Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

Rovarokkal történő vírusátvitel molekuláris aspektusai

Rovarokkal történő vírusátvitel molekuláris aspektusai

A vektorokkal történő vírusátvitel valamennyi típusában a víruspartikulumok mozgását kell nyomon követni. A vírus és a vektor közötti molekuláris kölcsönhatást a víruspartikulumok felszíne határozza meg. A legtöbb vírus esetében a virionok felszíne lép kölcsönhatásba a vektorral. Ez a kölcsönhatás lehet közvetlen, vagy történhet közvetett módon is, egy másik, vírus által kódolt fehérjén keresztül (Hull, 1994). Ma már bizonyított tény, hogy a vírusgenom és a géntermékek meghatározzák az átvitelt.

Köpenyfehérje (CP)

A vírus-köpenyfehérje meghatározó az átvitel szempontjából. A köpenyfehérje pontos természete több esetben még nem tisztázott, de azt tudjuk, hogy bizonyos aminosavak és domének lényegesek a folyamatban. A köpenyfehérjét vizsgáló tanulmányok többségének középpontjában azok a módosult vagy módosított vírusváltozatok állnak, amelyek eredetileg nem képesek a vírusátvitelre, de molekuláris úton átvihetővé tehetők (Pirone, 1991).

A propagatív vírus–vektor kapcsolatok közül a here seb tumor vírus (clover wound tumor phytoreovirus) és a kabócák között mutatták ki – első esetben molekuláris szinten – a köpenyfehérje szerepét. A here seb tumor vírus vad típusú izolátumaiban a kettős szálú RNS 12 szegmensében hiány (deléció) található, ami az átviteli képesség elvesztését eredményezi. A 2. vagy 5. szegmens deléciója esetén megszűnik az átvitel, és ezek az izolátumok a rovarsejteket sem fertőzik. Ez a két génszakasz kódolja a vírus köpenyének 130 kD és 76 kD nagyságú fehérjéit. A külső köpeny enzimatikus eltávolítása nem okozza a vektorsejtek fertőzöttségének elvesztését. Valószínű, hogy a génszakaszok hiánya fontosabb az átvitel szempontjából, mint a külső köpeny eltávolítása. Egy másik vírus, a burgonya sárga törpülés vírus (potato yellow dwarf nucleorhabdovirus) felszínén glükoprotein (G-protein) „tüskék” helyezkednek el, ezek okozzák a kórokozó kabócával történő átvihetőségét. A „tüskék” eltávolítása a rovar testében a vírusfertőzés csökkenését eredményezi, a növényben azonban nem. A burgonya sárga törpülés vírusnak két törzse ismert, amelyet különböző kabócavektorok terjesztenek. A két törzs G-proteinjének különböző izoelektromos pontja összefüggésben van az egyrétegű vektorsejt fertőzésének pH-optimumával.

Az árpa sárga törpülés vírus (barley yellow dwarf luteovirus) levéltetvekkel történő terjedése cirkulatív jellegű, de a vírus a vektor testében nem szaporodik. Az árpa sárga törpülés vírus MAV-izolátuma normális körülmények között nem vihető át Rhopalosiphum padi levéltetűvel, míg a vírus RPV-izolátuma igen. Ha a MAV-izolátum RNS-ét az RPV-izolátum köpenyfehérjéjébe burkolták, akkor a MAV-RNS is átvihetővé vált R. padi által. Cirkulatív átvitel esetén a köpenyfehérje szerepét bizonyítja az a tény is, hogy luteovirusokkal történt kevert fertőzés hatására levéltetvekkel nem átvihető vírusok is átvihetővé válnak. A kevert fertőzéseknél a nem luteovirus-RNS a luteovirus köpenyfehérjébe enkapszidálódik. A kevert vírusoknak speciális vektoraik vannak, amelyeket a luteovirus eredetű köpenyfehérje határoz meg. A cirkulatív borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus) átvitelét a köpenyfehérje kisebb alkotója határozza meg. Ez a 22 kD fehérje a levéltetűvel átvihető és a nem átvihető izolátumokban egyaránt túlsúlyban van. Ennek a kis fehérjének a jelenléte összefügg a levéltetűvel átvihető izolátumban egy magas molekulatömegű RNS1-gyel, amelyik a köpenyfehérjét kódolja. A genom részének elvesztése eredményezi az 56 kD-os termék hiányát, ami nélkülözhetetlen a levéltetű-átvitelben. Az árpa sárga törpülés vírus és a borsó enációs mozaik vírus esetében a kórokozónak be kell kerülnie a vektor nyálmirigyébe, és ezt követően lehetséges a vírusátvitel. A köpenyfehérje szerepét egy geminivirus vektorában génkicseréléssel bizonyították. Az egyszálú DNS-t tartalmazó geminivirusoknak két alcsoportját különböztetjük meg. Az egyik alcsoportot molytetvek, míg a másikat kabócák terjesztik. Kiméra klónokat állítottak elő úgy, hogy a konstrukcióban a molytetűvel átvihető Cassava afrikai mozaik vírus (Cassava African mosaic bigeminivirus) DNS-éhez a kabócával átvihető répa levélcsúcs fodrosodás vírus (beet curly top hybrigeminivirus = curtovirus) köpenyfehérjéjét illesztették. A kimérával növényeket fertőztek, majd a tisztított víruskimérát kabócába injektálták. A rovar a vírust átvitte, a növény a Cassava afrikai mozaik vírus tüneteit mutatta.

