Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

Fizikai tulajdonságok vizsgálati módszerei

Fizikai tulajdonságok vizsgálati módszerei

A fizikai tulajdonságokat vizsgáló módszerek eredményei tájékozódást nyújtanak a vírusok fizikai tulajdonságairól (hőinaktiválási pont, hígíthatósági határ, in vitro eltarthatóság, eltarthatóság kiszárítással szobahőmérsékleten, ill. alacsony hőmérséketen) (Horváth, 1972). A fizikai tulajdonságok meghatározásával kapcsolatos módszereket Horváth (1966a,b), Noordam (1973), Schmelzer et al. (1980) és Hill (1984) alapján az alábbiakban foglaljuk össze. Dijkstra és De Jager (1998) e könyv kéziratának leadása után megjelent vírusmódszertani könyvükben a fizikai tulajdonságok meghatározását részletesen tárgyalják.

Hőinaktiválási pont meghatározása

A vírusok hőmérséklettől függő tulajdonsága a vírusra jellemző érték. A hőinaktiválási pont az a legalacsonyabb hőmérséklet, amelyen a hígítatlan présnedv tízperces kezelés után már elveszti fertőzőképességét.

  1. A hígítatlan dohány mozaik vírust (tobacco mosaic tobamovirus) tartalmazó szövetnedvből 2–2 ml-t 6 db vékonyfalú kémcsőbe pipettázunk, s a kémcsöveket parafa- vagy vattadugóval lezárjuk.

  2. Egy-egy kémcsövet 10–10 percre 95, 90, 80, 70 és 60 °C-os vízfürdőbe állítunk, és hagyunk egy kezeletlen kontrollt. A kezelés után a kapott növénynedvet tesztnövényekre (pl. Nicotiana glutinosa) visszük át. Az inokulációt követően a keletkezett tünetek alapján megállapítható a vírus hőinaktiválási pontja, amely a dohány mozaik vírus esetében 90 és 95 °C között van.

Hígíthatósági határ meghatározása

A vírustartalmú növényi nedv fokozatos hígításával fokozatosan csökken a fertőzőképesség is. A hígíthatóság határa az a legnagyobb hígíthatósági érték, amelynél még kimutatható a fertőzőképesség.

  1. A kísérlethez 8 db kémcső szükséges, amelyekből hétbe 9–9 ml vizet pipettázunk. A nyolcadik kémcsőbe 2 ml hígítatlan vírustartalmú szövetnedvet teszünk.

  2. A hígítatlan szövetnedvből kiveszünk 1ml-t, ezt belerakjuk a következő kémcsőbe, majd ebből is kiveszünk 1ml-t és a következő kémcsőbe pipettázzuk. Ezt a műveletet addig folytatjuk, amíg az utolsó kémcsőhöz nem érünk. Így 10–1, 10–2, 10–3, 10–4, 10–5, 10–6, 10–7 töménységű hígítási sorozatot kapunk.

  3. Az így kapott oldatokkal lokális tesztnövényeket (Nicotiana glutinosa) inokulálunk, s a kifejlődött léziók alapján megállapítható a vírus szövetnedvének hígítási végpontja. A dohány mozaik vírus esetében ez 10–6 és 10–7 között van.

In vitro eltarthatóság meghatározása

A fertőzött növényi szövetnedv szobahőmérsékleten tartva fokozatosan elveszti fertőzőképességét. A virionok stabilitását az in vitro eltarthatóság határával órákban, napokban vagy hetekben fejezzük ki.

  1. Uborka mozaik vírussal (cucumber mosaic cucumovirus) fertőződött Nicotiana tabacum cv. Samsun leveleiből 25 g-ot dörzsmozsárban homogenálunk, majd a kapott növénynedvből 2–2 ml-t 7 db kémcsőbe töltünk.

  2. A kémcsöveket gumi- vagy vattadugóval lezárjuk, és szobahőmérsékleten, kb. 20 °C-on 0, 4, 8, 24, 48, 72 és 96 órát hagyjuk. Egyes vírusok esetében az in vitro eltarthatóság hosszabb is lehet.

  3. A tárolási idő letelte után a kezelt növénynedvekkel tesztnövényeket inokulálunk, majd ellenőrizzük a fertőzőképesség csökkenését. Az uborka mozaik vírus a 72 órás, szobahőmérsékleten való tárolás után elveszti fertőzőképességét, tehát in vitro a kevésbé stabil vírusok közé tartozik.

Eltarthatóság kiszárítással szobahőmérsékleten

A vírusok inaktiválódásának vagy in vitro eltarthatóságának egyik, gyakorlati szempontból is lényeges kérdése, hogy mennyire viselik el a kiszáradás körülményeit.

  1. Az uborka mozaik vírussal szisztemikusan fertőződött Nicotiana tabacum cv. Samsun növényeket 20–22 °C-os szobahőmérsékleten felfüggesztve szárítjuk.

  2. Minden 24. órában néhány levelet leveszünk a növényről, dörzsmozsárban homogenáljuk, majd pár csepp vizet hozzáadva, az oldattal Nicotiana glutinosa növényeket inokulálunk.

  3. A kísérletek szerint a vírus 12–50 napi szobahőmérsékleten való tárolás után is megtartja fertőzőképességét. Egyes vírusok (pl. a dohány mozaik vírus) több évig, évtizedig is megőrzik fertőzőképességüket a száraz levelekben.

Eltarthatóság kiszárítással alacsony hőmérsékleten (Horváth, 1976; Horváth és Besada, 1980)

  1. Az előzőleg vírussal inokulált és megbetegedett növények leveleit a főér kivételével zsilettel vékony csíkokra vagdossuk és hűtőszekrényben 2 °C és 5 °C között a CaCl2-tól perforált alumíniumlemezzel elválasztva steril Petri-csészékben és steril szitaszöveten tároljuk.

  2. A beszárított vírustartalmú levélszövetből bizonyos idő eltelte után (hetek, hónapok, évek) mintát veszünk és a mintával azonos mennyiségű foszfát-pufferrel (0,1 M, pH 7,0) szövetpépet készítünk.

  3. Az inokulációra lehetőleg lokális léziókkal reagáló tesztnövényeket használunk, s megállapítjuk a vírus fertőzőképességét, ill. eltarthatóságát.

Megyjegyzés: Az egyes vírusok eltarthatósága (19 vírus 24 izolátum esetében) 10–87 hónap között váltakozhat (Horváth és Besada, 1980).