Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

9. fejezet - Elektronmikroszkópos módszerek

9. fejezet - Elektronmikroszkópos módszerek

A növényvírusok a gazdanövényben olyan szöveti elváltozásokat idézhetnek elő, amelyeket elektronmikroszkóp segítségével megfigyelhetünk. Egy új vírus leírása ma már elképzelhetetlen elektronmikroszkópos vizsgálatok nélkül. A növényvírusok rendszerét összefoglaló tanulmányok, kézikönyvek is tartalmaznak elektronmikroszkópos felvételeket minden csoport egy-egy fontosabb, jellegzetes képviselőjéről (Schmidt, 1980a; Milne, 1984, 1993; Francki et al., 1985). A vírusfertőzés hatására bekövetkezett kóros változások a növény élettani működésében mindig valamilyen szerkezeti eltéréshez kapcsolhatók. A beteg növény anyagcsere-folyamataira vonatkozó mérések és az ultrastrukturális vizsgálatok eredményeinek együttes elemzése teljesebb képet adhat a fertőzés hatásmechanizmusáról. Ezért az elektronmikroszkópos kutatómunkán alapuló adatok nem önállóan, hanem többnyire összetett vizsgálatok részeredményeként értékelhetők. A növényvírusok osztályozása alakjuk, méretük, felépítésük, szerológiai jellemzőik, genetikai szerkezetük és újabban replikációs stratégiájuk szerint történik. Ezért a növényvirológia számára új, még le nem írt vírusok rendszerbe sorolása részben elektronmikroszkópiai technikákon alapul. Ahhoz, hogy ilyen jellegű vizsgálatokat végezzünk, tisztában kell lennünk a növényvírusok morfológiájával, amelyet csak elektronmikroszkóppal tudunk megállapítani. A virionok nukleinsavból (vírusgenom) és az azt körülvevő fehérjeburokból állnak. A fehérjeburok (kapszid) köpenyfehérje-alegységekből (kapszomer) épül fel. Ezek elrendeződése szabja meg a virion szimmetriáját, illetve alakját, amely lehet izometrikus, ikozaéder (más szóval szférikus, mivel kisebb felbontású felvételeken gömbölyűnek tűnnek) és anizometrikus szimmetriájú – ezen belül megkülönböztetünk merev pálcika, hajlékony fonál formát és bacilus alakot (52. ábra). A legkisebb, izometrikus virion átmérője 12 nm körüli, míg a leghosszabb, fonál alakú vírusok hoszszúsága körülbelül 2000 nm.

52. ábra - Különböző morfológiájú növénypatogén vírusok. A: pálcika alakú dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus); B: fonál alakú saláta mozaik vírus (lettuce mosaic potyvirus); C: szférikus belladonna foltosság vírus (belladonna mottle tymovirus) [Horváth József szívessége folytán]

Különböző morfológiájú növénypatogén vírusok. A: pálcika alakú dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus); B: fonál alakú saláta mozaik vírus (lettuce mosaic potyvirus); C: szférikus belladonna foltosság vírus (belladonna mottle tymovirus) [Horváth József szívessége folytán]


Negatív festéses módszer

Az eljárás lényege, hogy a fertőzött növényből származó, virionokat tartalmazó nedvet vagy tisztított víruspreparátumot nagy molekulatömegű nehézfémsókkal „megfestjük”. Az erősen elektronszóró nehézfémionok a hátteret alkotó hártyához kötődnek aspecifikusan, azokat a virionok nem adszorbeálják. Így az elektronmikroszkóp képernyőjén a virionok a sötét háttérből világosan rajzolódnak ki (mivel önmagukban nem elég elektronszóróak). A módszer neve is innen származik, ugyanis az így előállított kép hasonlít egy fénykép negatívjára (Hitchborn és Hills, 1965).

A festés menete

A vizsgálathoz legjobb olyan 400 mesh mintahordozó fémrácsot (gridet) használni, amelyet előzőleg szénréteggel vagy műanyag hártyával (Formvar) vonunk be, és ezt követően szenezünk. A víruspreparátum és a nehézfémsó-oldat egyesítése és feljuttatása a rácsra kétféle módon történhet: 1. a preparátumot felcseppentjük a gridre, és a hártyához kötődés után adjuk hozzá a festéket; 2. a mintát a festékkel már a rácsra történő felvitel előtt egyenlő arányban összekeverjük. Ha a minta és a festékoldat a rácson van, a felesleg eltávolítása után hagyjuk rászáradni. A virionok egyenletesebb eloszlása érdekében a minta felvihető spray vagy sűrített levegővel működő szórópisztoly segítségével, apró cseppek formájában is. Ennek a módszernek az az előnye, hogy mennyiségi meghatározásra is alkalmas lehet. A virionok ugyanis többnyire a cseppek szélén gyűlnek össze, és a cseppek elég kicsik ahhoz, hogy a teljes kerületük áttekinthető legyen.