A nem cirkulatív vírusátvitelnél a vektor–vírus kölcsönhatás nem annyira specifikus, mint a cirkulatív vírusok esetében. A nem cirkulatív vírusok mechanikailag könnyen átvihetők. Ebben a víruscsoportban is vannak levéltetűvel kevésbé és jobban átvihető izolátumok. Mindkét típust használták a köpenyfehérje szerepének kimutatására cucumovirusok és potyvirusok levéltetű átvitelében. Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) eltérő izolátumaival végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy az átvihetőséget az határozza meg, hogy az RNS-t melyik típusú köpenyfehérje burkolja. A paradicsom magtalanság vírus (tomato aspermy cucumovirus) V törzsének köpenyfehérjéje, amely levéltetvekkel átvihető, szintén lehetővé tette az uborka mozaik vírus átvitelét. A paradicsom magtalanság vírus a dohány mozaik vírust (tobacco mosaic tobamovirus) is képes az előbb leírtak szerint a levéltetvek számára felvehetővé tenni. Az uborka mozaik vírus genomjában az RNS-3 kódolja a köpenyfehérjét. A levéltetű-átvihetőséget szintén az RNS-3 határozza meg. Az összehasonlítási vizsgálatok azt mutatták, hogy a köpenyfehérje 168. aminosava felelős a vírus terjedéséért. A köpenyfehérje szerepét közvetett módon bizonyítja a dohány karcolatos vírus (tobacco etch potyvirus) levéltetvekkel nem terjeszthető izolátuma. Ezen izolátumok köpenyfehérjéjének N-végén lévő aminosav-szekvenciákat összehasonlították ugyanezen vírus magas átviteli hatékonysággal rendelkező izolátumaival és más, levéltetűvel átvihető potyvirusok N-végeivel. Az eredmény meglepő volt. A levéltetűvel átvihető izolátumokban három aminosav-szekvencia mutatkozott konzervatívnak: Asp-Ala-Gly (DAG). A nem átvihető izolátumban pedig az Asp-Ala-Ser (DAS). Ez az aminosavtriplet foglalja magában a levéltetűvel történő átvihetőséget. Más potyvirusok tripletjeivel végzett összehasonlító vizsgálatok azt mutatták, hogy a triplet 2., ill. 3. helye gyakran változik az izolátumokban, pl. a szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) esetében Asp-Ala-Leu (DAL), a papaya gyűrűsfoltosság vírusnál (papaya ringspot potyvirus) és a cukkini sárga mozaik vírusnál (zucchini yellow mosaic potyvirus) Asp-Thr-Gly (DTG), végül a szója mozaik vírusban (soybean mosaic potyvirus) Asp-Ala-Asp (DAD). A triplet harmadik aminosavjának szerepét a dohány érfoltosság vírus (tobacco vein mottling potyvirus) levéltetvekkel terjedő izolátumával bizonyították, amelyben a triplet Asp-Ala-Glu (DAE). Olyan transzkriptumokkal fertőztek növényeket, amelyekben az átvihető izolátum teljes hosszúságú cDNS klónjába a nem átvihető izolátum köpenyfehérjéjének cDNS klónját helyezték. Ezt a kiméra vírust a levéltetvek képtelenek voltak átvinni, annak ellenére hogy a kiméra mechanikai fertőzhetőségét megőrizte. Később felbecsülték a köpenyfehérje N-vég DAG-tripletjében létrejövő hiányok vagy helyettesítések jelentőségét a dohány érfoltosság vírus levéltetű-átvitelében. A molekuláris módszerrel létrehozott mutánsokat a dohány érfoltosság vírus levéltetűvel terjeszthető izolátumának teljes hosszúságú cDNS klónjába építették, és a transzkriptumokkal növényeket fertőztek. A DAG-triplet teljes deléciója pl. az átviteli képesség megszűnésével járt. Ha a triplet első aminosavját Asp-ról Asn-ra változtatták, akkor a mutáció az átvitelre nem volt hatással. A második aminosavban történt változtatás már drasztikusan érinti az átviteli képességet. Ha a relatív átviteli képességet százalékban fejezzük ki a kontroll DAG-izolátumokhoz képest, akkor ez az érték 3%. A harmadik aminosav helyettesítése az átvitel hatékonyságát 0%-ra csökkentette. A továbbiakban azt kell meghatározni, hogy a levéltetű-átvitelért felelős domain kiterjedése mekkora a genomban. Ehhez hasonló hiányok vagy helyettesítések a természetben is létrejöhetnek, bizonytalanná téve a potyvirusok átvitelét. A potyvirusok ugyanis megkötődhetnek a tápcsatornában vagy a vektor előbelében. A potyvirus-köpenyfehérje N-végének aminosavai a virion felszínén helyezkednek el, ezért alapvetően befolyásolhatják a vírus kötődését és megtartását.

