrásai a Myzus persicae levéltetveknek.

A nem-perzisztens és a perzisztens vírusokkal végzett tesztvizsgálat

Ebben a vizsgálatban a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) és a burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus) átvitelét végezzük el, a levéltetvek egy csoportjával rövid, egy másik csoportjával pedig hosszú ideig tartó felvételi szívás esetében (Miyamoto és Miyamoto, 1966). A rövid táplálkozási idő a nem-perzisztens, a hosszú táplálkozási idő a perzisztens módon terjedő vírusok kimutatását szolgálja. A kísérlet akkor a legeredményesebb, ha a nem-perzisztens vírus (burgonya Y-vírus) transzmissziós képességét csak rövid ideig (kb. 1 óra) őrzi meg, a perzisztens vírus (burgonya levélsodródás vírus) pedig még egy nap elteltével is átvihető marad. Hogy ezt nyomon kövessük, a levéltetveket egy második tesztnövényre helyezzük át az első inokulációs táplálkozás után.

Háromnapos felvételi táplálkozás munkaterve
  1. Tegyünk kb. 100 db szárnyatlan levéltetvet nedves ecset segítségével egy főzőpohárba. A vizsgálat alatti áthelyezések során bánjunk óvatosan a levéltetvekkel. Ha a levéltetvek szipókája éppen a levélbe süllyedt, ecsettel finoman piszkáljuk meg a potrohukat, és csak azután helyezzük át. Az átvitel sikere ettől függ. A leválasztást úgy is megkönnyíthetjük, hogy a szívogató levéltetvekre hirtelen erős fényforrást bocsátunk, és ilyenkor szipókájukat kihúzzák a növényből (Horváth, 1963).

  2. A levéltetvek felét tegyük burgonya Y-vírussal, másik felét burgonya levélsodródás vírussal fertőzött Physalis floridana növényekre.

  3. A növényeket levéltetvekkel együtt 3 napra helyezzük inszektáriumba.

  4. Három nap múlva vizsgáljuk meg a beteg növényeket, és inszekticiddel pusztítsuk el a szárnyas egyedeket. Tegyünk 5 db szárnyatlan levéltetvet a burgonya levélsodródás vírussal fertőzött növényről 1 db egészséges, majd további 5–5 db levéltetvet 4 db egészséges P. floridana tesztnövényre. Legalább 10 másik levéltetvet helyezzünk egy „tartalék” növényre. Ugyanezt ismételjük meg a burgonya Y-vírussal fertőzött levéltetvekkel is.

  5. Tegyük egy napra inszektáriumba valamennyi tesztnövényt.

  6. A felvételi szívást követő 5. napon mindegyik levéltetvet rakjuk át új tesztnövényre. Az elpusztult vagy szárnyassá alakult tetveket mindig a „tartalék” növényről pótoljuk.

  7. Tartsuk a növényeket egy napig inszektáriumban.

  8. A 6. napon ecsettel tegyük át a levéltetveket a tesztnövények utolsó sorozatára, vagy kezeljük a növényeket inszekticiddel.

Háromperces felvételi táplálkozás munkaterve

  1. Tegyünk kb. 100 db levéltetvet főzőpohárba, zárjuk le egy műanyag fedővel, és éheztessük őket naptól védett helyen 1 óráig.

  2. Öt levéltetvet helyezzünk egy burgonya levélsodródás vírussal fertőzött levélre. Nagyítóval megfigyelhetjük, hogy az állatok táplálkoznak-e. A próbaszívás rendszerint kevesebb mint 30 másodpercig tart. Szívás közben a szipóka merőleges a levélfelületre, a csáp pedig hátracsapva a testhez simul.

  3. Három perc múlva öt levéltetvet tegyünk át egy tesztnövényre, a szondázás időtartamának figyelembevétele nélkül.

  4. Ismételjük meg a b és c pontot, és vigyük át a rovarokat még négy teszt- és egy tartalék növényre. Ha a levelek lankadnának, frissítsük fel őket. A folytatás hasonló a burgonya Y-vírusnál leírtakhoz.

Az első tünetek 1–2 hét után láthatóvá válnak. A burgonya levélsodródás vírussal fertőzött növények erőteljesen satnyulnak, a levelek sodródnak, sárgulnak (különösen a levél csúcsa), az erek zöldek maradnak. A burgonya Y-vírussal megbetegített növények törpülnek az egészséges növényhez képest és mozaikos tüneteket mutatnak. Jegyezzük fel a szimptómákat. Lehet, hogy a háromnapos és a háromperces felvételi táplálkozást követően az 5. napon burgonya Y-vírussal fertőzött növények, valamint a háromperces táplálkozást követően az 1. és 2. napon burgonya levélsodródás vírussal fertőzött tesztnövények mind egészségesek maradnak. A nem-perzisztens vírusok (burgonya Y-vírus) esetében az átvitel hatékonyabb, ha a felvételi szívás három nap helyett pár percig tart. A kérdést, hogy melyik vírus perzisztens és melyik nem, csak akkor dönthetjük el véglegesen, ha a különböző kísérleti feljegyzéseket összevetjük egymással.

Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) átvitele gyakran eredménytelen. Ezért fontos, hogy figyelembe vegyük a tesztnövények korát és a vírus koncentrációját a forrásnövényben (Stimman és Swenson, 1967). Ha Cucumis sativus tesztnövényt használunk, akkor a felvételi táplálkozást követően a levéltetveket a növény sziklevelére kell helyezni, kb. 2–3 nappal a kikelés után. Azokat a levéltetveket használjuk, amelyek 10–15 másodpercig tartó próbaszívást végeztek a forrásnövényen.

Epidemiológiai vizsgálatok nem-perzisztens vírusokat terjesztő levéltetvekkel

Ha választ szeretnénk kapni arra a kérdésre, hogy egy nagyobb területen előforduló levéltetű-populáció közül mely fajok hozhatók leginkább öszzefüggésbe egy nem-perzisztens vírus [szilva himlő vírus (plum pox potyvirus)] természetes elterjedésével, akkor nyomon kell követnünk a szárnyas levéltetvek rajzását és a vektorok tevékenységének intenzitását (Basky és Gáborjányi, 1994).

Az intenzív vektoraktivitás idejének tesztelése fogónövényekkel

a) A vizsgálat elvégzéséhez válasszunk ki egy szilva himlő vírussal fertőzött szilvaültetvényt.

b) Áprilistól augusztus végéig 25–25 db GF 305 őszibarackmagoncot mint fogó-, illetve tesztnövényeket helyezzünk ki és cseréljünk egyhetes időközönként egy igen fogékony Besztercei szilvaállományban.

c) Az egyhetes expozíciós idő elteltével a növényeket tartsuk vektormentes üvegházban.

d) Két hónap után a vírusfertőzöttséget vizuálisan és DAS-ELISA módszerrel állapítsuk meg.