A festéshez használt oldatok

  1. Nátrium- vagy kálium-foszfo-volframát 2%-os vizes oldata, melynek kémhatását pH 7,0-re állítjuk be Na-, illetve KOH-dal. Bizonyos vírusok szerkezetét károsítja ez az oldat [pl. a Cucumo, a Gemini, Ilarvirus nemzetség tagjait: lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus)]. Feltehetően a kapszidot stabilizáló nukleinsav-fehérje között létrejött kölcsönhatások lazításával vagy felbontásával, illetve a Tospovirus nemzetség és Rhabdoviridae család tagjainál a külső burok sérülésével, ezért ilyen esetben a víruspreparátumot tartalmazó gridet a festés előtt szobahőmérsékleten, öt percig, 1%-os glutáraldehid-oldattal kell kezelni.

  2. Uranil-acetát 2,0 vagy 0,1%-os vizes oldata, a pH-t nem állítjuk be. (Az uranil-acetát gyengén radioaktív, kezelése fokozott elővigyázatosságot igényel. Fényérzékenysége miatt sötét üvegben tárolandó.) A volframáthoz képest kontrasztosabb, részletgazdagabb kép nyerhető a finomszerkezet jobb megtartásának köszönhetően, azonban 5,5 pH-érték felett kicsapódik. Gondot okozhat, ha a növényi nedv vagy a foszfát-ionok koncentrációja nem megfelelő. A kristályképződés elkerülése érdekében ügyelni kell arra, hogy a mintát hordozó rácson ne legyen semmiféle szennyeződés.

  3. Uranil-formiát vizes oldata az uranil-acetátnál leírt hígításban; elsősorban helikális szerkezetű vírusok negatív festésére használják.

  4. Ammónium-molibdát 2%-os vizes oldata, a közeg pH-ját 4–9 közé kell beállítani ammóniával vagy sósavval. Bár a kontraszt szegényes, előnye, hogy az oldat közvetlenül összekeverhető a víruskészítménnyel, és a labilis vírusok szerkezetét is jól megtartja.

A felsoroltakon kívül még számtalan nehézfémsó választható vírusok negatív festésére; a fentiekben a teljesség igénye nélkül a legelterjedtebb, legszélesebb körben használt anyagokat soroltuk fel.

Általános tudnivalók

Mint minden in vitro vizsgálati módszer alkalmazása esetén, így az elektronmikroszkópos munka során is keletkezhetnek műtermékek, ezért külön figyelmet kell fordítanunk ezek kiküszöbölésére, vagy ha nem lehetséges, számolnunk kell velük az eredmények értékelésekor. Például a közeg összetételétől és fizikai-kémiai tulajdonságaitól függően változik a pálcika alakú vírusok virionjainak hossza, mint ahogyan ez a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) esetében jól ismert. Zavaró lehet, ha szennyezés kerül a gridre; ilyenkor vízzel vagy semleges 0,01–0,05 M-os foszfát-pufferral mossuk le a nemkívánatos anyagokat (a mosást 0,1 M CaCl2 oldattal is végezhetjük, akár a festés előtt). Uranil-acetát használatakor előfordul, hogy a nehézfémsó nem a hártyához kötődik, nem jön létre elektronszóró háttérréteg. Ez olyan, mintha pozitív képet kapnánk, és ezért a virionok átmérője is kisebb, közel fele a normális módon kapott értéknek. Ilyenkor a hártyázott rács elektrosztatikus feltöltődését kell megszüntetnünk (például nagyfeszültségű kisülést hozunk létre levegőn, 0,1 torr nyomáson). Ha másképp nem sikerül, akkor 0,01–0,1% marha- (bovin-) szérumalbumin hozzáadásával a festéket rögzíteni tudjuk a hártyához. Gyakran találkozunk olyan növényi mintával, amelyben kevert fertőzés van, tehát a mintánk két, három, vagy akár több vírus virionjait is tartalmazza.