Helper komponens (HC)

Míg a cirkulatív cucumovirusok levéltetű-átvitelét kizárólag a köpenyfehérje határozza meg, addig a potyvirusok és caulimovirusok esetében szükség van egy vírus által kódolt, nem szerkezeti fehérjére. Ezt a fehérjét helper, azaz segítő komponensnek (HC) nevezzük, de a caulimovirusoknál megszerzési vagy levéltetű-átviteli faktornak is hívják.

A karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) HC-je elősegíti a klónozott vírus-DNS fertőzését. A deléciós mutánsok analízise és a karfiol mozaik vírus izolátumok különböző átviteli képességekkel rendelkező kimérájának szerkezete bizonyítja, hogy a genom nyílt leolvasási szakasza (open reading frame, ORF), az ORFII kódolja a HC-t. Az ORFII egy 18 kD (P18) fehérjét kódol, amely kimutatható a vírussal fertőzött növényben. Valószínűleg a P18 fehérje maga a HC. A karfiol mozaik vírus levéltetvekkel nem átvihető izolátumával fertőzött növényekben vagy nincs P18 fehérje, vagy van, de egy kicserélődés eredményeképpen mutáció jön létre a 94. aminosav helyén. Egy deléció az ORFII rendszeren belül vagy a P18 fehérje végében a levéltetű-átvitel megszűnését okozza. Nagyon nehéz közvetlenül bizonyítani, hogy a P18 tulajdonképpen a HC. A karfiol mozaik vírus levéltetvekkel átvihető izolátumával fertőzött növények nedvével végzett membrán-etetéses vizsgálatok pozitív összefüggést mutattak a P18 jelenléte és a levéltetű-átvihetőség között. Két potyvirus [dohány érfoltosság vírus (tobacco mottling potyvirus) és burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus)] HC-jét tisztították, és két fehérjét kaptak (53 kD, 58 kD). Ebből arra következtettek, hogy a HC biológiailag aktív formája valószínűleg egy dimer. Az in vitro transzláció és a nukleotidok szekvenciaanalízise alapján a dohány érfoltosság vírus HC-jét a második gén kódolja. Ha a vírus HC-jének N-terminusa blokkolt, nem lehetséges a HC-gén 5’ végének meghatározása. A vírus-HC N-vége valószínűleg szerin, míg C-terminusa a dohány karcolatos vírussal (tobacco etch potyvirus) analóg módon glicin. Ennek alapján a dohány érfoltosság vírus HC-gén a 947. nukleotidnál kezdődik és a 2344. nukleotidnál végződik. Bizonyos burgonya Y-vírus és cukkini sárga mozaik vírus törzsek a HC deléciója miatt váltak levéltetvekkel átvihetetlenné. A burgonya Y-vírus HC-defektív törzsének elektroforetikus és immunológiai tulajdonságai hasonlítanak a burgonya C-vírushoz [= burgonya Y-vírus C-törzse (C-strain of potato Y potyvirus)]. A burgonya Y-vírus és a C-vírus törzs aminosav szekvenciáinak és nukleotidjainak összehasonlítása a HC–PRO (helper component-protease) régióban 92%-os homológiát mutat, és csak 24 aminosavban van eltérés. A C-vírus törzs HC-szekvenciáit további öt potyvirussal összehasonlítva csak két aminosavban van eltérés (lizinről glutaminsavra és izoleucinról valinra). Az aminosavaknak a HC tevékenységében játszott szerepe a mai napig vizsgálat tárgyát képezi. A HC tehát közvetlenül vagy közvetett úton képes irányítani a vírusátvitelt. A direkt viszonyban a köpenyfehérje N-terminális aminosavai közvetlenül lépnek kölcsönhatásba a HC-vel, míg a közvetett (indirekt) viszonyban a HC csak közvetítő szerepet játszik a virionok és a vírus megőrzési helye között a vektorban.