A szárnyas levéltetvek rajzásának regisztrálása

a) A szárnyas levéltetvek rajzását Rothamsted típusú szívócsapdával követhetjük nyomon. Ez a szívócsapda óránként körülbelül 3000 m3 levegőt szív be, 12,2 m ma-gasságból. Ez az a magasság, amelyen a távolsági repülés során a levéltetvek repülnek.

b) A szívócsapda által gyűjtött anyagot naponta ürítjük, jól zárható üvegekben, 75%-os alkoholban tároljuk, és sztereomikroszkóp segítségével meghatározzuk a levéltetveket. A határozáshoz mindig kérjük szakember segítségét. A Magyarországon leggyakrabban előforduló levéltetvek leírását és a preparátumaikról készült fényképeket a Basky (1993) által írt határozóban találjuk meg.

Különböző levéltetűfajok vírusátviteli képességének vizsgálata
  1. Gyűjtsünk legalább száz, ha lehet, kb. 300 db azonos fajú levéltetvet bármely fáról vagy lágy szárú növényről (lehet zöldség- vagy gyomnövény is). Tegyük a levéltetveket lefedhető Petri-csészébe vagy hintőporba mártott szájú főzőpohárba.

  2. Kétórás éheztetés után a levéltetvekkel teli edénybe helyezzük be a forrásnövényt. Ez legtöbbször fertőzött szilvahajtás. A vizsgálatok kimutatták, hogy mirobalánról vagy dohánynövényekről az átvitel hatékonysága kisebb volt.

  3. Ötperces felvételi táplálkozás után nedves ecset segítségével helyezzük át a szárnyatlan (még szárnykezdeménnyel sem rendelkező) egyedeket 10 db GF 305 őszibarackmagoncra. A fejletlen lárvákat csakúgy, mint a szárnyas alakokat, hagyjuk az edényben. Nagyítóval figyeljük a szipóka és a csápok állását. A magoncokon három hajtást hagyjunk, és mindegyikre 10–10 levéltetű kerüljön. A próbaszívás alatt a szipókára került vírus lehetővé teszi, hogy olyan rovarfajokat is tesztelhessünk, amelyeknek egyébként nem gazdanövénye a szilva vagy az őszibarack.

  4. Két nap elteltével a megmaradt példányokat Pirimor 50 D-vel lepermetezzük, és az akceptornövényeket vírusmentes üvegházba szállítjuk. A vírusnak körülbelül 2–3 hónapra van szüksége ahhoz, hogy a növényben kimutatható mértékben felszaporodjon.

  5. Az inkubációs idő elteltével a növényeket DAS-ELISA-módszerrel vizsgáljuk. A vírusfertőzött és a vírussal nem fertőződött akceptornövények aránya adja meg az adott faj százalékban kifejezett vektorhatékonyságát.

Membránhártyán keresztül történő mesterséges táplálás

Kunkel (1977) egy olyan módszert tökéletesített, amely különböző levéltetvek mesterséges táplálását szolgálja. Ennél az eljárásnál egy membránhártyán keresztül kínáljuk fel a tápanyagokat a rovaroknak. Az aszeptikus tasakokat két parafilm szembefordításával és felgöngyölítésével kapjuk. A parafilmből létrehozott membrán előnye, hogy könnyen megformázható, továbbá szivárgásmentes, mert a kifeszített darabok szorosan egymáshoz tapadnak. Tárolásuk mélyhűtőben egyszerűen megoldható.

Ha aszeptikus hártyákat akarunk készíteni, a parafilmdarabkákat UV-fénnyel kell besugározni. Ezért szükségünk van egy kellően felszerelt szobára. A táplálék oldatának megszűrésére mikrobiológiai szűrőt használunk. Kunkel (1977) a Millipore R-rendszert alkalmazta, amely egy fecskendőre szerelt szűrőrendszerből áll.

Az aszeptikus hártyák elkészítése
  1. Előzőleg vágjunk le kémcsőből vagy 2,6 cm átmérőjű műanyag csőből olyan darabokat, hogy gyűrű, illetve henger alakú csöveket kapjunk. Az üveg, ill. műanyag széleit csiszoljuk le, hogy megelőzzük a film megsérülését.

  2. Parafilmből vágjunk ki négyzeteket. Ezeket szétterítjük egy edény vagy egy kesztyűsdoboz aljába, és 1–2 órán keresztül besugározzuk. Az expozíciós idő befolyásolja a parafilm fizikai tulajdonságait. Ha túl hosszú ideig tesszük ki az UV-sugaraknak, a parafilm később a kinyújtás közben könnyen elszakad.

  3. Készítsük elő a fertőtlenített fecskendőt (kb. 20 ml) és néhány hengert. Vegyük ki a mélyhűtőből a táplálékul szolgáló oldatot.

  4. A két óra leteltével helyezzük a parafilmnégyzeteket a munkaasztalra, és miután feltöltöttük a fecskendőt, tegyük rá a szűrőrendszert.

  5. Vonjuk be a hengereket a parafilmmel a 35. ábra szerint. A két négyzetlap szembefordított oldalai sterilek. A filmek keresztirányú meghúzásával egyenletes vastagságú, vékony hártyákat kapunk. Vigyázzunk, hogy a kihúzás közben a membrán középső részét ne érintsük.

35. ábra - A membránhártyák elkészítésének folyamata. 1. a gyűrű oldalról, ill. felülről; 2. a gyűrűre ráfeszítjük az első parafilmet (P1); 3–4. a kifeszített hártyára rácseppentjük a táplálékot; 5. kifeszítjük a második parafilmet (P2); 6. a P2 parafilmet ráhelyezzük az első parafilm tetejére; 7–8. a két filmet összeszorítjuk és széleiket feltekerjük; 9. az elkészült membránhártya [Kunkel, 1977 után]

A membránhártyák elkészítésének folyamata. 1. a gyűrű oldalról, ill. felülről; 2. a gyűrűre ráfeszítjük az első parafilmet (P1); 3–4. a kifeszített hártyára rácseppentjük a táplálékot; 5. kifeszítjük a második parafilmet (P2); 6. a P2 parafilmet ráhelyezzük az első parafilm tetejére; 7–8. a két filmet összeszorítjuk és széleiket feltekerjük; 9. az elkészült membránhártya [Kunkel, 1977 után]


Mini-inszektáriumok készítése az átvitelekhez
  1. A csövekből levágott gyűrűkből készíthetők el azok a kis üveg- vagy műanyag inszektáriumok, melyek a levéltetvek táplálkozásának helyei. Fontos, hogy a hengerek és a gyűrűk átmérője azonos legyen, mert az elkészült membránhártyákra így tudnak tökéletesen illeszkedni.

  2. Ezek a mini-inszektáriumok többféle úton állíthatók elő (36. ábra). Az egyszerű gyűrűk és a választásos kamrák alja nejlon fátyolszövet. Ezt hozzáragasztjuk egy mikroszkóp-tárgylemezhez erősített parafadugó tetejéhez. A választásos kamra keresztirányú darabja üveglapból van kivágva és parafilmmel beragasztva. Ez olyan szorosan zárja el a két oldalt egymástól, mint egy pecsét.