A virionok között versengés lép fel a tartóhártya szabad kötőhelyeiért, és mivel a vírus szerkezetétől, fizikai-kémiai sajátságaitól függően a kialakuló kötőerők nem azonos erősségűek, nem feltétlenül a koncentrációjuknak megfelelő eloszlás alakul ki a rácson; sőt, el is veszíthetjük egy részüket úgy, hogy végül csak egyetlen vírus marad a preparátumon. Ha olyan vírussal akarunk dolgozni, melynek negatív festésére vonatkozóan nincs saját tapasztalatunk, sem irodalmi adatok nem állnak rendelkezésünkre, akkor problémát okozhat a megfelelő nehézfémsó-oldat megválasztása. Különböző festékek és eljárások kipróbálásával, az oldatok pH-jának vagy koncentrációjának megváltoztatásával találhatjuk meg az adott vírus esetében legmegfelelőbb vagy az elfogadható módszert.

Brandes-féle „levél-bemártásos” (leaf-dip) módszer

Ezt az eljárást a vírus(ok) gyors kimutatására dolgozták ki, mert közvetlenül az élő növényből, mindennemű tisztítási folyamat nélkül, igen egyszerűen megállapítható, hogy milyen típusú virionok vannak a gazdaszervezet sejtjeiben (Brandes, 1964; Ball, 1971; Schmidt, 1980b). A frissen elvágott levelet vagy epidermisznyúzatot keresztülhúzzuk egy tárgylemezre cseppentett vízcseppen, így a sérült sejtek tartalma részben a csepp belsejébe, részben annak felületére kerül. Egy hártyázott rácsot a víz felületébe érintünk, hogy a sejtnedv rátapadjon, majd negatív festést alkalmazunk. A minta felvételét úgy is végezhetjük, hogy a levél metszett felszínét közvetlenül a griden lévő festékcseppen húzzuk keresztül, majd szárítjuk.

A vírusok méretének meghatározása

Szférikus (izometrikus) vírusok átlagos átmérőjének számítása általában nem okoz gondot, az átlagtól való eltérések nem jelentősek. Hitchborn és Hills (1965) például a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus) átmérőjének átlagértékét 27,0 nm-nek állapította meg úgy, hogy a negatívan festett mintában 50 viriont vizsgáltak 400 000 szeres nagyítás mellett.

A pálcika és a fonál alakú vírusok hosszúságában ezzel szemben nagy különbségek lehetnek, bár a virionok többségének mérete szűk határok közé esik. Azt az átlagértéket, amely ebben az intervallumban található, Bode és Köhler (1952) elnevezte a vírus normál hosszának. Később a normál hossz meghatározását módosították (Brandes és Wetter, 1959; Brandes, 1964; Schmidt, 1980b), és javasolták a fő maximum átlagát. A mérések eredményét hisztogramokon lehet ábrázolni: a vízszintes tengelyen a virionok hosszát veszik fel (nm-ben), a függőleges tengelyen a megfelelő hosszhoz tartozó virionok számát, vagyis az eloszlási gyakoriságot (53. ábra). Gibbs et al. (1963) úgy pontosították a számításokat, hogy az egyes hosszúságkategóriákat megjelenítő oszlopokat a két szomszédos oszloppal összegezték (folyamatos összegzés, „running sums of three groups”). Így az egymás mellett lévő oszlopok magasságában (vagyis az egyes csoportokba tartozó virionok számában) kapott nagy eltérésekben rejlő hiba lehetőségét csökkenteni tudták. A mérést, illetve számolást végezhetjük a mintáról készült fényképen, vonalzót használva. A negatívokon szereplő nagyításértékeket pontosan kell kalibrálni, a mikroszkóp nagyítását időről időre ellenőrizni kell.

53. ábra - BSMV: árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus) és LRSV: Lychnis gyűrűsfoltosság vírus (Lychnis ringspot hordeivirus) részecske-hosszúság eloszlása. A sötét oszlopok a mért virionok eloszlását mutatják, míg a vonaldiagram a három csoport folyamatos összegezésével kapott eredményt ábrázolja. ⇓: normál hosszúság; ↓: látszólagos hosszúság [Gibbs et al., 1963 után]

BSMV: árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus) és LRSV: Lychnis gyűrűsfoltosság vírus (Lychnis ringspot hordeivirus) részecske-hosszúság eloszlása. A sötét oszlopok a mért virionok eloszlását mutatják, míg a vonaldiagram a három csoport folyamatos összegezésével kapott eredményt ábrázolja. ⇓: normál hosszúság; ↓: látszólagos hosszúság [Gibbs et al., 1963 után]


A virionok hosszúságát (a hajlékony, fonál alakú vírusokat kivéve) a negatívokon is meg lehet mérni sztereomikroszkóp segítségével, átvilágító fénnyel, 0,6 vagy 1,0 × objektívvel. Az okulárlencsébe épített mikrométerskálát szintén kalibrálni kell. A mérést addig folytatjuk, amíg legalább 100 viriont találunk, amelyek hosszúsága a főmaximumsávba esik.