  3. Az elkészült inszektáriumba helyezzük be a levéltetveket.

36. ábra - A gyűrűk összeállításának módozatai (a 35. ábra folytatása). 9. az elkészült membránhártya; 10. a gyűrű oldalról, ill. felülről; 11. gyűrű a hártyával. Az egyszerű gyűrűk (12–13.) és a választásos kamrák (15–16.) alja nejlon fátyolszövet, amelyet mikroszkóp tárgylemezéhez erősített parafadugóhoz ragasztunk. A választásos kamra keresztirányú darabja (14.) üveglapból van kivágva és parafilmmel beragasztva [Kunkel, 1977 után]

A gyűrűk összeállításának módozatai (a 35. ábra folytatása). 9. az elkészült membránhártya; 10. a gyűrű oldalról, ill. felülről; 11. gyűrű a hártyával. Az egyszerű gyűrűk (12–13.) és a választásos kamrák (15–16.) alja nejlon fátyolszövet, amelyet mikroszkóp tárgylemezéhez erősített parafadugóhoz ragasztunk. A választásos kamra keresztirányú darabja (14.) üveglapból van kivágva és parafilmmel beragasztva [Kunkel, 1977 után]


Helper komponens (HC) jelenlétének kimutatása

A potyvirusok közül a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) nem-perzisztens módon terjed. Nem tudjuk azonban, hogy a levéltetvek szipókájának pontosan mely részéhez tapad a kórokozó és miért csak bizonyos levéltetűfajok képesek az átvitelre. Govier és Kassanis (1974) előzetes megfigyelései hasonló membránhártyákon történtek, mint amilyeneket az előzőekben leírtunk. Ezeknek a mesterségesen előállított hártyáknak az az előnyük, hogy a bennük lévő folyadék tetszés szerint változtatható. Govier és Kassanis (1974) burgonya Y-vírussal fertőzött növények különböző módon előkészített kivonatait töltötték a tasakokba. A levéltetvek (Myzus persicae) rövid ideig táplálkozhattak a membránokon, majd a tesztnövényekre kerültek. Amikor a levéltetvek frissen készített növényi extraktumot kaptak, a tesztnövények 3/4 része fertőződött. Ha ezt a kivonatot egy napon keresztül 4 °C-on vagy pár órán át 20 °C-on tartották, az átvitel néhány esetben pozitívnak bizonyult. Ha csak a tisztított vírussal próbálkoztak, az átvitel eredménytelen maradt akkor is, ha a fertőzött növény nagy mennyiségben tartalmazott burgonya Y-vírust. Ha azonban a tisztított vírust összekeverték a tisztítás során keletkezett felülúszóval (szupernatáns), a tesztnövények (Nicotiana tabacum cv. White Burley) többségén betegségtünetek jelentek meg. A felülúszó önmagában szintén nem volt alkalmas arra, hogy az átvitel megvalósuljon. A kérdés az, hogy vajon a vírus változik-e meg a tisztítás alatt, vagy van egy vírusidegen komponens, amely a tisztítás során a felülúszóba kerül. A 8. táblázat mutatja az elvégzett vizsgálat eredményét.

8. táblázat - A burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) átvitele levéltetvekkel (Govier és Kassanis, 1974 után)

Vírus

Ismétlés1

1.

2.

3.

Tisztított vírus

0/10

0/8

0/8

Tisztított vírus + felülúszó a fertőzött növényből

10/10

7/8

8/8

Tisztított vírus + felülúszó az egészséges növényből

0/8

Felülúszó a fertőzött növényből

0/10

0/8

0/8


1 A számlálóban a megfertőződött növények, a nevezőben a tesztnövények vannak feltüntetve.

A helper komponens (HC) kimutatásának eredeti módszere (Govier és Kassanis, 1974)

  1. Mielőtt a levéltetvek (Myzus persicae) a membránon keresztül táplálkozni kezdenének, minden tisztított extraktumhoz szaharózoldatot adunk (20 w/v%). Húsz perc múlva 10 db levéltetvet helyezünk mindegyik tesztnövényre (Nicotiana tabacum cv. White Burley).

  2. Az extrahálás folyamán a leveleket 0,1 M ammonium-acetátot (pH 7,0), 0,02 M EDTA-t és 0,02 M Na-DIECA-t tartalmazó oldatba mártjuk és vákuum segítségével a folyadékkal átitatjuk. Ezután a leveleket dörzsmozsárban szétdörzsöljük és muszlinon átnyomkodva leszűrjük. A megszűrt oldatot 20 percig 2,5% Triton X-100-al rázatjuk, majd kétszer centrifugáljuk (90 perc, 100 000 g). A csapadékot 0,01 M borát-pufferben (pH 8,0) oldjuk vissza úgy, hogy a végső koncentrációt 1 mg/ml-re állítjuk be.

  3. A burgonya Y-vírussal fertőzött növények kivonatának centrifugálása során (90 perc, 100 000 g) keletkezett felülúszó bizonyult fertőzőképesnek.

  4. Ha a tisztított vírust és a felülúszót együtt vizsgáljuk, akkor 0,5 ml vírushoz 1 ml szupernatánst adjunk.

A burgonya Y-vírus levéltetvekkel történő átviteléhez tehát szükséges egy olyan komponens, amely jóval kisebb, mint a víruspartikulum. E komponens eredetét további vizsgálatokkal próbálták kideríteni (Govier et al., 1977). A vizsgálat hasonlóképpen történt, mint azt korábban leírtuk. A különbség csak annyi, hogy a szaharózoldatot (20 w/v%) nem az extraktumhoz keverjük, hanem külön membránon kínáljuk fel (5 vagy 20 percig) a levéltetveknek (9. táblázat).

9. táblázat - Burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) és helper komponens átvitelek levéltetvekkel (Govier és Kassanis, 1974 után)

Vírus

Ismétlés1

1.

2.

Helper + vírus/5 perc táplálkozás szaharózon

8/8

8/8

Helper/5 perc táplálkozás szaharózon/vírus

8/8

7/8

Helper/20 perc táplálkozás szaharózon/vírus

3/8

Helper/vírus

8/8

7/8


1 A számlálóban a megfertőződött növények, a nevezőben a tesztnövények vannak feltüntetve.

Azt a komponenst, amely elősegíti a burgonya Y-vírus átvitelét, a szerzők segítő (helper) komponensnek (HC) nevezték. Az eredmények szerint a levéltetvek akkor voltak képesek a burgonya Y-vírus felvételére és átvitelére, ha előzőleg HC-t tartalmazó preparátumon szívogattak. Abban az esetben, ha sokáig (20 perc) hagyták a rovarokat a szaharózoldatból táplálkozni, az átvitel hatékonysága jelentősen romlott.

A helper komponens (HC) kimutatásának újabb módszere (Wang et al., 1998)

Wang et al. (1998) négy levéltetűfaj potyvirus átviteli képességét vizsgálták. A levéltetvek táplálkozását, vagyis a vírus megszerzésének folyamatát elektronikus monitoringgal követték nyomon, amellyel kiderítették, hogy a különböző átviteli eredmények a levéltetvek eltérő táplálkozási magatartásából adódtak. A vírus szipókában való megmaradását 125I-izotóppal jelölt virionokkal figyelték meg. Az eredmények azt mutatták, hogy a különböző levéltetűfajok tápcsatornájának alkotóelemei más-más kölcsönhatásba lépnek a potyvirusokkal, és ez okozza az átvitelben megmutatkozó eltéréseket. Végül homológ és heterológ potyvirusok segítségével kimutatták a segítő komponens meghatározó szerepét a vírusátvitelben.

A vizsgálathoz olyan levéltetűfajokat kell választani, amelyek ismert potyvirus vektorok (pl. Myzus persicae, Aphis gossypii), illetve olyanokat, amelyek átviteli képessége a vírustól függően változik (pl. Lypaphis erysimi, Myzus ascalonicus). A M. persicae és L. erysimi fajokat Brassica, az A. gossypii fajokat Cucumis, míg a M. ascalonicus vektorokat Allium ascalonicum növényeken lehet fenntartani. A vizsgálatokban a szárnyas egyedeket és a lárvaállapotú nimfákat lehet felhasználni.

A szívószájszerv (szipóka, stylet) aktivitásának kimutatása elektronikus jelekkel
  1. A M. persicae és a L. erysimi levéltetveket óvatosan Petri-csészébe helyezzük, és szobahőmérsékleten (23–26 °C) 1–3 órát éheztetjük.

  2. A M. ascalonicus egyedeket 24–26 órán át éheztetni kell.

  3. A levéltetvekhez finom vezetőképes elektródot (3 cm hosszú, 20 μm átmérőjű) kell ragasztani, amelyet egy EPG-vel (Electrical Penetration Graph) kötünk össze.

  4. A másik elektródot egy cserepes, 2–3 leveles dohány tesztnövény földjéhez csatlakoztatjuk, amelyre alacsony feszültségű egyenáramot kapcsolunk.

  5. Amikor a rovarok szívó szájszervüket a levél epidermiszébe helyezik, záródik az áramkör, és ez jel formájában megjelenik a monitoron.

  6. Az elemzéshez a STYLET 2.0 programot kell alkalmazni (Tjallingii és Mayoral, 1992).

A vírus és a helper komponens (HC) tisztítása

  1. A dohány karcolatos vírus (tobacco etch potyvirus) levéltetvekkel könnyen átvihető törzsének tisztítását Murphy et al. (1990) alapján végezzük.

  2. A tarlórépa mozaik vírus (turnip mosaic potyvirus) levéltetvekkel átvihető izolátumának tisztítására Murphy et al. (1990), valamint Sako (1980) módszere nyújt útmutatást.

  3. Mivel a dohány karcolatos vírus tisztított HC-je nem mutat eredményt az átvitelek során, ezért ezt a vírust a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) HC-jével lehet a levéltetvek számára felvehetővé tenni. A burgonya Y-vírus HC-jének tisztítását Thornbury et al. (1985) szerint végezzük.

  4. A tarlórépa mozaik vírus (turnip mosaic potyvirus) HC-jének tisztítása Sako és Ogata (1981) módszerének kis módosításával történik (lásd e–l pontok).

  5. A fertőzött tarlórépalevelek 50 g-ját 100 ml K-foszfátpufferrel homogenizáljuk (pH 8,5) és 15 percig 8000 g fordulaton centrifugáljuk.

  6. A felülúszót egy órán keresztül centrifugáljuk (120 000 g).

  7. A felülúszóhoz (NH4)2SO4-ot adunk a 18%-os telítettség eléréséig és 4 °C-on 10 percig keverjük.

  8. A kapott oldatot 20 percig jégen, keverés nélkül inkubáljuk.

  9. Az inkubálás után 15 percig centrifugáljuk (8000 g) az oldatot.

  10. A csapadékot 20 ml 0,02 M K-foszfát-pufferben (pH 7,5) feloldjuk és 10 percig 5000 g fordulaton centrifugáljuk.

  11. A felülúszóhoz annyi cukrot adunk, hogy a végső koncentrációban az oldat 20%-os legyen.

  12. Az oldatot maradék nélkül szétosztjuk és –20 °C-on fagyasztjuk.

  13. A HC-preparátumok aktivitását a 100 g/ml tisztított vírushoz (dohány karcolatos vírus, tarlórépa mozaik vírus) adott különböző mennyiségű HC-oldatok elegyével teszteljük. A további vizsgálatokhoz azokat az elegyeket használjuk fel, amelyek a M. persicae vektorral 100%-os átvitelt mutatnak (Pirone, 1981).

  14. A virionok radioaktív jódozását Wang et al. (1996) módszere alapján végezzük (lásd o–q pontok).

  15. 200 μl tisztított viriont (3,5 g/l) helyezünk el egy erre a célra alkalmas IODO-GEN jódozócsőbe, és 10 percig 1 mCi Na125I-izotóppal reagáltatjuk.

  16. A be nem épült Na125I-izotópokat a radioaktív virionoktól Sephadex G-25-oszlopon különítjük el.

  17. A vírus koncentrációját spektrofotométerrel határozzuk meg. A jelölés akkor jó, ha a vírus aktivitása 2640–4200 beütés per perc/nanogram (drive per minute/nanogram, d.p.m./ng) (dohány karcolatos vírus), ill. 1140–1780 d.p.m./ng (tarlórépa mozaik vírus) közé esik. Ezt gammaszámlálóval kell mérni.

A vírusátvitel általános menete
  1. A szárnyas levéltetveket üvegfiolákban tartjuk, és a felvételi táplálkozás előtt 2–3 órát éheztetjük.

  2. A dohány karcolatos vírust dohánynövényről dohánynövényre, a tarlórépa mozaik vírust tarlórépanövényről tarlórépanövényre visszük át.

  3. A felvételi táplálkozást sztereomikroszkóp alatt követjük nyomon.

  4. A levéltetvek 20–30 másodpercig táplálkoznak a fertőzött növényeken, azután egy éjszakára áthelyezzük őket a tesztnövényekre.

  5. Ha a rovarok táplálkozását nem kísérjük figyelemmel, akkor 10 percig hagyjuk őket a fertőzött növényeken, és ezután helyezzük át a tesztnövényekre, ahol egy éjszakán át maradnak.

  6. Ezt követően inszekticiddel elpusztítjuk a levéltetveket.

  7. A növények szimptomatológiai megfigyelését végezzük rendszeresen.

  8. A 125I-izotóppal jelölt vírus felvételét mini-inszektáriumokban, membránhártyákon keresztül lehet megfigyelni.

  9. A membrántasakokba 100 vagy 200 g/ml homológ vagy heterológ jelölt vírus kerül.

  10. Az éheztetett levéltetvek 10 percig táplálkozhatnak. A felvételi táplálkozást befejező levéltetveket tesztnövényekre helyezzük.

  11. A rovarok szívogatását sztereomikroszkóppal figyeljük meg.

  12. Kontrollként olyan jelöletlen dohány karcolatos vírust használunk, amely a burgonya Y-vírus HC-jét tartalmazza.

  13. A radioaktivitást folyadékszcintillációs számlálóval mérjük.

Az átviteli eredmények

A levéltetvek táplálkozása, vagyis a szívás folyamata három fázisra bontható: (1) az epidermisz (vagy membrán) átszúrása, (2) a szívó szájszerv (szipóka, stylet) levélszövetben tartása és (3) a szipóka visszahúzása a levélszövetből. A szívás időtartama (második fázis) a Myzus persicae, a M. ascalonicus és a Lipaphis erysimi fajoknál – a vizsgálatok szerint – 3–11 másodperc között változott, szignifikáns különbség a vektorok között nem mutatható ki (Wang et al., 1998).

Az elektronikus jelek feljegyzése szerint csak a második fázis szubfázisai (2/1, 2/2, 2/3) között tapasztalhatók időtartam- és frekvenciabeli különbségek. Valószínű, hogy a 2/1 szubfázis a nem-perzisztens vírusok inokulációjával, a 2/3 szubfázis a vírus megszerzésével függ össze.

A M. persicae és az Aphis gossypii levéltetűvektorok hatékonyak a dohány karcolatos vírus és a tarlórépa mozaik vírus átvitelében. A L. erysimi csak a tarlórépa mozaik vírus átvitelére képes, míg a M. ascalonicus vagy nem képes ezeket a vírusokat átvinni, vagy csak rendkívül kis hatékonysággal.

A vírus megtartásának folyamata jól nyomon követhető a 125I-izotóppal. A levéltetvek testében mért radioaktivitás erősségében azonban nem mutatható ki különbség az egyes fajok között.

A vírust sikeresen kimutatták a levelekből, ha a rovarok a membránokon keresztül megszerezhették a HC-t tartalmazó homológ vírust. Ha a membránokon keresztül történő etetéskor a heterológ vírussal (burgonya Y-vírus HC-jét tartalmazó dohány karcolatos vírus, tarlórépa mozaik vírus HC-jét tartalmazó dohány karcolatos vírus, burgonya Y-vírus HC-jét tartalmazó tarlórépa mozaik vírus) vehették fel a HC-t, a M. persicae levéltetű nagy, a M. ascalonicus alacsony hatékonyságú vektornak bizonyult. A L. erysimi azonban eredményesen átvitte a dohány karcolatos vírust, ha az tartalmazta a tarlórépa mozaik vírus HC-jét. Az A. gossypii vektor alacsony átviteli képességet mutatott mindkét vírus esetén, ha azok a tarlórépa mozaik vírus HC-jét tartalmazták. Ezek az eredmények egyértelműen bizonyítják a HC vírusátvitelben játszott kiemelkedő szerepét.

Vírus-, illetve fitoplazma-átvitel kabócákkal

A kabócákkal átvihető vírusok és fitoplazmák legnagyobb része csak hosszú inkubációs idő után vihető át vektorokkal. A vírusok (és a fitoplazmák), valamint a kabócák közötti kapcsolat jellemzését célzó vizsgálatok munka- és időigényesek. Ennélfogva fontos a megfelelő felszerelés beszerzése: inszektáriumok, fényforrások és a növények egyenletes növekedésének biztosítása (Horváth, 1972).

A kabócák tenyésztése

Az 1–5 lárvastádiumú Euscelis plebejus kabócák táplálására a Faba vulgaris, az ötödik stádiumtól a Bromus inermis növények a legalkalmasabbak (Musil, 1965). A Bromus növények előnye a Faba vulgaris növénnyel szemben az, hogy a nőstények előszeretettel rakják levelére a tojásaikat, valamint hogy nem fogékonyak a sárgaság típusú betegségekre. A tápnövényeket 7–10 naponta cseréljük frissre. A lárvák fejlődése fehérhere növényeken meggyorsítható. Nyáron a kabócák szaporodása folyamatos. Télen a lárvák nyugalomba vonulnak, erre a 0 – mínusz 5 °C a legmegfelelőbb (Horváth, 1972). Ha aszeptikus, azaz kórokozóktól mentes környezetben szeretnénk felnevelni a rovarokat, akkor Mitsuhashi és Maramorosch (1963) szerint kell eljárnunk:

  1. A kabócatojásokat mikroszkóp alatt óvatosan, tű segítségével kivágjuk a levélből. A tojásokat ezután viaszpapírcsíkokra erősítjük. A papírcsíkokat előzőleg 3 percig 0,1%-os Hiamin 2389-oldattal fertőtlenítjük.

  2. A sterilezett tojásokat agar táptalajon felnevelt növényeket tartalmazó üvegpalackokba rakjuk. A nimfák néhány nap alatt kikelnek a tojásból és a növényekre másznak.

  3. 30 °C-on 16 órás megvilágítás mellett kifejlődnek az imágók, amelyeket újabb steril növényeket tartalmazó üvegbe rakunk át. Itt párosodnak és lerakják tojásaikat.

  4. A felesleges pára elszívására akasszunk kis szilikagéllel töltött zsákokat az üvegedénybe.

Steril növények termesztése

A steril növények termesztésének alapja a növényi magvak fertőtlenítése. Ezt egyperces etilalkoholos (70%), majd 5 perces Hiamin 2389- (0,1%) oldatos, végül újra etilalkoholos (70%) mosással érhetjük el. Közben mindig steril desztillált vízzel öblítsünk. A magvakat (rozs, árpa, kukorica, lucerna, saláta, hagyma, sárgarépa, bíborhere stb.) Hoagland- és Knop-oldatot (Hoagland és Arnon, 1950) tartalmazó agar táptalajba helyezzük. A kikelt csíranövényeket tenyész-kémcsövekben, 25 °C-on, hosszúnappalos megvilágítás alatt tartjuk. A Dalbulus maidis a kukoricanövényeken, az Agallia constricta a lucernán és a bíborherén tenyészthető a legeredményesebben. A Macrosteles fascifrons kabócák sárgarépa-szövetkultúrákon néhány hétig életben tarthatók.

Here virágelzöldülés fitoplazma (clover phyllody phytoplasma) átvitele kabócával

A kapcsolódó kísérletet a here virágelzöldülés fitoplazmával (clover phyllody phytoplasma) végezhetjük el Euscelis plebejus vektor segítségével, Trifolium pratense gazda-, ill. tesztnövényen (Peterson, 1953). A kabócákat inszektáriumban tartjuk fenn, a rács mérete 50 mesh. A nimfákat ecset segítségével helyezzük át. A kifejlett kabócákat a 37. ábrán látható „szívókészülékkel” fogjuk, és kémcsőbe gyűjtjük. Óvatosan helyezzünk finom nejlonszűrőt az üvegcső nyílásához, hogy megakadályozzuk a kabócák kiszívását. Ha szükséges, a rovarokat immobilizálhatjuk úgy, hogy pár másodpercig belefújunk a csőbe. A kabócák a kis lyukon keresztül vihetők át egy másik növényre. Két napig tartó felvételi szívás után kb. 30 napnak kell eltelnie ahhoz, hogy a kórokozó átvihető legyen a tesztnövényre. Az eredményes fertőzést követő inkubációs idő elteltével figyeljük az indikátornövényeken megjelenő, betegségre utaló tüneteket.

37. ábra - A kifejlett kabócák gyűjtésére alkalmas szívókészülék [Washio et al., 1968 után módosítva Noordam (1973) után]

A kifejlett kabócák gyűjtésére alkalmas szívókészülék [Washio et al., 1968 után módosítva Noordam (1973) után]


Vírusátvitel nematódákkal (fonálférgekkel)

A szárazföldi fajok gyűjtéséhez nagyon kevés és egyszerű eszközre van szükség (néhány doboz vagy zacskó és kézi ásó). Nematódák mindenféle talajban élnek, amelyen növényzetet találunk. A fonálféreg-fauna 90%-a a földfelszín 5–30 cm-es rétegében található, ezért felesleges mélyebbre ásni. Ha a begyűjtött állatokkal átviteli vizsgálatokat végzünk, akkor fontos, hogy minél több példány életben maradjon. Ezért ügyelni kell arra, hogy a dobozba vagy zacskóba gyűjtött földet ne tömörítsük, és minél gyorsabban a laboratóriumba szállítsuk. Ha erre nincs mód, tegyük az anyagot pár napig hűtőszekrénybe.

A vírus talajban való jelenlétének bizonyítása teszt- (vagy csalogató) növényekkel

A begyűjtött földet tegyük olyan virágcserépbe, amelyben a tesztnövénypalántákat felnevelhetjük. Tekintettel arra, hogy a fonálférgek élettartama és aktivitása (különösen a Xiphinema és Longidorus fajok), valamint a vírusátvitel eredményessége a talaj nedvességétől függ, így a kísérleti növények talajának folyamatos vízellátása nagyon fontos. Ezért ajánlatos műanyag cserepet használni. Ültessük el a „csalogató” növényeket a cserépbe.

A nematódák izolálása talajból és a tesztnövények inokulálása nematódákkal

Ha a laboratóriumba vitt minta friss és abban az állatok még élnek, akkor a fonálférgek kinyerését azok aktív mozgására alapozzuk. Kétféle futtatás általános: a tölcséres és a tálcás. A tölcséres módszert Baermann-féle futtatásnak is nevezzük.

Baermann-féle futtatás (Andrássy és Farkas, 1988)

  1. Egy üveg- vagy műanyag tölcsért állványra rögzítünk, a végére rövid gumicsövet húzunk és azt pillanatszorítóval leszorítjuk.

  2. A tölcsérbe 1,5 mm lyukbőségű fém- vagy műanyag hálót, szitát vagy teaszűrőt helyezünk. Ebben van a kifuttatandó anyag.

  3. Ha nem talajból, hanem növényről akarunk fonálférgeket nyerni, akkor a fertőzött növény gyökerét vagy a föld feletti részét daraboljuk fel és kevés vízzel turmixoljuk öszsze.

  4. Az alul elzárt tölcsérbe – lehetőleg a szita mellett – töltsünk annyi vizet, hogy az a mintát 1–2 cm-nyire ellepje.

  5. A mintában lévő fonálférgek aktív mozgásuk következtében kiszabadulnak a talaj- vagy a növényrészecskék közül és a víznél nagyobb fajsúlyuk miatt lesüllyednek. Kb. 12 óra elég ahhoz, hogy a nematódák összegyűljenek a gumicsőben a szorító felett.

  6. Kinyitjuk a szorítót és a víz kis részét óraüvegbe vagy Petri-csészébe engedjük.

Tálcás futtatás (Andrássy és Farkas, 1988)

A tálcás futtatás elve is az állatok aktív mozgásán alapszik. Ezt a módszert akkor alkalmazzuk, ha egyszerre nagyobb mennyiségű állatot akarunk kinyerni.

a) Egy lapos, 0,5–1 mm lyukbőségű szitába durva szövésű vászondarabot, gézt vagy vattát helyezünk.

b) Ezen szétterítjük a vizsgálandó anyagot.

c) A szitát lábakra állítva tálcára tesszük, majd annyi vizet töltünk rá, hogy a mintát ellepje.

d) Pár óra állás után a nematódák a tálcába kerülnek.

e) Meggyorsíthatjuk a futtatást, ha a szitát fölülről lámpával melegítjük. Ekkor a száradó anyagot a fonálférgek igyekeznek minél gyorsabban elhagyni, ezáltal az alsó, nedvesebb régiók felé mozognak.

f) A tálcában lévő vizet ezután a benne lévő nematódákkal üveghengerbe töltjük, és kb. 10 perces várakozás után a fölösleges vizet leöntve összegyűjtjük az állatokat.

g) A hengerben lévő vizet planktonhálón is átönthetjük, és a hálóban fennakadt állatokat Petri-csészébe mossuk.

Seinhorst (1956) két módszert írt le a fonálférgek izolálására, amely a fajok különböző méretéből adódik.

Első módszer: Trichodorus fajok izolálása

  1. Mérjünk ki 500 g talajmintát (ha nagy a nematódák száma, elég 250 g is).

  2. Tegyük a talajt 2 mm-es lyukátmérőjű, félgömb alakú szűrőbe, amelyet egy tölcsérben helyeztünk el. A tölcsér nyílását dugóval zárjuk el. Helyezzük a tölcsért egy lombikba (38. ábra).

  3. Öntsünk a tölcsérbe annyi vizet, hogy a mintát ellepje.

  4. Ha a talaj agyagos, adjunk hozzá egy teáskanál nátrium-oxalátot vagy „Calgont”, és óvatosan keverjük össze.

  5. A keverő segítségével tördeljük a földet kicsi, 1 cm-es darabokra.

  6. Mozgassuk a szűrőt fel és le, hogy a talaj átjuthasson a lyukakon.

  7. A madzag segítségével húzzuk ki a dugót a tölcsérből, és mossuk a földet a lombikba, majd ezt követően töltsük tele vízzel.

  8. Erősítsünk a lombikra kis műanyag tölcsért, és zárjuk le dugóval.

  9. Fordítsuk meg a lombikot néhányszor oda-vissza.

  10. Helyezzük a lombikot fejjel lefelé egy vízzel telt főzőpohárba, és húzzuk ki a dugót a vízben. Mindezt olyan gyorsan végezzük, amennyire csak lehet. Előzetesen próbáljuk ki, hogy a dugót elég gyorsan ki tudjuk-e húzni, és hogy a lombikot elég jól tartja-e az állvány (39. ábra).

  11. 12–15 perc után újra visszahelyezzük a dugót, és a felső lombikot visszafordítjuk. Eltávolítjuk a tölcsért, és tartalmát tartályba ürítjük. A 12–15 perces időtartam alatt a homok és más részecskék lefelé, míg a víz felfelé áramlik. Ez a felfelé áramlás akadályozza meg a Trichodorus (és más kisebb nematóda fajok) leülepedését. A nagyobb Xiphinema fajoknak ez az áramlás túl lassú, ezért átkerülnek az alsó edénybe.

  12. Ha szükséges, a h és k lépéseket újra megismételhetjük a főzőpohár tartalmával.

  13. Öntsük át a tartály tartalmát 0,1 mm-es szűrőn keresztül egy másik tartályba.

  14. Mossuk át a szűrőt gyorsan és finoman a második tartályba.

  15. A szűrőn ragadt maradékot kis főzőpohárba öblítjük.

  16. Az m és n lépést megismételhetjük a második tartály tartalmával. Nagyon hatékony a visszanyerés, ha a szuszpenziót legalább ötször átszűrjük, de kétszeri szűrés általában elegendő.

  17. Öntsük az o pontban összegyűjtött anyagot 0,05 mm-es lyukátmérőjű szűrőbe. Helyezzük a szűrőt alátámasztva egy Petri-csészébe, és csak annyi vizet adjunk hozzá, hogy benedvesedjen, de a víz ne lepje el.

  18. 4–24 óra múlva ellenőrizzük a Petri-csésze tartalmát sztereomikroszkóppal (nagyítás 40×-es), és helyezzük fényre. A jobb vizsgálhatóság kedvéért használjunk négyzetrácsos műanyag dobozt. Amikor a nematódák néhány perc múlva leülepednek, távolítsuk el a vizet, és ürítsük a kis főzőpohár tartalmát a műanyag dobozba. Egy pici pálcára erősített disznószőrrel emeljük ki a fonálférgeket és tegyük vízbe egy kicsi, szállítható, sima aljú edénybe (40A–C ábra).

38. ábra - A Trichodorus fajok izolálásához szükséges, ún. Baerman-féle tölcsér [Noordam, 1973 után]

A Trichodorus fajok izolálásához szükséges, ún. Baerman-féle tölcsér [Noordam, 1973 után]


39. ábra - A Trichodorus fajok izolálásának következő lépése [Noordam, 1973 után]

A Trichodorus fajok izolálásának következő lépése [Noordam, 1973 után]


40. ábra - A: szűrő (0,05 mm) a Petri-csészében az állványon; B: doboz a bevésett négyzetráccsal: 1. fogantyú, 2. emelt szegély; C: disznószőr vékony fadarabra ragasztva [Noordam, 1973 után]

A: szűrő (0,05 mm) a Petri-csészében az állványon; B: doboz a bevésett négyzetráccsal: 1. fogantyú, 2. emelt szegély; C: disznószőr vékony fadarabra ragasztva [Noordam, 1973 után]


Könnyen észrevehető, hogy a nematódák alakja és mérete milyen különböző (41. ábra). Az elfogott fonálférgeknek csak egy kis része tartozik azon fajokhoz, amelyek vírusátvivők (42. ábra). A Trichodorus fajoknak lekerekített farka és görbült szájszerve van. Laboratóriumi gyakorlat nélkül a nematódák határozása nehéz.

41. ábra - Talajból izolálható nematódafajok. 1. Tylenchorhynchus dubius. 2. Rhabditid. 3.*Longidorus elongatus. 4. Dorilaimid. 5. Rotylenchus uniformis. 6.*Xiphinema diversicaudatum. 7. Tylolaimophorus. 8. Diphtherophora. 9. Trichodorus. A *-gal jelölt fajok vírusátvitelre alkalmasak [J. Seinhorst rajza alapján Noordam, 1973 után]

Talajból izolálható nematódafajok. 1. Tylenchorhynchus dubius. 2. Rhabditid. 3.*Longidorus elongatus. 4. Dorilaimid. 5. Rotylenchus uniformis. 6.*Xiphinema diversicaudatum. 7. Tylolaimophorus. 8. Diphtherophora. 9. Trichodorus. A *-gal jelölt fajok vírusátvitelre alkalmasak [J. Seinhorst rajza alapján Noordam, 1973 után]


42. ábra - A vírus megőrzésének speciális helyei a vektor fonálférgekben. A vírus kapcsolatban van a tápcsatorna falával a jelzett területeken [Taylor és Robertson, 1975 után]

A vírus megőrzésének speciális helyei a vektor fonálférgekben. A vírus kapcsolatban van a tápcsatorna falával a jelzett területeken [Taylor és Robertson, 1975 után]


A formalinos rögzítésen kívül még ismertek többkomponensű fixálóoldatok is, de a határozás szempontjából leginkább ajánlott módszer a hőmerevítés. Ha 45–50 °C-os vizet öntünk a már kiválogatott állatokra, vagy az óraüvegben összegyűjtött szuszpenziót láng fölött párszor áthúzzuk, a fonálférgek kinyúlnak, ezáltal könnyen mérhetők és tanulmányozhatóak. Vigyázzunk, a melegítést csak addig végezzük, amíg a vízben lévő állatok erősen vibrálni nem kezdenek. A megdermedés pillanatában nyomban fixálni kell. A hazai agronematológiával foglalkozó irodalom közül Andrássy és Farkas (1988), valamint Jávor (1974) kézikönyvében találhatók a fonálférgek életmódjával, szaporodásával, vizsgálati módszereivel és határozásával kapcsolatos ismeretek.

A dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) átvitele fonálférgekkel

  1. Ültessünk 10 db Nicotiana tabacum növényt műanyag cserépben lévő, sterilizált földbe (legalább 3 héttel a vizsgálat előtt).

  2. Ültessünk dohány rattle vírussal fertőzött Nicotiana tabacum palántákat fonálférgeket tartalmazó földbe.

  3. Két nap múlva a földtől megtisztított nematódaszuszpenziót (akár szétválogattuk, akár nem) öt részre osztva ömlesszük az egészséges dohánypalánták szárához közel lévő sekély lyukba. Hagyjuk a másik öt cserepet kezeletlenül.

  4. Kb. 10 nap múlva a leveleken megjelennek a dohány rattle vírus tipikus tünetei (nekrotikus gyűrűk, érnekrózis). Ha a tünetek elmaradnak, vizsgáljuk meg, hogy a vírus a gyökérből kimutatható-e.

A vírus jelenlétének kimutatása gyökérből

A növényt vegyük ki a cserépből és mossuk le a földet a gyökeréről. Vágjuk le a gyökér egy darabját és mozsárban dörzsöljük szét. Inokuláljunk egy karborundummal beszórt N. tabacum tesztnövényt, mindegyik növény gyökerének szövetnedvével külön-külön. A szövetnedvet 1:10 arányban hígítsuk foszfát-pufferrel (pH 7,0). A tüneteket (nekrotikus foltok, gyűrűk) 2–5 nap elteltével ellenőrizhetjük.

Második módszer: Xiphinema és Longidorus fajok izolálása

A Xiphinema és a Longidorus fonálférgek sokkal nagyobbak, mint a Trichodorus fajok. Ezek a fonálférgek az izolálás során a homokkal, törmelékkel együtt az üledékbe kerülnek (vö. az Első módszer című módszertani leírás k pontjával). Ezeket a nematódákat csak szűrővel különítettük el a kisebb fajoktól. Az izolálást ettől a lépéstől is folytathatjuk, vagy használhatjuk az eredeti talajmintát is.

  1. Öntsünk vizet a talajmintára egy megfelelő edényben, pl. vödörben. Legalább tízszeresére hígítsuk a földet és keverjük össze.

  2. A durva talajdarabok pár másodperc múlva leülepednek.

  3. Öntsük át a felülúszót 0,25 mm-es lyukátmérőjű szűrőn, és a maradékot gyűjtsük egy főzőpohárba.

  4. Ismételjük meg a c pontot kétszer-háromszor.

  5. Az így összegyűjtött maradékokat 0,1–0,2 mm-es lyukátmérőjű szűrőbe töltjük, és a szűrőt sekély rétegű vizet tartalmazó Petri-csészébe helyezzük.

  6. Sztereomikroszkóppal fény alatt vizsgáljuk.

  7. A nematódák fertőzőképességét az előbb leírtak szerint ellenőrizzük. A vírus jelenlétét tesztnövényekkel mutatjuk ki.

  8. Fonálféreggel történő átvitel, javított standard módszerrel (Fritzsche, 1967)

  9. A magvető ládákban kikelt 3–4 cm-es növényeket nem cserépbe, hanem 4 × 4 cm nagyságú kimélyített üvegkockákba rakjuk (43. ábra).

  10. Az üvegkockákba csak annyi sterilizált földet rakjunk, amennyi éppen ellepi a benne elültetett növény gyökerét.

  11. A talajnedvesség fenntartása céljából tegyük a kockákat egy nagy Petri-csészébe. A módszer előnye, hogy így a fonálférgek közvetlenül a gyökér közelébe helyezhetők, mozgásukat a talaj nem befolyásolja. A módszer hátránya, hogy a vizsgált növények élettartama igen rövid.

43. ábra - Javított standard módszerrel végzett vírusátvitel fonálférgekkel[R. Fritzsche szívessége folytán]

Javított standard módszerrel végzett vírusátvitel fonálférgekkel[R. Fritzsche szívessége folytán]


Vírusátvitel talajlakó gombákkal

A talajlakó gombák közül a legismertebb az Olpidium brassicae, amely a dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) és a Spongospora subterranea, amely a burgonya szártörpülés vírus (potato mop-top pomovirus) (44. ábra) átvitelére alkalmas (Harris és Maramorosch, 1980; Jones, 1993b).

44. ábra - A burgonya szártörpülés vírus (potato mop-top pomovirus) lokális tünetei Chenopodium amaranticolor diagnosztikai tesztnövényen, 27 nappal az inokulálás után [Horváth József szívessége folytán]

A burgonya szártörpülés vírus (potato mop-top pomovirus) lokális tünetei Chenopodium amaranticolor diagnosztikai tesztnövényen, 27 nappal az inokulálás után [Horváth József szívessége folytán]


A dohány nekrózis vírus átvitele Olpidium brassicae gombával

  1. Az O. brassicae gombát légszáraz gyökérből vagy közvetlenül saláta- (Lactuca sativa) növény gyökeréből izolálhatjuk. A Solanum nigrum, Solanum villosum vagy a Lactuca sativa növényeket virágcserépben neveljük, durva homok és kagylózúzalék keverékén. Egy hét múlva hígítsunk Hoagland-oldatot 1:20 arányban (pH 7,0) és öntsük a virágcserépbe. További napokon vízzel öntözzük (Teakle, 1967).

  2. Amikor a gyökerek elérik a 3 mm-es hosszúságot, akkor a zoospóra-szuszpenziót a palánta szárához közel lévő sekély lyukba öntjük. 5–8 nap után a zoospórák nagy tömegben vannak jelen.

  3. Az inokuláláshoz kb. 60 db növény gyökerére van szükségünk, amelyet előzőleg folyóvízben gyorsan lemostunk és kb. 30 ml desztillált vizet tartalmazó Petri-csészébe raktunk. 1%-os nyúlszérumot adunk a vízhez, hogy meghosszabbítsuk a zoospórák mozgásképességét.

  4. Kilenc rész zoospóra-szuszpenzióhoz (105–106 zoospóra /ml) egy rész dohány nekrózis vírust tartalmazó szövetnedvet (15 g/l) adunk.

  5. Öt perc elteltével 5 db Phaseolus aureus palánta gyökerét tesszük az elegybe, 5–30 percre. Ültessük a növényeket Hoagland-féle ásványi tápoldattal átitatott homokba.

  6. Az összehasonlítás kedvéért helyezzünk 5 db P. aureus növényt 5–30 percre dohány nekrózis vírust tartalmazó szövetnedvbe (1,5 g/l), és utána ültessük el. Egy-két nap elteltével nekrotikus lokális léziók jelennek meg a megfertőződött gyökereken.

Vírusátvitel Cuscuta fajokkal

Több vírus is képes egy olyan „természetes hídon” keresztül átjutni a fertőzött növényből az egészségesbe, amelyet egy parazita növény, az aranka (Cuscuta spp.) indája hoz létre. Arankával nemcsak az átnövő szár segítségével tudnak a vírusok átjutni a beteg növényről az egészséges növényre, hanem akkor is, ha a fertőző növényen felnőtt aranka egy levágott hajtása rátekeredik a tesztnövény szárára és levelére.

Uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) és dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) átvitele arankával

A tesztelést elvégezhetjük vírussal fertőzött Nicotiana glutinosa növényről vírusmentes növényekre (Bakos et al., 1995).

  1. Tegyünk Cuscuta subinclusa magokat steril desztillált vizes, 0,5%-os agarózra (pH 5,5). Az arankamagoknak kemény burka van, ezért áztassuk a magokat 20 percig H2SO4-ban, majd öblítsük háromszor bőséges desztillált vízzel. Ezután tegyük 20 percre 20%-os hypóba, majd legalább háromszor alaposan mossuk le desztillált vízzel. Az aranka a csírázást követően rendkívül gyorsan növekszik. A kezdetleges gyökérre csak addig van szüksége, amíg a csíranövény számára szükséges vizet felveszi, később elszárad. A további tápanyagfelvétel a hausztóriumokon keresztül történik.

  2. Helyezzük a magról kelt 2–4 cm-es növényeket közvetlenül a gazdanövény szára vagy levélnyele mellé úgy, hogy érintkezzenek egymással. Mindezt párás körülmények között végezzük. Olyan növények alkalmasak gazdának, amelyeknek nincsen hosszú szőre (Beta vulgaris, Vicia faba). Mielőtt virágzásnak indulna, tegyük át a csúcstól számított 10–20 cm hosszú szárakat egy új gazdanövényre, hogy megtartsuk az arankát vegetatív stádiumban. A szárak csúcsain vannak ugyanis a gazdanövényt felismerő receptorok.

  3. Az arankát fertőzhetjük úgy, hogy palántáját vagy 10–20 cm-es szárát a beteg növényre helyezzük. Ügyeljünk arra, hogy a szár csúcsa elérje a gazdanövényt. Két hét múlva vagy később tegyük olyan közel a tesztnövényhez, hogy az aranka szára átérhessen hozzá, vagy vágjunk 10–20 cm-es szárat és tekerjük ezt a tesztnövény köré.

  4. Egy-két nap elteltével figyeljük meg a megjelenő tüneteket a tesztnövények gyökerein.